1. TEMA-22. ASPECTOS CLÍNICOS DE LA ENZIMOLOGÍA
1. Determinación de actividades enzimáticas para
el diagnostico clínico
Mejor conocimiento molecular metabolismo
Desarrollo de métodos de análisis enzimáticas
2. Herramientas analíticas
Purificación de enzimas
3. Terapia enzimática
Industria Biotecnológica
8. Inhibidores enzimáticos (Fármacos)
Conocimiento estructural y funcional
2. 1. Determinación de actividades enzimáticas para el
diagnostico clínico
a) La enzima debe estar presente en fluido biológico
b) La enzima debe ser fácil de ensayar y automatizar la medida
c) Los valores de actividad entre individuos sanos y enfermos
deben ser significativos y debe haber buena correlación con los
valores patológicos.
d) La enzima debe ser estable
Tipos de fluidos: Suero (Más común) y Orina
LCF, Pleura, Sinovial, etc
3. SUERO
1. Enzimas específicas
Enzimas su función radica en el plasma
Ej Enzimas de la coagulación, activación del complemento, metabolismo de lipoproteínas, etc
2. Enzimas no específicas
Enzimas que son secretadas por los tejidos.
Ej. Amilasas, lipasas, fosfatasas, etc.
Enzimas intracelulares.
Daño Tisular
Creatin quinasa 50.000 veces daño en el musculo.
Proliferación Celular (Neoplasia)
Aclaramiento renal deficiente
5. ENZIMOLOGIA CLÍNICA DEL INFARTO DE MIOCARDIO
Pruebas enzimáticas : Evidencia de la producción de un infarto
Seguimiento del progreso y la recuperación tras cirugía
Creatina Quinasa
Aspartato aminotransferasa
Lactato deshidrogenasa
Concentración en tejido
Valor en plasma Velocidad del vertido
Grado de degradación
Vida media 10 –130 horas
Test depende del tiempo del infarto
Creatina Quinasa mas específica
LDH se puede diferenciar por electroforesis
6. Creatina quinasa
Músculo esquelético
Músculo cardiaco (Mayor concentración)
Cerebro
No en el hígado
Proteína dimérica: Hay dos tipos de monómeros M y B
Músculo M-M (99%) y M-B (1%)
Corazón MM (80-70%) y M-B (20-30%)
Cerebro B-B (100%)
Pequeño Infarto M-B (Actividad Total apenas cambia) Inmunoblotting (B)
7. Lactato deshidrogenasa
Hígado, Corazón
Inmunoblotting LDH-1
Uso de sustratos específicos LDH1/LDH2 = 0.85 Normal
>1 Enfermo
Transaminasas (ALT y AST)
Se utilizan poco actualmente
Hígado AST/ALT (3-5)
Corazón AST/ALT (20-25)
9. USO DE LAS PRUEBAS ENZIMOLÓGICAS
-Diagnóstico de enfermedades
-Seguimiento de tratamientos con fármacos (Higado metaboliza drogas)
-Seguimiento de operaciones hepáticas
TRANSAMINASAS
No específicas del plasma
Células parenquimales Necroticas (Hepatitis, cirrosis) Vertido al plasma
Hepatitis, cirrosis Progreso de la enfermedad
FOSFATASA ALCALINA
No específicas del plasma
Superficie sinusoidal del células hepáticas y del conducto biliar, Osteoblastos
ISOENZIMAS
Daños en las células del conducto biliar
Ratio Fosf.Alc/Transaminasas
Hepatitis 0,2-0,6
Obstrucción del 10-20
conducto biliar
10. γ-GLUTAMIL TRANSFERASA
Alcoholismo crónico Cirrosis
Incremento síntesis y en la secreción
GLUTATION TRANSFERASA
Carcinogénicos
Cataliza reacciones de destoxificación Agentes de quimioterapia
utilizando glutation Paracetamol
Xenobióticos
Contenido alto 5%
Vida media corta 90 min
Marcador muy rápido y sensible de daño hepático
Tiempo de la Protrombina
Función hepática
Tiempo requerido para la activación de la protrombina en Trombina
Indica grado de funcionamiento hepático
Factores de la coagulación están producidos en el hígado y secretados a la
sangre
Trombina Cataliza el proceso de coagulación
11. OTRAS ENZIMAS DE INTERES CLÍNICO
α-AMILASA
Páncreas
Glándulas salivares
Suero normal Baja actividad
Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Diagnóstico es complicado sin la medida de la amilasa
Suero enfermo Pancreatitis aguda Gran Aumento (20-30)
Amilasa detección en orina debido a bajo Peso Molecular
CREATINA QUINASA y FRUCTOSA BIFOSFATO ALDOLASA
Indicadores de desordenes en la musculatura esquelética
Creatina quinasa Músculo esquelético, cardiaco, Cerebro
Distrofia muscular, Daños en el músculo, ejercicio intenso,
infarto de miocardio, daño cerebral, etc
ISOENZIMAS
Fructosa bifosfato aldolasa Músculo esquelético (otros tejidos)
Significado clínico menor
Precaución (contaminación Glb rojos)
12. FOSFATASA ALCALINA
Diagnóstico de obstrucción del conducto biliar
Enfermedades de huesos
Incremento actividad en células formadoras de huesos (Osteoblastos)
Osteomalacia
Raquitismo
Hiperparatiroidismo
Enfermedad denominada hipofosfatasia Actividad
Pirofosfatos inorgánico (substrato) Crecimiento cristales de hidroxiapatito
No estrictamente Isoenzimas Osteoblastos, Hígado, Intestino,
Placenta
Modificaciones Postraduccionales
Diferenciación Electroforesis muy complicado
Uso de inhibidores, Calor
FOSFATASA ACIDA
Localización Hígado, eritrocitos, PROSTATA, etc
Diagnostico de carcinoma de Próstata
Precaución en el muestreo - Lábil
- Contaminación con FA de eritrocitos
Diferenciación isoformas - Sensibilidad sustratos
- Uso de inhibidores específicos: Formaldehido
13. 2. HERRAMIENTAS ANALÍTICAS:
USO DE ENZIMAS PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN
DE METABOLITOS
Uso de la enzima para transformar un metabolito en un producto
el cual se pude determinar analíticamente
Ventajas
La enzima es muy específica Metabolito determinado en presencia de
otras sustancias
Evita la purificación necesaria en un análisis químico
Sustancias lábiles
Inconvenientes
El costo de la enzimas Inmovilización
Ureasa, Tripsina, Hexoquinasa
Inmoviliza en las paredes del tubo Análisis en continuo
Inactivación de las enzimas. Presencia de inhibidores, etc
14. Puntos importantes para utilizar una enzima
1. La posición del equilibrio de la reacción. Deber ser unidirecional y rápido
Equilibrio no favorable
a) Acoplando la reacción a otra reacción enzimática
b) Trampas químicas. Ej. Glutamato deshidrogenasa
2. Utilizar gran cantidad de enzima
Depende de la Vmax y de la Km.
3. La especificidad de la enzima debe ser conocida
4. Pureza enzimática (reacciones colaterales)
15. Determinación de glucosa
Test tolerancia a la glucosa Metabolismo de la glucosa
Métodos enzimáticos
1. Hexoquinasa acoplada con Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
NADPH Cambio 340 nm
Especificidad segundo paso
2. Glucosa oxidasa acoplada con Peroxidasa
Visible (Más utilizado)
Más interferencias productos
sangre
3. Glucosa deshidrogenasa
Determinación de ácido úrico
Diagnóstico de la gota
Método químico y enzimático Falta
Actualmente sólo se utiliza el especificidad
enzimático
Absorbancia (293 nm)
Alantoina; Consumo de O2
Acoplado a peroxidasa
(H2O2)
16. Determinación de urea
Test de la función renal: Suero y orina Capacidad de filtración glomerular
Ureasa
UREA Carbonato amónico.
NH4 Acoplado con glutamato DH NADH
Determinación de colesterol y trigliceridos
Colesterol
Evaluar el riesgo de arterioesclerosis y de infarto de miocardio
Método químico (colorimétrico) No específico, contaminante
Esteresa
Colesterol
oxidasa
Peroxidasa
Absorción a 500 nm
Trigliceridos
Seguimiento: Diabetes
Mellitus, Nefrosis,
obstrucción biliar, etc
17. Otros metabolitos
Creatina
Creatina quinasa, Piruvato quinasa y Lactato deshidrogenasa
Amonio Glutamato deshidrogenasa
Tiamina difosfato en eritrocitos
Ensayo enzimático usado para detectar una deficiencia en vitaminas
Ensayo diagnostica deficiencia en vitaminas
Malnutrición
Encefalopatía de Wernicke´s
Transquetolasa
Sujetos normales: Actividad no cambia al añadir Tiamina
Enfermos : Actividad al añadir Tiamina
18. ENZIMA INMUNOENSAYO
Método indirecto para determinación de metabolitos, enzimas usadas para amplificar la señal
Hormonas, drogas,proteínas, etc Identifican con un anticuerpo.
Anticuerpos son unidos a una enzima: Fácilmente cuantificables
Peroxidasas
Fosfatasas. etc
Virus, cocaína, anfetaminas opiáceos, anfígenos frente a microorganismos patógenos, etc,
19. 3. Terapia enzimática
Principales áreas de trabajo - Eliminación de sustancias tóxicas de la sangre
- Enfermedades genéticas
- Cáncer
Degradación de tejidos necróticos usando enzimas proteolíticas (Tripsina, quimiotripsina,
Bromelaina, Hialuronidasa).
Eliminación de coágulos usando Estreptoquinasa, Uroquinasa, etc.
Tratamiento de insuficiencia pancreática (Fibrosis cística) utilizando proteasas inmovilizadas
Forma de administración
Eliminación de metabolitos (sangre)
Endógena: Estreptoquinasa
Exógena: Ureasa
Bilirrubina oxidasa
Posibilidad de usar enzimas inmovilizadas
20. Tratamiento de Enfermedades genéticas
Enfermedades metabólicas. Deficiencias enzimáticas
Enfermedad de Gauchers Glucosilceramidasa
Acumula un glucocerebrosido en los macrófagos
Macrofagos no funcionales Anormalidades hepáticas, óseas, y hematológicas.
Tratamiento enzima de placentas humanas Alto coste Enzimas recombinantes
Pancreatitis
Extros pancreáticos (lipasas, proteasas, amilasas, etc) Microencapsulados pH 6 liberan
Fibrosis cística
Defecto genético proteína transmembrana (1/2000).
Mucosidad espesa , pulmones, estómago, etc
Conducto pancreáticos bloqueado Igual que pancreatitis
Tubos bronquiales Desosiribonucleasa (Mucosidad ADN y mucopolisacaridos).
Xeroderma pigmentoso
Defecto genético Individuos muy sensibles a la radiación UV
Defecto mecanismo reparador del ADN
Tratamiento enzimas reparadoras del ADN Aplicación tópica con liposomas
21. Cáncer
Asparraginasa hidroliza la asparragina Leucemia aguda limfoblástica
Leucemia aguda granulocítica
Tumores Necesitan asparragina
Enzima en plantas, animales y bacterias
Ausente del suero de los mamiferos
Tratamiento en combinación con quimioterapia
Fuente es humana, microbiológica genera problemas de rechazo.
Glutaminasa Experimentación
Serina hidratasa posibles agentes
Fenilalanino amonio liasa
anticancerígenos
Leucina dehidrogenasa
Ciertos tipos de cáncer no tienen la capacidad de
sintetizar aminoácidos y los obtienen del suero
22. Activación de prodrogas
Prodrogas son drogas químicamente modificadas y permanecen inactivas hasta
que son específicamente activadas.
Drogas anticancerosas inhiben etapas específicas de vías metabólicas
Metrotrexato análogo estructural del ácido fólico dihidrofolato reductasa
No se produce tetrahidrofolato Síntesis ADN
EVITAR TOXICIDAD EN CELULAS NO CANCEROSAS
Terapia enzimática prodroga dirigida por anticuerpos ADEPT
Terapia enzimática prodroga genética dirigida GDEPT
La enzima usada para activar la prodroga es dirigida hacia el tumor
en la forma de un gen unido a un vector
23. 4. DETECCIÓN Y SIGNIFICADO DE DEFICIENCIAS ENZIMÁTICAS
Deficiencias enzimáticas debido a problemas genéticos
Más de 400 deficiencias
Identificación de un metabolito
Ej. Fenilcetonuria Fenilpiruvato
Biopsia del tejido y medida de la actividad
Pruebas en el ADN
24. FENILCETONURIA
Déficit de la Fenilalanina 4-mono-oxigenasa
Retraso mental Prevención dieta
Detección precoz es muy importante
25. INHIBIDORES ENZIMÁTICOS (FÁRMACOS)
Inhibición de la hidroximetilglutaril CoA reductasa
Hipercolesterolemia familiar Niveles de colesterol en sangre
Inhibición de la xantina oxidasa
Gota Niveles de ácido úrico Metabolismo de las Purinas
Xantina Ácido úrico
Alopurinol Aloxantina SUSTRATO SUICIDA
Inhibidor muy fuerte de la X. Oxidasa
26. Inhibidores antiretrovirales
Enfermedad: HIV-1 causante del SIDA.
Enzima proteasa cataliza la ruptura de la
nhibidores de la proteasa.
poliproteína que encápsula el virus.
Necesarios para completar su proceso
de replicación dando lugar a nuevos
virus
Dimero de 99 aminoacidos
27. Hidrólisis ácido-base: Aspartico proteasa
Centro activo en el centro
de la molécula
Inhibidores análogos del
substrato Cambio en el enlace
peptídico por un isoester
28. Conclusiones
Medida de actividades enzimática en diagnóstico clínico
Enzimas estimación de metabolitos
Equipamiento más sofisticado gran automatización
Variedad de enzimas puras: Tecnología de ADN
Procesos tecnológicos:
Inmovilización, Radioinmunoensayo, Inmunoensayo, etc
Terapia enzimática Tecnología de ADN
Estudios estructurales Diseño de inhibidores
