Enrico Busto, Strategic Technology Advisor fondatore di @Eticrea – “Reskillin...
Presentazione marco perone
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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO
Facoltà di Farmacia
Corso di Laurea in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
ANALISI COMPUTAZIONALE DELL’ATTIVITÀANALISI COMPUTAZIONALE DELL’ATTIVITÀ
ANTITUMORALE DI COMPOSTI INTERAGENTIANTITUMORALE DI COMPOSTI INTERAGENTI
CON MEMBRANE CELLULARICON MEMBRANE CELLULARI
Relatore:
Dott. Stefano Piotto Piotto
Candidato:
Marco Perone
Matr. 0730/200201
Anno accademico 2009/2010
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OBIETTIVI TESIOBIETTIVI TESI
Costruzione di validi modelli di membrane
cellulari mediante tecniche di molecular
modelling
Chiarire il comportamento morfologico e
termodinamico di diversi doppi strati lipidici in
presenza di fluidificanti di membrana mediante
l’ausilio della dinamica molecolare
Comprendere i meccanismi d’azione dei
fluidificanti di membrana
3. Page 3
RAFT RAFT
1)
2)
Modelli di membraneModelli di membrane
=
=
I vari microdomini hanno diverse composizioni lipidiche, proteiche e grado di fluidità
4. Page 4*L. Vigh et al, 2005. The significance of lipid composition for membrane activity: new concepts and ways of assessing function, TRENDS
in Biochemical Sciences Vol.32 No.8
Fluidità di membrana e HSPFluidità di membrana e HSP
Le HSP sono iperespresse in cellule tumorali (meccanismo di difesa)
L’aumento di fluidità è uno dei meccanismi mediante i quali le cellule percepiscono
condizioni di stress*
5. Page 5
Sono molecole capaci di interagire con i lipidi di membrana e di provocarne modifiche tali da alterare varie
funzioni cellulari.
a) Immagine modificata da Török, Z., et al., Heat shock protein coinducers with no effect on protein denaturation specifically modulate the membrane
lipid phase,. PNAS, 2003. 100: p. 3131-3136
a)
• Alcol benzilico (BA) e 2-Feniletanolo (FE)• Bimoclomol (BC)
(R,S) -(N-[2-idrossi-3-(1-piperidinil) propossi]-3
pridin-carbossimidoil-cloruro
b)
Fluidificanti di membranaFluidificanti di membrana
NIH 3T3 fibroblasti
H9c2 cardiociti di ratto
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SM o SM(18:0)
N-ottadecanoil-D-eritro-sfingosilfosforilcolina
CHOL
Colesterolo
Lipidi di base per i modelli di membraneLipidi di base per i modelli di membrane
POPE o PE(16:0/18:1(9Z))
1-esadecanoil-2-(9Z-ottadecenoil)-glicero-3-fosfoetanolammina
POPC o PC(16:0/18:1(9Z))
1-esadecanoil-2-(9Z-ottadecenoil)-glicero-3-fosfatidilcolina
DMPC o PC(14:0/14:0)
,2-ditetradecanoil-glicero-3-fosfatidilcolina
8. Page 8
Analisi: Calcolo delle EnergieAnalisi: Calcolo delle Energie
Etot = Eb + Ea + Et + Ei + EVdW + Ec+ EHB
Energia di legame
Energia di non-legame
Eb = energia di legame
Ea = energia angolare
Et = energia torsionale
Ei = energia degli angoli impropri
EVdW = energia di Van der Waals
Ec = energia elettrostatica (coulombiana)
EHB= energia dei legami d’idrogeno
Alcuni parametri compresi nei force field
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Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
La funzione di distribuzione radiale: g(r)
~ 7 Å
Nella membrana DMPC pura il picco
massimo risulta a circa 7 Å.
Dopo l’aggiunta dei tre fluidificanti i
picchi non si discostano
significativamente.
Mostra la variazione della densità di determinati atomi in funzione
della distanza da un punto assegnato (l’atomo P)
Chiarisce l’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle membrane lipidiche.
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~ 6 Å
La funzione di distribuzione radiale: g(r)
Anche il packing sulla superficie
della membrana POPE-POPC non
risulta modificato dall’addizione di
fluidificanti
~ 7 Å
Per le membrane pure POPE e POPC
(non mostrate in figura) i picchi sono
rimasti costanti intorno ai 6 e 7 Å
12. Page 12
Il Density profile
• Permette di seguire l’andamento delle distribuzioni dei vari tipi atomici nel box di simulazione
lungo l’asse Z (spessore bilayer).
• Vengono generate curve gaussiane che mostrano il profilo di densità di tutti gli atomi del
sistema.
• È stato adoperato uno script matlab per leggere il file multi pdb delle dinamiche.
Z
Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
13. Page 13
Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
Density profile
Membrana SM-CHOL
-19,6
+19,2
Spessore medio bilayer: 38,8 Å
14. Page 14
-17,7
+17,8
Spessore medio bilayer: 35,5 Å
Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
Density profile
Membrana SM-CHOL-BC
a)
b)
15. Page 15
Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
Density profile
Membrana SM-CHOL-BA
- 19 +17,7
Spessore medio bilayer: 36,7 Å
16. Page 16
Analisi delle dinamiche molecolariAnalisi delle dinamiche molecolari
Density profile
Membrana SM-CHOL-FE
-19,7
+17,1
Spessore medio bilayer: 36,8 Å
17. Page 17
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Nessuna variazione dell’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle
membrane POPE, POPC, POPE-POPC e DMPC;
I quattro modelli di bilayer hanno subito alterazioni non significative in
seguito all’aggiunta dei tre fluidificanti.
Spostamento delle molecole di colesterolo verso l’interno del bilayer.
Leggera variazione dell’organizzazione delle teste polari sulla superficie delle
membrane SM-CHOL;
Aumento della fluidità nelle regioni più interne del doppio strato lipidico (BC>FE e BA).
Ruolo centrale dei domini SM-CHOL nello stress sensing: variazioni strutturali a tali raft
comportano probabilmente l’attivazione del fattore 1 di trascrizione heat shock (HSF1).
Prospettive future: valutazione dell’utilizzo dei fluidificanti come coadiuvanti ai
classici antitumorali e dell’attività pro-apoptotica.
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RINGRAZIAMENTIRINGRAZIAMENTI
•Prof. Stefano Piotto Piotto
•Prof. Simona Concilio
•Dott. Federica Campana
•Dott. Erminia Bianchino
•Maria Luisa Nappi
•Tutti i ragazzi del lab I4B
Grazie per l’attenzione!
Editor's Notes
Non si conosce ancora la funzione specifica di ogni microdominio. In particolar modo oggi è noto il coinvolgimento della membrana plasmatica nel percepire condizioni di stress, ma ancora non si conoscono le precise implicazioni dei singoli microdomini. Inoltre non è noto il meccanismo mediante il quale variazioni nella fluidità della membrana provochino attivazione del fattore 1 di trascrizione heat shock.
L’aumento dell’espressione delle HSP è metodo con il quale le cellule si difendono da insulti esterni; le HSP sono iperespresse, ad esempio, nel cancro. Con il mio lavoro ho simulato diversi microdomini di membrana in presenza di molecole in grado di determinare un aumento della fluidità di membrana e assieme un aumento dell’espressione di HSP in vivo.
L’idea è che i fluidificanti nelle cellule sane determinano un leggero aumento di fluidità ed una iperattivazione del fattore 1 di trascrizione HS: funzione protettiva in caso di stress cellulare.
Nelle cellule tumorali, con una fluidità di membrana già maggiore rispetto alle sane, l’interazione con i fluidificanti potrebbe determinare una eccessiva fluidità e dunque innescare processi pro apoptotici…
BC: contro la neuropatia diabetica
DPH (1,6-difenilesatriene). Misure dell'anisotropia della fluorescenza possono dare indicazioni sulla mobilità delle molecole
Il calcolo dell’energia ha chiarito le diverse tendenze dei fluidificanti di interagire con un dominio piuttosto che con un altro
Spiegare il grafico delle energie chiarendo le differenze tra i diversi domini di membr
Quest’analisi ha permesso di chiarire le variazioni del packing delle teste fofolipidiche
Ruolo centrale dei domini SM-CHOL nello stress sensing: tali microdomini, infatti, sembra che, alla luce delle alterazioni al normale packing di membrana derivanti dalla presenza di fluidificanti,giochino un ruolo fondamentale nel percepire varie situazioni di stress cellulare.
