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Dynamique interne du noyau d’une cellule
vivante : étude par diffusion dynamique de
la lumière
Michaël Suissa
Sous la direction de :
M. Eric Freyssingeas
Laboratoire de Physique
et
M. Christophe Place
Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie
MODIFICATION DE L’ORGANISATION SPATIALE
ET TEMPORELLE DU NOYAU
=
MODIFICATION DE L’ETAT CELLULAIRE
Dynamique interne du noyau d’une cellule
vivante.
CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des
organismes vivants.
2 types de cellules:
Procaryotes : sans noyau (bactéries,…)
Eucaryotes : disposant d’un noyau (hommes, animaux, plantes,…)
Noyau : délimité par la
membrane nucléaire
Noyau contient ADN, support information génétique.
Découverte récente : grande organisation structurelle et
dynamique
Microscopies -> vision globale de la structure,
 développer une technique -> approche globale de la dynamique
interne du noyau
Dynamique interne du noyau d’une cellule
vivante.
• Projet : étudier la dynamique du noyau d’une cellule vivante
par : Diffusion Dynamique de la Lumière.
• Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur l’ensemble
des propriétés dynamiques internes
Plan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
Contient ADN sous forme compactée : la chromatine
Molécule d’ADN
+ protéines (histones, …)
CHROMATINE
Unité de base : nucléosome
1) Le noyau
I> Introduction
Territoires chromosomiques
1) Le noyau
Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires
chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990)
Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau
d’un fibroblaste (Bolzer et al., 2005)
I> Introduction
Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique
(Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à l’expression des gènes
et à la réplication de l’ADN
Espace interchromosomique
•Corps nucléaires
•Protéines
•Polymérases
•ARN
•Nucléotides
Territoires chromosomiques
Chromatine
I> Introduction
1) Le noyau
Pores nucléaire
Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. (Belmont,
2001)
Dans territoires chromosomiques :
•Mouvement de la chromatine à l’intérieur du territoire chromosomique.
(Belmont et al., 2001, 2003).
•Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et
condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les
réparations de l’ADN.
Dans espace interchromosomique :
• Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à
l’intérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » :
10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004).
• Réactions biochimiques.
I> Introduction
2) Dynamique du noyau
I> Introduction
2) Dynamique du noyau
BIOLOGIE PHYSIQUE
Chromatine Polymère
Protéines Particules colloïdales
Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité
biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques
consommant de l’énergie et produisant de la chaleur (en particulier,
synthèse de l’ARN : transcription, et de l’ADN : réplication).
Technique physique adaptée pour analyse dynamique
polymères, particules colloïdales :
DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE
Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de l’indice
de réfraction n du milieu traversé par la lumière.
 i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du
milieu.
I> Introduction
3) Diffusion dynamique de la lumière
POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la
chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions
biochimiques.
DDL :
Analyse des variations temporelles de l’intensité de la lumière
diffusée par le noyau au cours d’un processus particulier : le
cycle cellulaire
Information globale sur la dynamique du
noyau
Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau :
• Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets »
fluorescents.
• Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule,
contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la
longueur d’onde et de la puissance.
• Temps caractéristiques accessibles de 10-5 s à 10 s et, échelle de l’ordre
de quelques 500 nm.
I> Introduction
4) DDL par le noyau d’une cellule vivante
DDL
Cycle cellulaire, 4 phases
différentes : G1, S, G2 et M.
I> Introduction
4) DDL par le noyau d’une cellule vivante
Phénomène fondamental : le cycle cellulaire
Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ?
Assemble le fuseau
mitotique, prépare
la cellule à la mitose
Termine la division
cellulaire
Déclenche l’anaphase et
conduit à la cytodiérèse
Déclenche la machinerie de
réplication de l’ADN;
Réplique l’ADN
Plan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
II> Montage expérimental et protocoles
1) Principe du montage expérimental
Cellules immobiles car adhérentes
2 types de contraintes expérimentales à satisfaire :
• Contrainte « physiologique » :
Environnement physiologique des cellules doit permettre
développement normal des cellules pendant les expériences (de
quelques heures à quelques jours).
• Contraintes « optiques » :
a)Viser le noyau d’une cellule
b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau d’une cellule
(5 m ≤ diamètre noyau ≤ 10 m).
c) Faire l’image du volume illuminé par le laser sur un détecteur.
II> Montage expérimental et protocoles
1) Principe du montage expérimental
Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le
pH).
1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ;
adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures
2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau »
thermostaté.
II> Montage expérimental et protocoles
2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de
culture
A t=0, confluence = 1/3
Objectif x10
Excellente survie
et prolifération
des cellules
II> Montage expérimental et protocoles
2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
20 µm
II> Montage expérimental et protocoles
3) Contraintes « optiques »
• Diamètre noyau 6-7 µm
focalisation faisceau laser
avec objectif microscope.
• Recueillir lumière diffusée
selon plusieurs angles :
-> Montage à l’horizontal,
-> Diffusion de la lumière « vers
l’avant ».
Noyau
Laser
II> Montage expérimental et protocoles
3) Contraintes « optiques »
Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mW
Angle de diffusion variable
Dans la cellule.
I(noyau) = 20-200 u. a
I(cyto.) = 5-20 u. a
Dans le milieu.
I = 1-2 u. a.
II> Montage expérimental et protocoles
4) Validation du montage
Mesures sur différents systèmes :
1) Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à
1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne.
2) Fonctions d’auto-corrélation mesurées pour différentes positions de
focalisation du laser
SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux.
SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et
régulier (durée = 15 heures), …
Aussi culture simple, « robustes ».
Pour notre étude : cellules neuroblastomes
de la lignée SHEP
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Population « normale » de SHEP :
Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour
connaître la phase du cycle des cellules à l’instant de la
mesure.
• Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU.
(HU : Hydroxyurée  Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule d’entrer
en phase S)
• Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU.
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
60 % G0/1
15 % S
25 % G2+M
Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie
en flux
MAIS
Cytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur
CO2
 Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans
CO2
Etude par
expériences de
cytométrie en flux
En parallèle
Observations visuelles
d’échantillons placés
dans le montage
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle
cellulaire par cytométrie en flux
• Un intercalant fluorescent de
l’ADN est ajouté à une suspension
« cellulaire ».
• Les cellules sont irradiées par un
laser qui excite le colorant.
• L’intensité de fluorescence émise
par le noyau est mesurée.
La cytométrie en flux permet de
déterminer la « quantité » d’ADN
présente dans la cellule
II> Montage expérimental et protocoles
5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
Pic G0/1
Pic G2+M
Phase S
Intensité fluorescence
Contenu en ADN
Nombre
de
cellules
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montage
Elimination HU
Non éliminé
48 heures
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montage
Elimination HU
Non éliminé
48 heures
Eliminé après
10 heures (t0)
80% des cellules
entrent en mitose
à t0+17 heures
Pas de mitose
Par cytométrie en flux Dans le montage
Elimination HU
Non éliminé
48 heures
Eliminé après
15 heures (t0)
80% des cellules
entrent en mitose
entre t0+9 et
t0+10 heures
HU éliminé après 10 heures HU éliminé après 15 heures
Mesures
S
Mesures
G2
Mesures
M
Mesures
G0/1
Plan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
• Signal non stationnaire :
•Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes)
•Variations brutales d’intensité (toutes les 7-8 s)
•Fluctuations
III> Résultats
Dynamique complexe : plusieurs
temps caractéristiques, de
quelques ms à plusieurs dizaines
de secondes
Fonction d’auto-corrélation
mesurée à  = 21°.
III> Résultats
Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée
d’elle même en temps. <I(0)I(t)>
Fonction d’auto-corrélation
mesurée à  = 21°.
III> Résultats
2 temps caractéristiques  Ajustement par fonction :
(A1.exp(-(t/1)) + A2.exp(-t/2))2 + B.
(<N>)
Premières observations :
• Variations importantes de <N>.
• A2 > A1 ; A1 de 5 à 25 % de l’amplitude du signal
dynamique.
• Pas de corrélation entre <N> et 1, ou 2.
• Pas de corrélation entre A1 et 1, ni entre A2 et 2.
• Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation
indépendants.
• 0,4 ≤  ≤ 1 ; pas de corrélation entre  et 1.
III> Résultats
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
Phase CC
(nb mes/nb
de noyaux)
Echelle
Valeurs
[10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)
15-70
20; 40;
(55)
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC
(nb mes/nb
de noyaux)
Echelle
Valeurs
[10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)
15-70
20; 40;
(55)
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC
(nb mes/nb
de noyaux)
Echelle
Valeurs
[10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)
15-70
20; 40;
(55)
S
(252/44)
5-40
20;
(15);
(35-40)
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC
(nb mes/nb
de noyaux)
Echelle
Valeurs
[10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)
15-70
20; 40;
(55)
S
(252/44)
5-40
20; (15);
(35-40)
G2
(138/18)
5-30 10; 25
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
Phase CC
(nb mes/nb
de noyaux)
Echelle
Valeurs
[10-3 s]
Pics
[10-3 s]
G0/1
(182/24)
15-70
20; 40;
(55)
S
(252/34)
5-40
20; (15);
(35-40)
G2
(138/18)
5-30 10; 25
M
(42/6)
5-30 10
III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
• Dynamique complexe :
• Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à
différents processus biologiques.
• 1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire.
• Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 <  < 1)
=> Distribution large de temps caractéristiques
Explication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de
processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie
possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991).
=> Distribution log-normale des temps de relaxation
1 et  liés à la moyenne et à l’écart type de la distribution
A l’heure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et
un, ou plusieurs, processus biologiques
III> Résultats : temps 1
Phase CC
Echelle
Valeurs
[s]
Pics
[s]
G0/1 0,2-2 0,5
S 0,2-1,2 0,45
G2 0,5-2 0,75; (1,5-2)
M 0,3-1 0,75
III> Résultats : temps 2
Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne
de base
Néanmoins :
• Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale.
• Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins
prononcées que pour 1.
Origines possibles de ce temps de relaxation :
• Diffusion de complexes ARN-Protéines :
10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004).
 temps de relaxation, 1/Dq2 (avec q vecteur d’onde ; dépend de l’angle de
diffusion). Ici : q2 ≈ 2,21.1013 m-2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec.
• Mouvement de la chromatine à l’intérieur des territoires chromosomiques
(Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde.
III> Résultats : temps 2
Plan
I> INTRODUCTION
II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES
III> RESULTATS
IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
1) Conclusions DDL
V> Conclusions et perspectives
Mise au point d’un montage expérimental original et protocoles
Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de
quelques ms à plusieurs dizaines de secondes
Analyse par autocorrélation
2 temps caractéristiques indépendants
Temps rapide :
• quelques dizaines de
millisecondes,
• distribution très différente selon
phase du cycle cellulaire,
• signature de relaxations
s’effectuant par un ensemble de
processus hiérarchisés
Temps lent :
• de l’ordre de la seconde
• distributions changent légèrement
au cours du cycle cellulaire
• gamme de temps compatible avec
résultats sur diffusion de complexes
ARN-protéines dans le noyau.
• Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée.
• Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des
processus biologiques.
Utilisation d’agents pharmacologiques pour bloquer des
processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamique
Coupler les mesures de diffusion avec des mesures de
fluorescence
 Lien entre dynamique et activité biochimique.
• Mesurer la dynamique sur d’autres systèmes :
apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à l’intérieur du
cytoplasme.
3) Perspectives DDL
V> Conclusions et perspectives
Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose
après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent
également en apoptose
V> Conclusions et perspectives
V> Conclusions et perspectives
Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.
Contact ou diffusion ?
 Séparation des cellules grâce à des motifs carrés
50 µm
250 µm
Objectif x10 Objectif x40
V> Conclusions et perspectives
REMERCIEMENTS
Equipe E. Goillot : support pour partie bio
M. B. Berge : idée originale
M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal
M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal
Mme M. Barbi : démarrage de l’expérience
Evolution de la distribution
des temps caractéristiques 1
en fonction de l’angle de diffusion
Evolution de la distribution
des temps caractéristiques 2
en fonction de l’angle de diffusion
Evolution de la distribution
du coefficient d’étirement 
au cours du cycle cellulaire
Evolution de la distribution
de <N> au cours du cycle cellulaire
Fonction d’autocorrélation de l’intensité de la
lumière diffusée par le cytoplasme d’une
cellule en phase G1 (ajustement par cumulants)
1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s

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  • 1. Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas Laboratoire de Physique et M. Christophe Place Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie
  • 2. MODIFICATION DE L’ORGANISATION SPATIALE ET TEMPORELLE DU NOYAU = MODIFICATION DE L’ETAT CELLULAIRE Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante. CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des organismes vivants. 2 types de cellules: Procaryotes : sans noyau (bactéries,…) Eucaryotes : disposant d’un noyau (hommes, animaux, plantes,…) Noyau : délimité par la membrane nucléaire Noyau contient ADN, support information génétique. Découverte récente : grande organisation structurelle et dynamique
  • 3. Microscopies -> vision globale de la structure,  développer une technique -> approche globale de la dynamique interne du noyau Dynamique interne du noyau d’une cellule vivante. • Projet : étudier la dynamique du noyau d’une cellule vivante par : Diffusion Dynamique de la Lumière. • Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur l’ensemble des propriétés dynamiques internes
  • 4. Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
  • 5. Contient ADN sous forme compactée : la chromatine Molécule d’ADN + protéines (histones, …) CHROMATINE Unité de base : nucléosome 1) Le noyau I> Introduction
  • 6. Territoires chromosomiques 1) Le noyau Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990) Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau d’un fibroblaste (Bolzer et al., 2005) I> Introduction
  • 7. Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique (Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à l’expression des gènes et à la réplication de l’ADN Espace interchromosomique •Corps nucléaires •Protéines •Polymérases •ARN •Nucléotides Territoires chromosomiques Chromatine I> Introduction 1) Le noyau Pores nucléaire
  • 8. Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. (Belmont, 2001) Dans territoires chromosomiques : •Mouvement de la chromatine à l’intérieur du territoire chromosomique. (Belmont et al., 2001, 2003). •Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les réparations de l’ADN. Dans espace interchromosomique : • Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à l’intérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » : 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 ; (Shav-Tal et al., 2004). • Réactions biochimiques. I> Introduction 2) Dynamique du noyau
  • 9. I> Introduction 2) Dynamique du noyau BIOLOGIE PHYSIQUE Chromatine Polymère Protéines Particules colloïdales Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques consommant de l’énergie et produisant de la chaleur (en particulier, synthèse de l’ARN : transcription, et de l’ADN : réplication). Technique physique adaptée pour analyse dynamique polymères, particules colloïdales : DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE
  • 10. Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de l’indice de réfraction n du milieu traversé par la lumière.  i.e. de la composition, de la concentration, de l’organisation du milieu. I> Introduction 3) Diffusion dynamique de la lumière POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions biochimiques. DDL :
  • 11. Analyse des variations temporelles de l’intensité de la lumière diffusée par le noyau au cours d’un processus particulier : le cycle cellulaire Information globale sur la dynamique du noyau Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau : • Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets » fluorescents. • Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule, contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la longueur d’onde et de la puissance. • Temps caractéristiques accessibles de 10-5 s à 10 s et, échelle de l’ordre de quelques 500 nm. I> Introduction 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante DDL
  • 12. Cycle cellulaire, 4 phases différentes : G1, S, G2 et M. I> Introduction 4) DDL par le noyau d’une cellule vivante Phénomène fondamental : le cycle cellulaire Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ? Assemble le fuseau mitotique, prépare la cellule à la mitose Termine la division cellulaire Déclenche l’anaphase et conduit à la cytodiérèse Déclenche la machinerie de réplication de l’ADN; Réplique l’ADN
  • 13. Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
  • 14. II> Montage expérimental et protocoles 1) Principe du montage expérimental Cellules immobiles car adhérentes
  • 15. 2 types de contraintes expérimentales à satisfaire : • Contrainte « physiologique » : Environnement physiologique des cellules doit permettre développement normal des cellules pendant les expériences (de quelques heures à quelques jours). • Contraintes « optiques » : a)Viser le noyau d’une cellule b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau d’une cellule (5 m ≤ diamètre noyau ≤ 10 m). c) Faire l’image du volume illuminé par le laser sur un détecteur. II> Montage expérimental et protocoles 1) Principe du montage expérimental
  • 16. Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le pH). 1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ; adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures 2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau » thermostaté. II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture
  • 17. Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de culture A t=0, confluence = 1/3 Objectif x10 Excellente survie et prolifération des cellules II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture 20 µm
  • 18. II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » • Diamètre noyau 6-7 µm focalisation faisceau laser avec objectif microscope. • Recueillir lumière diffusée selon plusieurs angles : -> Montage à l’horizontal, -> Diffusion de la lumière « vers l’avant ».
  • 19. Noyau Laser II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mW Angle de diffusion variable
  • 20. Dans la cellule. I(noyau) = 20-200 u. a I(cyto.) = 5-20 u. a Dans le milieu. I = 1-2 u. a. II> Montage expérimental et protocoles 4) Validation du montage Mesures sur différents systèmes : 1) Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à 1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne. 2) Fonctions d’auto-corrélation mesurées pour différentes positions de focalisation du laser
  • 21. SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux. SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et régulier (durée = 15 heures), … Aussi culture simple, « robustes ». Pour notre étude : cellules neuroblastomes de la lignée SHEP II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
  • 22. Population « normale » de SHEP : Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour connaître la phase du cycle des cellules à l’instant de la mesure. • Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU. (HU : Hydroxyurée  Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule d’entrer en phase S) • Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU. II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes 60 % G0/1 15 % S 25 % G2+M
  • 23. Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie en flux MAIS Cytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur CO2  Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans CO2 Etude par expériences de cytométrie en flux En parallèle Observations visuelles d’échantillons placés dans le montage II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes
  • 24. Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par cytométrie en flux • Un intercalant fluorescent de l’ADN est ajouté à une suspension « cellulaire ». • Les cellules sont irradiées par un laser qui excite le colorant. • L’intensité de fluorescence émise par le noyau est mesurée. La cytométrie en flux permet de déterminer la « quantité » d’ADN présente dans la cellule II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Pic G0/1 Pic G2+M Phase S Intensité fluorescence Contenu en ADN Nombre de cellules
  • 25. Pas de mitose Par cytométrie en flux Dans le montage Elimination HU Non éliminé 48 heures
  • 26. Pas de mitose Par cytométrie en flux Dans le montage Elimination HU Non éliminé 48 heures Eliminé après 10 heures (t0) 80% des cellules entrent en mitose à t0+17 heures
  • 27. Pas de mitose Par cytométrie en flux Dans le montage Elimination HU Non éliminé 48 heures Eliminé après 15 heures (t0) 80% des cellules entrent en mitose entre t0+9 et t0+10 heures
  • 28. HU éliminé après 10 heures HU éliminé après 15 heures Mesures S Mesures G2 Mesures M Mesures G0/1
  • 29. Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
  • 30. • Signal non stationnaire : •Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes) •Variations brutales d’intensité (toutes les 7-8 s) •Fluctuations III> Résultats Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes
  • 31. Fonction d’auto-corrélation mesurée à  = 21°. III> Résultats Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée d’elle même en temps. <I(0)I(t)>
  • 32. Fonction d’auto-corrélation mesurée à  = 21°. III> Résultats 2 temps caractéristiques  Ajustement par fonction : (A1.exp(-(t/1)) + A2.exp(-t/2))2 + B. (<N>)
  • 33. Premières observations : • Variations importantes de <N>. • A2 > A1 ; A1 de 5 à 25 % de l’amplitude du signal dynamique. • Pas de corrélation entre <N> et 1, ou 2. • Pas de corrélation entre A1 et 1, ni entre A2 et 2. • Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation indépendants. • 0,4 ≤  ≤ 1 ; pas de corrélation entre  et 1. III> Résultats
  • 34. III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
  • 35. III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
  • 36. III> Résultats : temps 1 (qualitatif)
  • 37. Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
  • 38. Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
  • 39. Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/44) 5-40 20; (15); (35-40) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
  • 40. Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/44) 5-40 20; (15); (35-40) G2 (138/18) 5-30 10; 25 III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
  • 41. Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10-3 s] Pics [10-3 s] G0/1 (182/24) 15-70 20; 40; (55) S (252/34) 5-40 20; (15); (35-40) G2 (138/18) 5-30 10; 25 M (42/6) 5-30 10 III> Résultats : temps 1 (quantitatif)
  • 42. • Dynamique complexe : • Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à différents processus biologiques. • 1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire. • Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 <  < 1) => Distribution large de temps caractéristiques Explication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991). => Distribution log-normale des temps de relaxation 1 et  liés à la moyenne et à l’écart type de la distribution A l’heure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et un, ou plusieurs, processus biologiques III> Résultats : temps 1
  • 43. Phase CC Echelle Valeurs [s] Pics [s] G0/1 0,2-2 0,5 S 0,2-1,2 0,45 G2 0,5-2 0,75; (1,5-2) M 0,3-1 0,75 III> Résultats : temps 2
  • 44. Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne de base Néanmoins : • Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale. • Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins prononcées que pour 1. Origines possibles de ce temps de relaxation : • Diffusion de complexes ARN-Protéines : 10-14 m2.s-1 ≤ D ≤ 9.10-14 m2.s-1 (Shav-Tal et al., 2004).  temps de relaxation, 1/Dq2 (avec q vecteur d’onde ; dépend de l’angle de diffusion). Ici : q2 ≈ 2,21.1013 m-2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec. • Mouvement de la chromatine à l’intérieur des territoires chromosomiques (Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde. III> Résultats : temps 2
  • 45. Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES
  • 46. 1) Conclusions DDL V> Conclusions et perspectives Mise au point d’un montage expérimental original et protocoles Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes Analyse par autocorrélation 2 temps caractéristiques indépendants Temps rapide : • quelques dizaines de millisecondes, • distribution très différente selon phase du cycle cellulaire, • signature de relaxations s’effectuant par un ensemble de processus hiérarchisés Temps lent : • de l’ordre de la seconde • distributions changent légèrement au cours du cycle cellulaire • gamme de temps compatible avec résultats sur diffusion de complexes ARN-protéines dans le noyau.
  • 47. • Travailler sur le signal brut de l’intensité diffusée. • Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des processus biologiques. Utilisation d’agents pharmacologiques pour bloquer des processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamique Coupler les mesures de diffusion avec des mesures de fluorescence  Lien entre dynamique et activité biochimique. • Mesurer la dynamique sur d’autres systèmes : apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à l’intérieur du cytoplasme. 3) Perspectives DDL V> Conclusions et perspectives
  • 48. Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent également en apoptose V> Conclusions et perspectives
  • 49. V> Conclusions et perspectives Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.
  • 50. Contact ou diffusion ?  Séparation des cellules grâce à des motifs carrés 50 µm 250 µm Objectif x10 Objectif x40 V> Conclusions et perspectives
  • 51. REMERCIEMENTS Equipe E. Goillot : support pour partie bio M. B. Berge : idée originale M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal Mme M. Barbi : démarrage de l’expérience
  • 52. Evolution de la distribution des temps caractéristiques 1 en fonction de l’angle de diffusion
  • 53. Evolution de la distribution des temps caractéristiques 2 en fonction de l’angle de diffusion
  • 54. Evolution de la distribution du coefficient d’étirement  au cours du cycle cellulaire
  • 55. Evolution de la distribution de <N> au cours du cycle cellulaire
  • 56. Fonction d’autocorrélation de l’intensité de la lumière diffusée par le cytoplasme d’une cellule en phase G1 (ajustement par cumulants) 1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s