2. La vacunación es una de las metodologías con mas impacto en la salud
del ser humano.
Los avances en microbiología y en técnicas de cultivo in vitro se logro la
creación de las primeras vacunas atenuadas.
En la actualidad se hacen avances en biología molecular y virología
para la nueva generación de vacunas basadas en el DNA.
Las vacunas de DNA consisten en vectores plasmídicos a los que se les
ha codificado una proteína de algún microorganismo patógeno del cual
se quiere proteger.
3. La expresión genética se lleva a cabo bajo la influencia de un
promotor
Esta nueva generación de vacunas ha mostrado su eficacia en
modelos animales
Vacunas de DNA es que constituyen un estímulo potente en la
generación de respuestas celulares.
4. Las vacunas son efectivas para el tratamiento de enfermedades
infecciosas.
Se ha logrado un gran avance en el conocimiento tanto de los
microorganismos que causan infección ene lo organismo el sistema
inmune que lo combate.
Las vacunas de DNA estimulan tanto la respuesta humoral como la
celular y se utiliza de manera repelida.
Para la fabricación de estas vacuna se utilizan plasmídicos, que
modifiquen la ubicación final del antígeno en la célula.
5. Las secuencias de DNA pueden ser modificadas por:
Mutación dirigida.
Que consiste en el cambio
de los aminoácidos
individuales que permiten
potenciar la respuesta
inmune o eliminar
determinantes antigénicos.
Optimización de codones.
Se cambian los tripletes de
las secuencias virales,
procurando no alterar la
estructura primaria de la
proteína
Las ventajas es la estabilidad de los vectores plasmidicos
a diferencia de temperaturas. Por lo que no se invierte
mucho en elaboración trasporte y administración
6. Los inicios de la vacunación con DNA
plasmidico
Jon A. Wolff,
Utilizo DNA
plasmidico como
control negativo en
la trasferencia
genética en ratones
Se demostró que las células musculares
son capaces de expresar genes como
consecuencia de la inyección de DNA
plasmidicos “desnudo”.
Concluyo que la transferencia de
genética de DNA plasmidico podría ser
utilizada en el desarrollo de vacunas
7. Se reportaron también anticuerpos contra dos proteínas, la
hormona de crecimiento humano y la α 1-antitripsina, mediante
la inoculación de DNA codificante para ambas.
La vacunación con DNA quedó demostró que la inyección de
vectores codificantes para proteínas del virus de la influenza
protegían a animales ante un reto mortal con el virus.
A partir de estos estudios se han desarrollado vacunas hacia una
cantidad de enfermedades virales, bacterianas y parasitarias y
dirigidas también al tratamiento de cáncer, enfermedades
autoinmunes y alérgicas.
8.
9. Las vacunas de DNA están compuestas
por un plásmido bacteriano o vector en el
cual se ha insertado una secuencia de
cDNA (
complementario) que codifica el antígeno
de interés o proteína transgénica.
Los plásmidos bacterianos son
básicamente los mismos que se utilizan en
experimentos que involucran la expresión
de proteínas en cultivos celulares
10. De manera
funcional se
emplea el DNA en
vacunas
Segundo
componente
Función
adyuvante interno
Unidad
transfusionales
promotor, intron.
(cDNA) codifica
ag.
Facilita la
inserción del gen
Sitio de clonación
múltiple .
Esqueleto
plasmidico origen
replicación.
CpG (regiones del
ADN que forman el
40% de los
promotores) en
secuencia
inmunoestimulador
a
Gen resistente a
antibióticos
11. Representación de la estructura de un vector
plasmídico empleado como vacuna de DNA.
12. Promotor. la mayoría de las vacunas de DNA
contienen el promotor de la región inmediata
temprana de Citomegalovirus , el cual
permite altos niveles de transcripción de
manera constitutiva en una gran variedad de
células eucarióticas.
La inclusión de la secuencia del intrón A del
citomegacalcivirus (CMV-IA) ha permitido una
mejoría en la expresión de DNA
complementarios microbianos.
13. PROMOTORES
•Otros promotores virales comunmente utilizados, aunque de expresión más
débil, son los del Virus de Sarcoma de Rous (RSV) y el promotor temprano
viral SV40
SV40
•SV40 es unas 40 veces menos potente que el de CMV, sin embargo funciona
de manera óptima en vacunas con inmunógenos como la glicoproteína del
virus de la rabia, la cual no genera una buena respuesta inmune cuando se
encuentra bajo la influencia del promotor citomegacalcivirus por la posible
toxicidad causada a la célula que lo expresa
No necesariamente se genera una respuesta inmune más potente
con los promotores fuertes, por lo que es necesario elegir el
promotor apropiado para el antígeno que se desea emplear.
14. Es posible lograr una buena respuesta inmune al
utilizar promotores no virales como aquellos que
participan en la expresión (MHC) de clase I y II. En
algunos modelos, los primeros han generado una
respuesta inmune más fuerte, mientras que los de
clase II propician una respuesta menor
Otros promotores, como el de la creatina cinasa
muscular que solamente se expresa en músculo
esquelético diferenciado han sido empleados en
vacunas miogénicas de DNA ofreciendo protección
contra la infección del virus Herpes Simplex tipo 2
(HSV-2)
15. Secuencias que determinan la transcripción
Estas se conocen como
regiones 3' y la mayor
parte de los vectores
emplean secuencias
provenientes del virus
SV40, como el vector
Psg5 (actuando como
vector).
La terminación de la
transcripción en las
vacunas de DNA se realiza
mediante secuencias de
terminación y poliadeni
lación ubicada en la región
3' del DNA que codifica
para el antígeno.
Las secuencias de
terminación/poliadenilació
n dan estabilidad a la
molécula de mRNA y están
formadas por una
secuencia ubicua AATAAA
seguida de una secuencia
rica en GT o en T, los cuales
bajo condiciones óptimas
se encuentran separados
por 22 ó 23 nucleótidos .
.
16. Las diversas secuencias de terminación provocan
variación en los niveles de expresión de las
proteínas, ya que se ha mostrado que la sustitución
de aquellas provenientes de SV40 provoca un
incremento en la expresión de genes como la
lucíferasa (enzima oxidativa ).
17. ORIGEN DE
REPLICACION (ORI)
Origen de
replicación
depende del
antígeno T y del
virus SV4O
Se usan en
vacunas de DNA
20 Copias de DNA
por célula
Obtenidas grandes
cantidades de DNA
plasmidico
18. SITIO DE
CLONACION
MULTIPLE
Derivo gran numero
de vectores usados
en la clonación
actual
Posee sitios de
clonación sintéticos
Se pueden clonar
secuencias de ADN
Codificando Ac de
genes obtenidos
por PCR
Mediante medios de
restricción de otros
plásmidos
19. Gen de resistencia a antibióticos: Los vectores
plasmídicos utilizados como vacunas de DNA
se obtienen mediante transformación de
bacterias competentes como E. Coli cepa
DH5α previamente tratadas con una mezcla
de cationes divalentes que las hacen
permeables temporalmente a pequeñas
moléculas de DNA.
20. Consiste en mezclar vacunas de ADN con
otros sistemas de administración de genes.
Se administra un ADN codificador de un
antígeno como inductor, seguido de otro
sistema vectorial basado en genes
codificador del mismo antígeno.
Con este sistema hay una mejor respuesta
del sistema inmune.
21. Rutas de inoculación:
Mediante diferentes rutas de inoculación,
incluyendo intramuscular, intradérmica,
intravenosa, intraperitoneal, epidérmica
mediante escarificación de la piel, oral,
intranasal y vaginal.
Inoculación de DNA encapsulado en
microesferas y bacterias atenuadas de los
géneros Salmonella, Shigella y Vibrio. Estos
últimos ofrecen la posibilidad de generar una
respuesta inmune que proteja las mucosas
del tracto respiratorio y digestivo, que son el
principal sitio de entrada de patógenos.
http://revistamedicadelcaribe.files
.wordpress.com/2011/05/vacuna-
de-perros.jpg
http://www.wired.com/wired/archive/10.0
9/images/MF.GeneVaccine_f.jpg
22. Método a emplear:
la cantidad de DNA a inocular y las características
de la respuesta inmune que se desea obtener.
La administración de vacunas mediante agujas
requiere de 100 a 1000 veces más DNA que el
bombardeo de partículas para inducir una
respuesta inmune.
Las cantidades de DNA necesario van de 10 a 100
μg de DNA en inyecciones intramusculares en
ratones y hasta 1 mg en primates no humanos
para para inducir la aparición de anticuerpos y
linfocitos citotóxicos
23. Método a emplear:
Las dosis empleadas mediante bombardeo de
partículas van de 0.1 a 10 μg en ratones y de
0.1 a 100 μg en primates.
Una misma vacuna de DNA puede generar
respuestas cooperadoras de tipo Th1 o Th2 al
alterar el método y la ruta de inoculación.
24. bombardeo de partículas inyecciones
intramusculares
inducir una respuesta T
cooperadora de tipo Th2
caracterizada por la producción
de las interleucinas (IL) IL-4, IL-
5, IL-6 e IL-10;
inmunoglobulinas de la clase IgE
y subclases IgG1 que no se unen
al complemento y que en
conjunto combaten infecciones
parasitarias y en mucosas.
respuesta cooperadora hacia Th1
en la que se activan células
mediadoras de la respuesta
inmune celular, se generan
anticuerpos que pueden unirse al
complemento como IgG2a e
IgG2b, y citocinas como IL-2 e
interferón gamma (IFN-γ), lo cual
en conjunto permite el control
infecciones bacterianas
intracelulares y virales.
Método a emplear:
25. Mecanismos principales del proceso del antígeno
Transfección de células presentadoras de
antígeno :
se encuentran
presentes en pequeñas
cantidades en músculo
y que constituyen un
potente estímulo para
el sistema inmune.
Adicionalmente, se
conoce que pueden ser
transfectadas in vivo
por DNA para generar
una fuerte respuesta
por linfocitos T
citotóxicos
http://www.attendbio.com/img/transfeccion.png
26. Activación de la respuesta inmune por transfección
de células carentes de complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) de clase II:
El papel que éstas
células desempeñan lo
hacen a través de la
síntesis y secreción de
proteínas que aumenta
la magnitud de la
respuesta inmune
http://www.monografias.com/trabajos29/piel-estrias/Image928.gif
27. Activación cruzada:
Durante la activación cruzada, las APCs
introducen péptidos o proteínas
sintetizados por otras células, y los
presentan a linfocitos a través del MHC
clases I y II. Esto permite que las
células somáticas actúen como
reservorios de antígeno, contribuyendo
a aumentar la respuesta inmune hacia
la proteína transgénica.
La activación del sistema inmune por la
inyección de un vector plasmídico es
un proceso lento, en el que se detectan
anticuerpos a las dos semanas de
vacunación y se alcanza un máximo en
la respuesta alrededor de la semana 10
http://www.profesorenlinea.cl/imagenciencias/linfocitoT0
01.jpg
28. TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS VACUNAS EMPLEADAS EN LA
ACTUALIDAD Y SU COMPARACIÓN CON LAS VACUNAS DE DNA
29. TABLA 1. CARACTERÍSTICAS DE LAS VACUNAS EMPLEADAS EN LA
ACTUALIDAD Y SU COMPARACIÓN CON LAS VACUNAS DE DNA
30. las vacunas de DNA inducen una respuesta
duradera con una inoculación.
Las vacunas vivas y de DNA son unos de los
estímulos más potentes para la generación de
linfocitos citotóxicos presentados a través del
MHC tipo I y por lo tanto no inducen respuestas
por linfocitos citotóxicos necesarias para
combatir microorganismos intracelulares
31. Las vacunas de DNA se consideran seguras,
debido a que no involucran la inoculación de
microorganismos vivos que pudieran ser
peligroso en mujeres embarazadas e
individuos inmunocomprometidos o incluso
en individuos sanos debido a la posibilidad
de reversión a la forma virulenta del
microorganismo (Rabinovich et al., 1994).
32. Seguridad. no deben producir efectos
secundarios o causar enfermedad alguna.
Las vacunas de DNA carecen de este riesgo, y
tal vez la principal preocupación en términos
de seguridad sea la posibilidad de integración
del DNA al genoma del individuo, provocando
la activación de proto-oncogenes o
inactivación de genes supresores de tumores.
Hasta la fecha, se ha observado que el DNA
permanece en forma episomal, descartando la
posibilidad de integración genómica (Nichols et
al., 1995).
33. Métodos de inoculación. El método de aplicación
de ésta no debe de presentar riesgo alguno a
los individuos que la reciben o que la aplican.
La inmunización con DNA ha sido realizada
con éxito mediante administración oral, asi
como mediante pistolas genéticas, las cuales
se consideran también seguras.
34. Memoria inmunológica. generación de una
respuesta inmune duradera
las vacunas de DNA generan respuestas
capaces de durar toda la vida cuando se han
probado en ratonesse ha observado en la
respuesta humoral basada en anticuerpos, en
la generación de linfocitos T cooperadores y
de células T citotóxicas, para las cuales las
vacunas de DNA se consideran el más
potente estímulo.
35. Costos. La elaboración de vacunas tradicionales
requieren de una infraestructura costosa, por lo que
las formas alternativas que puedan reducir este
precio son siempre deseables
Las técnicas empleadas para
clonación de genes en nuevos
vectores para vacunación con
DNA son bastante simples,
rápidas.
son estables a temperatura
ambiente lo cual contribuye a
la disminución significativa de
los costos de producción
36. Las vacunas de DNA han sido probadas en
diferentes patologías incluyendo las vacunas
tradicionales, es decir infecciones virales y
bacterianas. Y se incluyen dentro del repertorio
de la vacunación con DNA las parasitarias,
micosis y enfermedades por priones.
su aplicación sea principalmente hacia
infecciones virales y por bacterias intracelulares,
incluso como tratamiento de enfermedades en
las que la vacunación no formaba parte del
repertorio empleado para el tratamiento como
cáncer, enfermedades autoinmunes y alérgicas
(Kowalczyk y Ertl, 1999).
37. Hasta la fecha, se han utilizado inmumerables
modelos animales como ratones, conejos,
cobayos, gallinas, gatos, primates no
humanos, etc. mostrando diferentes grados
de eficiencia en ellos.
Las infecciones contra las que se han
utilizado vacunas de DNA en ensayos clínicos
en humanos inluyen al Virus de la
Inmunodeficiencia Humana (MacGregor et al.,
1998) y malaria (Wang et al., 1998), entre
otros.
38. resultados que se han obtenido en modelos
animales son prometedores, sin embargo, los
resultados en humanos han sido
desalentadores.
estudios recientes demuestran en primates
no humanos que las vacunas de DNA
contribuyen en gran medida a la generación
de una respuesta protectora cuando se
utilizan en combinación con virus
recombinantes.
39. Vacunas: prevención de enfermedades y
protección de la salud. Ciro A. de Quadros.
Pan American Health Org, 2004
Arturo Reyes Sandoval1 , Aguinaldo R. Pinto2
1Programa Institucional de Biomedicina
Molecular Escuela Nacional de Medicina y
Homeopatía,Instituto Politécnico Nacional
Guillermo Massieu Helguera 239, Colonia La
Ecalera 07320, México, D.F. 1Instituto
Adolpho Lutz,Av. Dr. Arnaldo, 355, São Paulo
– SP,01046-902 ,Brasil