RoXaN, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale NSP3 du Rotavirus
1. RoXaN, une nouvelle protéine cellulaire
interagissant avec la protéine
non-structurale NSP3 du Rotavirus
Pierre Lindenbaum
9 Juin 2000
Directeur de thèse: Dr. Didier PONCET. INRA/VIM/Laboratoire de Biologie Moléculaire des Rotavirus
78352 Jouy-en-Josas CEDEX
2. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
3. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
4. Impact du Rotavirus dans le monde
40% des enfants diarrhéïques de moins
de 5 ans.
300 000 000 $ en frais d'hospitalisation
aux U.S.A.
Impact agronomique
1 000 000 décès/an
Principale cause des gastro-entherites
d'origine virale touchant les jeunes
mammifères.
9. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
10. Rappels sur le Double Hybride
Milieu Leu-Trp-His-
Milieu Leu-Trp-His-
• Les Protéines X et Y interagissent:
• Les Protéines X et Y
n'interagissent pas:
Liaison
à l'ADN
GAL4
X
GAL4
Domaine
activateur
Y
UAS HIS
Levure Leu- Trp- His-
APPÂT
PROIE
12. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
14. NSP3 interagit avec eIF4G
GAL4
Domaine
activateur
eIF4GI
m88-
NSP3Liaison
à l'ADN
GAL4
15. Déplacement de la PABP par NSP3
4G
4A 4E
Cellules infectées
NSP3 déplace la PABP de EIF4G et permet la
traduction des ARN m viraux
5'Cap
NSP3
AUGUGACC 3'
ARN viral
4G
4A 4E Cellules non infectées
Traduction des ARNm polyadénylés.
5'Cap
PABPARN cellulaire
eIF4F
AAAAAAAAAAAA 3'
PABP
NSP3
16. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
18. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
19. Northern Blot de RoXaN-1
6kb
28S
18S
Northern Blot RoXaN-1
sur ARNm
de cellules MA104
21. Introduction
Rotavirus
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Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
23. RoXaN est ubiquitaire dans les tissus.
RT-PCR Elisa réalisée sur différents tissus en utilisant KIAA1031comme amorce
(projet HUGE) unité: fg d'ADN/ng d'ARN poly(A).
24. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
25. Recherche d'un sérum dirigé contre RoXaN
Expression de RoXaN-1 par le système Bac-to-Bac
Expression de RoXaN-1 par le système pET
Expression de RoXaN-1 par le système GEX
Immunisation par un peptide
Immunisation par RoXaN-1 purifiée
26. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
27. NSP3-HisTag
NSP3-
9011NHisTag
PABPHisTag
- + - + - +plasmide seul: traduction in vitro
RoXaN1 traduite in vitro + - + - + -
RoXaN1traduiteinvitro
Protéine fixée aux billes
RoXaN1
69Kd -
46Kd -
30Kd -
RoXaN interagit avec NSP3
in vitro
NSP3HisHisHisHis
RoXaN S35
28. NSP3
50 kD
(Chaines lourdes
des Ig)
25kD
(chaines légères
des Ig)
Western Blot anti-NSP3
monoclonal
Transfection FLAG-RoXaN1
Infection:rotavirus
Immuno
Précipitation
Anti-FLAG Anti-NSP1
Lysat de
cellules
infectées
Lysat de
cellules
non-
infectées
Western Blot anti-NSP3
FLAG
RoXaN-1
NSP3
NSP3 co-immunoprécipite avec RoXaN-1 in vivo
29. 50 kD
25kD
Western Blot anti-FLAG(RoXaN1)
Infection: Rotavirus
Transfection FLAG-RoXaN1
Immunoprécipitation
RoXaN1
RoXaN1
Stu
Lysat
trans-
fecté
RoXaN
1
-FLAG
infecté
Lysat
infecté
RoXaN1
Stu
NSP3NSP1NSP3 NSP3 NSP3 NSP1
FLAG
RoXaN-1
NSP3
NSP3 co-immunoprécipite avec RoXaN-1 in vivo
33. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
34. pGBT9 / pYX212 / pGAD424
pGBT9-NSP3 / pYX212 / pGAD424-NSP3
pGBT9-EIF4G/ pYX-NSP3 / pGAD424-RoXaN1
pGBT9-EIF4G/ pYX-NSP3 / pGAD424
pGBT9-EIF4G / pYX212 / pGAD424-RoXaN1
pGBT9-EIF4G Eco/ pYX -NSP3/ pGAD424- RoXaN1
Contrôle (-)
Contrôle (+)
Domaine
activateur
RoXaN
1
EIF4G
37-176
UAS HIS
m88-
NSP3
Le système triple-hybride.
Liaison
RoXaN appartient au complexe
eIF4G/NSP3
dans le systéme triple hybride
36. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
37. Crible de RoXaN en double-hybride
RoXaN1
Liaison
à l'ADN
GAL4
GAL4
Domaine
activateur
p170/
eIF3
TPRde
RoXaN
Liaison
à l'ADN
GAL4
38. 1
2
3
4
5
6
7
8
Appât:pGBT9 Proie:GAD424
1 m88NSP3 RoXaN1
2 pGBT9 GAD424
3 TPR GAD-424
4 TPR NSP2
5 TPR p170
6 p170 GAD-424
7 p170 NSP2
8 p170 RoXaN1
le TPR de RoXaN-1 interagit avec
la sous/unité p170 de eIF3
39. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
40. Les motifs TPR (Tetratricopeptide)
Organismes
Fonctions diverses
Compartiments
Bactéries, champignons, plantes, animaux
Cytosol, noyau, mitochondries, peroxysomes…
Nombre de motifs variables
34 acides aminés
Co-chaperons, APC, repression de la transcription
transport peroxisomal, mitochondrial…
SGT/Protéine NS1 du parvovirus
PP5
FKBP52
CDC23
42. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
43. Un homologue de RoXaN chez la drosophile
Score = 62.8 bits (150), Expect = 9e-10
Identities = 43/146 (29%), Positives = 69/146 (46%), Gaps = 20/146 (13%)
Query: 793 NKILDMQQTYDMWLKKHNPGKPGEGTPISSREGEKQIQMPTDYADIMMGYHCWLCGKNSN 852
+K D+ + KH PG G+G+ S +G++ T C C
Sbjct: 243 HKTNDLLAAMKLTAGKHQPGS-GDGS--GSDQGDQAAPSTT----------CSYCTITFQ 289
Query: 853 SKKQWQQHIQSEKHKEKVFTSDSDASGWAFRFP-----MGEFRLCDRLQKGKACPDGDKC 907
++ + +QH Q+E H +KV SD + W +R P + + LC+ + C G +C
Sbjct: 290 TRNELRQHCQTEAH-QKVIMSD-EGRDWKWRPPPRGYTLDTYSLCETFSEAHICHYGAQC 347
Query: 908 RCAHGQEELNEWLDRREVLKQKLAKA 933
AHGQ+ELNEW +R E + ++ KA
Sbjct: 348 VEAHGQDELNEWKERFEYRRMRMQKA 373
RoXaN/CG9425
44. Un homologue de RoXaN
dans le chromosome 16
humain
Query: 69 QVYLRALVRNLFNEGNDVYREHDWNNSISQYTEALNIADYAKSXXXXXXXXXXXXXYINR 128
+ +L LV+NLF EGND++RE D+ ++ QY E LN+ADYA S ++N+
Sbjct: 29 EAFLLKLVQNLFAEGNDLFREKDYKQALVQYMEGLNVADYAASDQVALPRELLCKLHVNK 88
Query: 129 IACYSNMGFHDKVLEDCNIVLSLNASNCKALYRKSKALSDLGRYKKAYDAVAKCSLAVPQ 188
ACY MG ++K LED L L++ + +AL+RK++AL++LGR+K+AY+ ++CSLA+P
Sbjct: 89 AACYFTMGLYEKALEDSEKALGLDSESIRALFRKARALNELGRHKEAYECSSRCSLALPH 148
Query: 189 DEHVIKLTQELAQKLGFKIRKAYVRAEALNH----------------------SVEDIEP 226
DE V +L QELAQKLG ++RKAY R + L S++DIE
Sbjct: 149 DESVTQLGQELAQKLGLRVRKAYKRPQELETFSLLSNGTAAGVADQGTSNGLGSIDDIET 208
Query: 227 DL-LTPRQEAVPVVSLPA-PSFSH--EVGSELASVPVMPLTSILP--------------- 267
D + PR + S P P F H ++ + L S +P T L
Sbjct: 209 DCYVDPRGSPALLPSTPTMPLFPHVLDLLAPLDSSRTLPSTDSLDDFSDGDVFGPELDTL 268
Query: 268 -----------------------LQVEESALPSAVLANGGKMPFTMP------EAFLDDG 298
+ V P GG +P + P +D
Sbjct: 269 LDSLSLVQGGLSGSGVPSELPQLIPVFPGGTPLLPPVVGGSIPVSSPLPPASFGLVMDPS 328
Query: 299 DMVLGDELD---------DLLDSAP--ETNETVMPS-ALVRGPLQ--------------- 331
+ LD D LD P ET + S RG L
Sbjct: 329 KKLAASVLDALDPPGPTLDPLDLLPYSETRLDALDSFGSTRGSLDKPDSFMEETNSQDHR 388
Query: 332 --------TASVSPSMPFSASLLGTLPIGARYAPPPSFSEFYPPL---------TSSLED 374
S P MP +A L+ P+ A + + YP LE
Sbjct: 389 PPSGAQKPAPSPEPCMPNTALLIKN-PLAATHEFKQACQLCYPKTGPRAGDYTYREGLEH 447
Query: 375 FCSS---LNSFSMSESK---------------------RDVAAEEECRYSGHCTFAYCQE 410
C L SE + +D+ +++C+Y +CTFAY QE
Sbjct: 448 KCKRDILLGRLRSSEDQTWKRIRPRPTKTSFVGSYYLCKDMINKQDCKYGDNCTFAYHQE 507
Query: 411 EIDVWTLERKGAFSREAFF---GGNGKINLTVFKLLQEHLGEFIFLCEKCFDHKPRMISK 467
EIDVWT ERKG +R+ F GG + +LT+ KLL+EH G F FLCE CFD KPR+ISK
Sbjct: 508 EIDVWTEERKGTLNRDLLFDPLGGVKRGSLTIAKLLKEHQGIFTFLCEICFDSKPRIISK 567
Query: 468 RNKDNSTACSHPVTKHEFEDNKCLVHILRETTVKYSKIRSFHGQCQLDLCRHEVRYGCLR 527
KD+ + CS+ KH F +NKCLVHI+R T++KYSKIR F Q D+CRHEVRYGCLR
Sbjct: 568 GTKDSPSVCSNLAAKHSFYNNKCLVHIVRSTSLKYSKIRQFQEHFQFDVCRHEVRYGCLR 627
Query: 552 DMEQFYELWLKSQKNEKSEDIASQSNKENGKQIHMPTDYAEVTVDFHCWMCGKNCNSEKQ 611
DM+Q Y++WLK K + S++E KQI MPTDYA++ + +HCW+CGKN NS+KQ
Sbjct: 797 DMQQTYDMWLKKHNPGKPGEGTPISSREGEKQIQMPTDYADIMMGYHCWLCGKNSNSKKQ 856
Query: 612 WQGHISSEKHKEKVFHTEDDQYCWQHRFPTGYFSICD 648
WQ HI SEKHKEKVF ++ D W RFP G F +CD
Sbjct: 857 WQQHIQSEKHKEKVFTSDSDASGWAFRFPMGEFRLCD 893
RoXaN / AF161540
46. 4G
4E
5'Cap
PABP
AAAAAAAAAAAA 3'
4G
4E
4G
4E
5'Cap
PABP
AUG
PABP
AAAAAAAAAAAA 3'
En présence de poly(A) et
de coiffe, la PABP et eIF4G
stimulent l'initiation de la
traduction. La PABP liant le
complexe d'initiation en
plusieurs endroits.
En absence de poly(A), la
PABP peut transactiver la
traduction coiffe dépendante
en interagissant peut-être
avec des facteurs de
stimulation non identifiés à
ce jour.
Facteur de
stimulation
RoXaN ?
En absence de coiffe mais
en présence de poly(A)
eIF4G est capable de lier à
la PABP.
AUG
AUG
Facteur de
stimulation
RoXaN ?
Facteur de
stimulation
RoXaN ?
Le Modèle d'Otero & Sachs (1999)
47. Introduction
Rotavirus
L'initiation de la traduction
Résultats
RoXaN
Reconstitution
Analyse de la séquence de RoXaN
Interaction avec NSP3
Interaction avec eIF4G/NSP3
Interaction avec d'autres protéines
Discussion
Perspectives
Propriétés des TPR
Fonction de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Double-Hybride
48. Perspectives
Purification de RoXaN
Rôle de RoXaN
Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN
Animaux "Knock-out"
Effets sur la traduction in vitro
Double hybride reverse
Homologues de RoXaN / NSP3
LUCUTR UTR