Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

1. i Khoa Dược BM Vi sinh – Kýsinh    CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SẢN XUẤT NGUYÊN LIỆU DƯỢC BẰNG CNSH Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM    Sinh viên TH: Bùi Thị Minh Loan Số thăm: 08 Giáo viên HD: TS. Nguyễn TúAnh Ký tên Điểm TB GV chấm 1 GV chấm 2 TP.HCM - 2019

2. ii MỤC LỤC 1. Tóm tắt.......................................................................................................................... 1 2. Tổng quan ..................................................................................................................... 1 2.1. Sơ lược về các acid amin thơm ........................................................................ 1 2.2. Tình hình sản xuất các acid amin ..................................................................... 2 2.3. Các phương pháp sản xuất acid amin............................................................... 2 3. Nội dung ....................................................................................................................... 3 3.1. Tryptophan ....................................................................................................... 3 3.1.1. Giới thiệu về tryptophan ...................................................................... 3 3.1.2.Quy trình sản xuất L-tryptophan........................................................... 3 3.2. Phenylalanin ..................................................................................................... 6 3.2.1. Giới thiệu về phenylalanin................................................................... 6 3.2.2. Quy trình sản xuất L-phenylalanin ...................................................... 6 3.3. Tyrosin.............................................................................................................. 8 3.3.1. Giới thiệu về tyrosin ............................................................................ 8 3.3.2. Quy trình sản xuất tyrosin.................................................................... 9 4. Kết luận....................................................................................................................... 10 5. Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 11

3. iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1: Liệt kê lượng acid amin thiết yếu khuyến cáo hằng ngày của WHO cho người trưởng thành. Bảng 3.1: Bảng thống kê các enzym được sử dụng trong sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp enzym. Bảng 3.2: Các chủng đột biến sinh tryptophan bằng lên men trực tiếp từ glucose. Bảng 3.3: Sản xuất tryptophan từ các loại vi khuẩn và tiền chất khác nhau. DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1. Công thức cấu tạo tryptophan Hình 3.2. Phương pháp sản xuất L-tryptophan bằng enzyme tryptophan synthase cótrong E.coli. Hình 3.3. Con đường tổng hợp L-tryptophan. Hình 3.4. Qui trình sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp hóa học. Hình 3.5. Công thức cấu tạo phenylalanin Hình 3. 6. Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanin. Hình 3.7. Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanin. Hình 3.8. Công thức cấu tạo tyrosin. Hình 3.9. Con đường sinh tổng hợp tyrosin ở E.Coli.

4. 1 1. Tóm tắt Hiện nay, nhu cầu sử dụng acid amin cần thiết ngày càng gia tăng vì vậy các nhà khoa học đang chú trọng nghiên cứu sản xuất để đáp ứng nhu cầu thiết yếu của con người. Các acid amin được sử dụng như thực phẩm bổ sung vìlànhững thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn của các loài động vật bậc cao và con người. Vìvậy các acid amin đang trở thành sản phẩm quan trọng của ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm. Trong đó, phân nhóm acid amin vòng thơm (gồm L-phenylalanin, L- tryptophan vàL- tyrosin) đóng vai tròquan trọng trong việc dẫn truyền các tín hiệu, làthành phần bắt buộc của một số phản ứng tổng hợp vàgiữ một vai tròquan trọng trong việc chuyển hóa các chất của cơ thể. Chuyên đề “Quy trình sản xuất một số acid amin vòng thơm” nhằm cung cấp những thông tin cần thiết về các acid amin thơm cũng như quy trình sản xuất chúng bằng phương pháp tổng hợp sinh học. Đây là một phương pháp tiếp cận mới, hiệu suất cao vàhiệu quả hơn so với phương pháp tổng hợp hoáhọc với khánhiều khuyết điểm, hạn chế đi kèm. 2. Giới thiệu 2.1. Sơ lược về các acid amin thơm Acid amin là đơn vị cơ bản cấu thành nên protein, rất cần cho sự sống của con người vàcókhoảng 20 loại acid amin đã được phân lập từ protein người, trong đó có 9 acid amin gồm: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, threonin, valin, histidin được xem làcác acid amin thiết yếu do chúng không được tổng hợp từ cơ thể màphải bổ sung thông qua nguồn thức ăn hoặc các dạng thực phẩm chức năng khác. Trong 3 loại acid amin vòng thơm thì phenylalanin, tryptophan thuộc vào nhóm acid amin thiết yếu cần thiết bổ sung vào khẩu phần ăn của con người. Tryptophan cóchức năng được gan chuyển hóa thành niacin (vitamin B3) vàcung cấp tiền chất của serotonin, một chất dẫn truyền thần kinh giúp cơ thể điều hòa sự ngon miệng, giấc ngủ vàtâm trạng. Phenylalanin cóchức năng bổ não, tăng cường trínhớ, tác động trực tiếp đến mọi hoạt động của não bộ, làm tăng lượng chất dẫn truyền xung động thần kinh, và tăng tỷ lệ hấp thụ tia UV từ ánh sáng mặt trời, giúp tạo ra vitamin D nuôi dưỡng làn da.

5. 2 Acid amin mg/kg trọng lượng cơ thể mg/70 kg mg/100 kg Histidin 10 700 1000 Isoleucin 20 1400 2000 Leucin 39 2730 3900 Lysin 30 2100 3000 Methionin+ Cystein 10,4 + 4,1 (15 tất cả) 1050 1500 Phenylalanin+Tyrosin 25 (tất cả) 1750 2500 Threonin 15 1050 1500 Tryptophan 4 280 400 Valin 26 1820 200 Bảng 2.1: Liệt kê lượng acid amin thiết yếu khuyến cáo hằng ngày của WHO cho người trưởng thành [1]. Lượng khuyến cáo ở trẻ em trên 3 tuổi thìnhiều hơn từ 10% đến 20% so với người trưởng thành vàvới trẻ sơ sinh 1 năm đầu đời thìcóthể nhiều hơn đến 150%. 2.2. Tình hình sản xuất các acid amin Acid amin cónhiều ứng dụng trong công nghiệp: khoảng 65% các acid amin được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm, 31% trong chăn nuôi và 4% trong y tế, mỹ phẩm vàlànguyên liệu cho công nghiệp hóa học. Trong công nghiệp thực phẩm các acid amin được sử dụng riêng hoặc kết hợp để tăng vị [2]. Trong số các hợp chất acid amin thơm, L-phenylalanin khá được quan tâm sản xuất, vìhợp chất này cónhiều ứng dụng trong ngành thực phẩm và dược phẩm. 2.3. Các phương pháp sản xuất acid amin [3] Phương pháp ly trích các acid amin từ dịch thủy phân protein. Phương pháp này dùng để thu nhận L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-asparagin, L-tyrosin. Phương pháp tổng hợp hóa học. Phương pháp này dùng để sản xuất glycin, alanin, methionin, tryptophan. Phương pháp lên men vi sinh vật. Trong chuyên đề này cung cấp thông tin cần thiết về quy trình sản xuất các acid amin vòng thơm bằng các phương pháp khác nhau từ đó có thể so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp để chọn ra quy trình sản xuất thích hợp.. 3. Nội dung 3.1. Tryptophan

6. 3 3.1.1. Giới thiệu về L-tryptophan Hình 3.1.Công thức cấu tạo tryptophan Nguồn: Pubchem [4] Tryptophan đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp protein vàlàtiền chất của những chất có hoạt tính sinh học như serotoin, melatoin, tryptamin, quinolinic acid, kyrurenic. Ngoài ra trytophan còn làtiền chất của các coenzym NAD, NADP vàcóthể thay thế niacin [5]. Tryptophan được sản xuất chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hóa học hoặc bằng con đường lên men hoặc bằng sử dụng phương pháp enzym. 3.1.2. Quy trình sản xuất L-tryptophan  Sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp enzym Phương pháp sản xuất L-tryptophan bằng enzyme được sử dụng phổ biến vìnguồn nguyên liệu rẻ, dễ kiếm vàcho ra sản phẩm tinh khiết. Enzyme Vi sinh vật Phản ứng D-tryptophan hydanotoin racemase D-tryptophan hydanotoin hydrolase N-cacbamoyl-L-tryptophan hydrolase Flavobacterium aminogenes D-tryptophan hydanotoin + H2O L-tryptophan + CO2 + NH3 Tryptophanase Proteus rettgeri Acromobacter liquidum E.coli Indole + pyruvate + NH3  L-tryptophan + H2O Indole + L-serin L- tryptophan + H2O Tryptophan synthase E.coli Indole + L-serin L- tryptophan + H2O Bảng 3.2: Bảng thống kê các enzym được sử dụng trong sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp enzyme [2].

7. 4 Trong phương pháp hydanotoinaza, người ta sử dụng một enzym từ Flavobacterium aminogenes thủy phân D, L-tryptophan hydanotoin. Chủng này có khả năng phân hủy tryptophan thấp và nó được cảm ứng bằng cách bổ sung D, L-tryptophan hydanotoin vào môi trường [2]. Phương pháp enzym được sử dụng phổ biến hơn là tryptophanase, sử dụng Proteus rettgeri để chuyển hóa indol. Phản ứng trong dung dịch cóthành phần: 60 g indol, 80 g pyruvate natri, 80 g amoni acetat, 0,01 g phosphate pyridoxal, 1 g sulfat natri. Sau khi ủ 34 °C trong 48 giờ, tạo ra 75 g L-tryptophan. Quy trình sản xuất L-tryptophan bằng enzyme Tryptophan synthase cótrong E.coli phụ thuộc vào hoạt tính của enzyme tryptophan synthase, gồm 2 phản ứng: Indol-3-glycerol  phosphat Indol + Glyceraldehyd 3 phosphat Indol + L-serin  L-tryptophan + H2O Tryptophan synthase từ E.coli cóhoạt tính cao, được mãhóa bởi 2 gen trpA vàtrpB thuộc operon trpEDCBA và được điều hòa theo cơ chế ức chế vàsuy giảm. Thu hoạch tryptophan gồm các giai đoạn: loại bỏ sắc tố, kết tinh vàlàm khô[3]. Hình 3.3. Phương pháp sản xuất L-tryptophan bằng enzyme Tryptophan synthase có trong E.coli Nguồn : New Approach to Tryptophan Production by Escherichia coli: Genetic Manipulation of Composite Plasmids In Vitro [6].

8. 5  Sản xuất L-tryptophan bằng con đường lên men [2]. Vi sinh vật Đặc điểm di truyền Hiệu suất (g/l) Bacillus subtilis 5FT’, Arg-, Leu- 6 Enterobacter cloaceae TA 599 5MT’, THA’, Str’, Tyr- 10 C. glutamicum Px-115-97 Phe-, Tyr-, 5MT’, TrpHx’, 6FT’, 4MT’PEP’PAP’, 12 Brevibacterium flavum S-225 5FT’AZ’SG’PFP’ Tyr- 19 Bảng 3.2: Các chủng đột biến sinh tryptophan bằng lên men trực tiếp từ glucose [2] Hình 3.2. Con đường tổng hợp L-tryptophan [2], [7]. Vi khuẩn Tiền chất Lượng sử dụng (g/l) Hiệu suất (g/l) Hansenula anomala Acid anthranilic 4,2 5,7 Bacillus subtilis Acid anthranilic 5,0 5,5 Candida utilis Acid anthranilic 4,2 6,4 Claviceps purpurea Indol 1,3 1,5 Escherichia coli Indol + D,L-serin 3,0 + 6,0 5,2 Bacillus subtilis Acid anthranilic 15,75 15,6 Bảng 3.3 Sản xuất tryptophan từ các loại vi khuẩn và tiền chất khác nhau [2]. Để sản xuất L-tryptophan từ acid anthranilic bằng Hansenula anomala, người ta nuôi cấy trên môi trường cóthành phần như sau: Glucose 5%; NH4NO3 0,3%; 0,05% KH2PO4 0,05%; Na2HPO4.12H2O 0,2%; NaH2PO4.12H2O 0,1%; MgSO4.7H2O 0,05%; NaCl 0,01%; FeSO4.7H2O 0,001%; cao nấm men 0,1%; anthranilic 0,2%; CaCO3 2%.

9. 6  Sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp tổng hợp hóa học . Hình 3.4. Qui trình sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp hóa học Nguồn : Enzymatic Production of L-Tryptophan from L- and DL-5- Indolylmethylhydantoin by Newly Isolated Bacteriumt [8]. Qui trình sản xuất L-tryptophan bằng phương pháp hóa học thường tạo ra hỗn hợp đồng phân D,L-tryptophan vàviệc tách đồng phân dạng L ra khỏi hỗn hợp làrất khóthực hiện vàhết sực tốn kém . Chính vìvậy, phương pháp này ít được quan tâm nhiều. 3.2. Phenylalanin 3.2.1. Giới thiệu về L-phenylalanin Hình 3.5. Công thức cấu tạo phenylalanin Nguồn: Pubchem [9].

10. 7 Phenylalanin làmột acid amin thiết yếu cần thiết cho hoạt động bình thường của hệ thần kinh trung ương và được sử dụng thành công để giúp kiểm soát triệu chứng trầm cảm và đau mãn tính, cải thiện trínhớ vàtập trung, cũng như các bệnh khác cóliên kết với hệ thống thần kinh trung ương. Phenylalanin đặc biệt hiệu quả cho điều trị rối loạn não bộ bởi vìcóthể xâm nhập qua hàng rào máu não [10]. Phenylalanin tồn tại trong hai đồng phân: D-phenylalanin vàL-phenylalanin .L- phenylalanin được tìm thấy trong protein, mãhóa bằng DNA. 3.2.2. Quy trình sản xuất L-phenylalanin  Quy trình sản xuất L-phenylalanin bằng phương pháp lên men Ngày nay, nhu cầu sử dụng L-phenylalanin ngày càng tăng. Trước đây, người ta sản xuất L-phenylalanine bằng phương pháp enzym nhưng từ cuối năm 1996 tại Trung Quốc, người ta bắt đầu sản xuất L-phenylanine bằng phương pháp lên men [11]. Các yếu tố của quy trình: + Nguyên liệu : gao, bắp,…vàmột số nguyên liệu phụ như dịch chiết nấm men, trypton, tyrosin. + Chọn giống vi sinh vật: Corynebacterium glutamicu, Rhodotorula rubra, E.coli… + Nguồn dinh dưỡng: nguồn cacbon từ glucose, mannitol…; nguồn nito như amonium nitrat, amonium clorid…; nguồn khoáng từ các muối khoàng; nguồn dưỡng chất từ vitamin B1.B2, B6, B12… + Phương pháp lên men : Thực hiên lên men trong điều kiện hiếu khí, cóbổ sung glucose vàtyrosin Hình 3.6: Sơ đồ khối quy trình lên men tạo phenylalanin [11]

11. 8 Hình 3.7: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch phenylalanin [11].  Sản xuất L-phenylalanin từ acid trans-cinnamic với sự xúc tác của enzym L-phenylalanin amonia-lyase. Quy trình này được nghiên cứu vàphát triển bởi Shigeki Yamada vàcông sự công bố vào năm 1981. Chủng nấm men Rhodotorula glutinis IFO 0559 có chứa enzym L- phenylalanin amonia-lyase (PAL) có vai trò chuyển hóa acid trans-cinnamic thành L- phenylalanin với sự bổ sung của L-isoleucin nhằm ổn định hoạt động của enzym trong thời gian tương đối dài. Quy trình sản xuất này bao gồm những bước sau: + Môi trường nuôi cấy (A): thạch agar chứa 1,0% chiết xuất nấm men; 1,0% peptone; 0,5% NaCl; 0,05% L-phenylalanine và1,5% agar (pH 6,0). Ủ 30 °C trong 20 giờ. + Môi trường (B): 2% sorbitol; 1% (NH4)2SO4; 0,5% KH2PO4; 0,05% MgSO4. 7H2O; 0,001% FeSO4.7H2O; 0.001% MnSO4.6H2O; 0.001% NaCl và 2% L- phenylalanin (pH 6.0). + Môi trường tối ưu (C) cho sản xuất PAL: 1% men chiết xuất; 1% pepton; 0.5% NaCl; 0.05% L-phenylalanin và0,5% L-isoleucin (pH 6,0). Môi trường (B), (C) ủ ở 120 °C trong 10 phút, thêm vào 1,0% của môi trường nuôi cấy A đã tiệt trùng rồi ủ ở 30 °C trong 18 giờ.

12. 9 + Ly tâm thu tế bào, phân tán bằng 0,9% salin vàtái phân tán bằng nước. + Dung dịch nền: 740 mg của acid trans-cinnamic được hòa tan trong 45 ml 28% amonium hydroxit, điều chỉnh đến pH 10.0 với HCI vàpha loãng với nước cất. + Hỗn hợp phản ứng gồm hỗn dịch tế bào vàdung dịch nền tỉ lệ 1:4 được ủ 30 °C trong 1 giờ [12]. + Ly tâm loại bỏ tế bào, L-phenylalanin vàaicd trans-cinnamic nằm ở lớp trên. + Kết tinh thu L-phenylalanin. 3.3. Tyrosin 3.3.1. Giới thiệu về tyrosin Hình 3.8. Công thức cấu tạo tyrosin Nguồn: Pubchem [13]. Tyrosin làmột trong 12 amino axit không thiết yếu nhưng rất cần thiết cho cơ thể. Nólànguyên liệu cho quátrình tổng hợp một số chất dẫn truyền thần kinh (adrenalin, dopamin,…) trong não bộ, giúp cho quátrình truyền thông tin liên lạc giữa các tế bào thần kinh tác động đến tâm trạng của con người. Đồng thời Tyrosin ảnh hưởng đến các hoạt động của tuyến thượng thận, tuyến giáp vàtuyến yên, giữ nhiệm vụ sản xuất và điều chỉnh các nội tiết tố [14], [15]. 3.3.2. Quy trình sản xuất L-tyrosin  Sản xuất L-Tyrosine từ đường Sucrose bằng chủng Escherichia coli sản xuất Phenylalanin [16]. Chủng E.coli K12 cho sản phẩm L-phenylalanine được chuyển đổi sang L-Tyrosine nhờ vào việc xóa đi đoạn gen pheA mãhóa enzyme mutase/ prephenate dehydratase thay vào đó là chèn vào đoạn gen TyrA. Đây là một phương pháp cải tiến mang lại hiệu quả cao hơn.

13. 10 Hình 3.9. Con đường sinh tổng hợp Tyrosine ở E.Coli Nguồn: Production of tyrosine from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes to phenylalanine-producing Escherichia coli strains [16]. 4. Kết luận Tóm lại, sản xuất các acid amin vòng thơm có nhiều phương pháp được sử dụng trong đó phần lớn tập trung vào phương pháp enzym và phương pháp lên men bởi vì phương pháp tổng hợp hóa học sử dụng các nguyên liệu độc hại không thể tái sử dụng và tạo ra sản phẩm làhỗn hợp racemic của các đồng phân D và L gây khó khăn cho quá trình tinh chế. Trong khi đó, việc tổng hợp sinh học lại làmột lựa chọn hấp dẫn vì đây là công nghệ sạch sử dụng nguồn năng lượng tái sử dụng như carbohydrate đơn giản (D-glucose), ít gây ônhiễm môi trường hơn, năng suất cao hơn. Bên cạnh đó, xu hướng hiện nay đang hướng đến làdùng những nguồn nguyện liệu rẻ tiền, sạch sẽ vàkhông gây ônhiễm môi trường. Vìvây, chúng ta cần đẩy mạnh việc sản xuất các acid amin thiết yếu nói chung và các acid amin vòng thơm nói riêng bằng công nghệ sinh học để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của con người.

14. 11 5. Tài liệu tham khảo 1. FAO/WHO/UNU (2007), "Protein and amino acid requirements in human nutrition", 150. 2. PGS.TS. Quản LêHà, GS. Nguyễn Thị Hiền (2011), "Công nghệ sản xuất acid amin vàứng dụng". 3. PGS.TS. Trần Cát Đông (2016), "Acid amin vàvitamin, Sản xuất nguyên liệu dược bằng Công nghệ sinh học", 25-35. 4. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6305, Ngày truy cập: 07/04/2019. 5. Elaine R. Radwanski and Robert L (1995), "Tryptophan Biosynthesis and Metabolism: Biochemical and Molecular Genetics", 7, 921-934. 6. Aiba S. (1981), "New Approach to Tryptophan Production by Escherichia coli:Genetic Manipulation of Composite Plasmids In Vitro, Applied and Environmenta lmicrobiology", 43(2), 289-297. 7. Britz M. L. D., A. L. (1985), "Regulation of metabolite synthesis". 8. Sano K. (1976), "Enzymatic Production of L-Tryptophan from L- and DL-5- Indolylmethylhydantoin by Newly Isolated Bacteriumt", 41(5), 819-825. 9. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/6140, Ngày truy cập: 07/04/2019. 10. Rehm H.J. R. G. (1996), "Biotechnology", Primary metabolites, 6, VCH,Publishers, Weinheim. 11. PGS. TS. Lê Văn Việt Mẫn (2013), "Sản xuất phenylalanin.". 12. Yamada S. N., K., Izuo, N., Nakamichi, K., & Chibata, I. (1981), "Production of L- phenylalanine from trans-cinnamic acid with Rhodotorula glutinis containing L- phenylalanine ammonia-lyase activity", Applied and environmental microbiology, 42(5), 773-778. 13. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1153, .Ngày truy cập 07/04/2019. 14. Lieberman HR C. S., SpringBJ, Wurtman RJ, Growdon JH (1985), "The effects of dietary neurotransmitter precursors on human behavior", 42(2), 366–370. 15. Magill RA W. W., Bray GA,Volaufova J, Smith SR, Lieberman HR, McNevin N, Ryan DH (2003), "Effects of tyrosine, phentermine, caffeine Damphetamine,and placebo on cognitive and motor performance deficits during sleep deprivation, Nutritional Neuroscience", 6 (4), 237–46.

15. 12 16. Monica M. Olson L. J. T., Wonchul Suh, Philip Youderian, F. Sima Sariaslani, Anthony A. Gatenby, Tina K. Van Dyk (2007), "Production of tyrosine from sucrose or glucose achieved by rapid genetic changes to phenylalanine producing Escherichia coli strains", 74, 31–1040.

16. Mã tài liệu : 600233 Tải đầy đủ luận văn theo 2 cách : - Link tải dưới bình luận . - Nhắn tin zalo 0932091562

Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances(20)

Similaire à Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM

Similaire à Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM(20)

Plus de hieu anh

Plus de hieu anh(20)

Dernier

Dernier(20)

Tên chuyên đề: QUY TRÌNH SẢN XUẤT MỘT SỐ ACID AMIN VÒNG THƠM