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La sécurité sanitaire des produits alimentaires est devenue l'une, sinon la première
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PRoBLématique
Suite à ses valeurs nutritionnels, le Lben est considéré l’une des boissons les plus
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D’accueiL
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I. Présentation de l’office national de sécurité sanitaire
des produits alimentaires (ONSSA)
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Afin d’assurer les missions qui lui sont dévolues, l'ONSSA dispose dans l'ensemble de ses s...
Tableau 1 : Les personnels de l’ONSSA
II. Présentation du laboratoire régional des analyses et
de recherches d’Agadir (LRA...
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PARTIE II :
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BIBlIogRAPhIquE
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I. Généralité sur Escherichia coli
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E. coli ou "colibacille" est une bactérie intestinale des mammifères très...
• Fermentant le glucose avec ou sans production de gaz.
• Réduisant les nitrates en nitrites.
• Oxydase négatif.
Le genre ...
a. Caractéristique morphologique.
E. coli est un bacille, donc de forme cylindrique (bâtonnets), gram négatif, uniformémen...
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I.3. Classification d’Escherichia Coli pathogènes.
Il est important de rappeler qu’il n’existe pas de classification stand...
Figure 4 : Les modes d'actions des grands pathovars de la bactérie Escherichia coli induisant des
diarrhées.
• E. coli ent...
• E. coli entéroinvasives (EIEC) :
Les EIEC sont responsables de syndromes dysentériques caractérisés par une forte fièvre...
I.4. La souche d’Escherichia coli O157 : H7
Le sérotype O157:H7 d'E. Coli est une forme mutante qui a acquis une toxine ex...
Certains ruminants tels les bovins, les chevreuils, les chèvres et les moutons, sont naturellement
porteurs d’E. Coli O157...
• Lait et produit laitiers :
Les produits laitiers sont à l’ origine de différents foyers épidémiques à E. Coli O157:H7 da...
I.6. Interaction entre E. coli et les bactéries lactiques dans le
petit lait :
Les bactéries lactiques regroupent un ensem...
II. Aperçu Sur Lben
1. Introduction
La fermentation du lait est utilisée depuis très longtemps pour prolonger sa conservat...
mouillage, puis d'un barattage, permettant de recueillir une part plus ou moins importante de
matière grasse sous forme de...
Tableau 6: Valeurs nutritives pour Lebn
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Composition Valeur nutritionnel en
1000g babeurre
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3.2. Microbiologique :
L’évolution des germes du babeurre dépend de la contamination initiale. En effet sous l’action des
...
Figure 7: Outre en peau de chèvre et Jarre en terre cuite pour la fermentation et le barattage du
Leben.
4.2. Le processus...
Figure 8 : Processus de fabrication traditionnel du Lben
vi. Intérêt nutritionnel et hygiénique
Les produits laitiers ferm...
Figure 9 : Diagramme causes – effets (5M), établir a la contamination du Leben à E. coli .
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PARTIE III :
ETudE
ExPéRImEnTAlE
PARTIE III :
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I. Matériels et méthodes.
1. Matériels.
I.1. Matériels de prélèvement.
Il est constitué d’une petite glacière contient tro...
2. Méthodes
2.1. Echantillonnage
Notre travail consiste à chercher E.Coli dans le babeurre traditionnel (crémeries) et ind...
 On laisse le mélange dans la température ambiante pendant 30 min.
Les étapes de préparation de l’échantillon sont présen...
 Pour l’ensemencement en masse, on prend 5 boites de Pétris pour chaque
échantillon : une pour la solution mère (SM) et q...
Figure 11 : Deuxième partie du protocole de recherche d’E. Coli.
[Génie Bio-Industriel] Page 41
2.3. Identification Par Galerie API.
a. Ensemencement de la douche test :
• On prend une colonie de la boite TBX dilution ...
 Pour les tubes qui sont marqués par des caractères ni soulignés, ni
encadrés. On Remplit seulement le tubule.
 Pour ceu...
II. Résultats et discussion
1. Résultats.
1.1. Dénombrement d’E. Coli.
La formule pour l’expression des résultats est la s...
8 <1
1.2. Résultats de L’ensemencement de la galerie.
a. La lecture des résultats :
La détermination de la positivité et l...
• Détermination du profil numérique :
Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur...
• Soit en utilise des clés d’identification.
• Soit on utilise la fiche de lecture API20E.
• Soit on utilise un catalogue ...
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[Génie Bio-Industriel] Page 49
[Génie Bio-Industriel] Page 50
Comme ca, on a obtenu les résultats figurant dans la fiche suivante :
Figure 14 : Fiche API20E d’E.coli de l’échantillon 5...
2. Discussions.
II.1. Dénombrement
a. Le babeurre traditionnel.
Tous les échantillons ont été contaminés par E. coli, avec...
A partir de l’autre test d’E. Coli, on constate que la bactérie isolée du Leben traditionnel fermente
le sorbitol et le sa...
ConClusion :
Le Lben marocain est un lait fermenté utilisé surtout comme boisson rafraîchissante
et apprécié pour ses qual...
BiBliographie.
• Analyse microbiologique dans les industries agroalimentaires.- Paris : Edition de l’usine
nouvelle.-239p....
• RRIGAN(W. F.) and Mc CANCE(Margaret E.) (1976). - Laboratory Methods in Food
and dairy Microbiology. Academie Press, Lon...
annexes
Annexe 1 : La gélose TSA
La gélose Trypto-caséine
soja (TSA) est un milieu universel
convenant pour un large évent...
Annexe 2 : La gélose TBX.
La gélose TBX est un milieu sélectif destiné au
dénombrement des Escherichia coli β-D-glucuronid...
Annexe 3 : Résultat du comptage des colonies d’E. Coli (colonies
vertes) obtenus après 24h incubation ; donne les résultat...
[Génie Bio-Industriel] Page 60
Annexe 4 : Critères microbiologique des produits laitiers.
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PFE : Recherche et identification d’Escherichia coli dans Leben marocain

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Projet de fin d’étude sous titre : Recherche et identification d’Escherichia coli dans Leben marocain

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PFE : Recherche et identification d’Escherichia coli dans Leben marocain

  1. 1. DéDicace Au nom de Dieu clément et miséricordieux Nous dédions ce modeste travail à : Nos Chers parents, pour leurs soutiens, patiences et leurs sacrifices durant nos études et durant ce projet. A tous nos enseignants, pour leur bienveillance et pour leur contribution à notre solide formation. A nos familles et nos amis pour leurs conseils et leurs encouragements. A tous ceux qui ont contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce travail, qu’ils trouvent ici la traduction de notre gratitude et de notre reconnaissance.
  2. 2. RemeRciement [Génie Bio-Industriel] Page 2 Avant d’entamer notre rapport, nous tenons à exprimer notre gratitude à toutes les personnes qui nous consacrés à leur temps et de leur énergie afin de faciliter le déroulement de notre projet de fin d’étude. Nous tenons à remercier Mr. le Directeur de l’Ecole, ainsi que notre chef de filière Mr. Nous exprimons notre respectueux dévouements à notre encadrant à l’école Mr., qui nous a encadré avec patience durant la réalisation de ce travail de fin d'études. Ainsi à Mr. de nous avoir autorisé d’effectuer notre projet dans le laboratoire qu’il gère. Nous adressons L’expression de notre haute reconnaissance à Mr. au et à l’équipe du laboratoire qui n’ont épargné aucun effort pour mettre à notre disposition la documentation et les explications nécessaires. Enfin, nos remerciements vont aux membres de notre Jury pour le temps et l’attention qu’ils ont bien voulu nous consacrer.
  3. 3. SommaiRe Remerciement.....................................................................................................................................2 Sommaire.............................................................................................................................................3 LISTE DES ABREVIATIONS ....................................................................................................................6 TBX : Gélose Tryptone Bile X-Glucuronide..........................................................................................6 Liste des tableaux ...............................................................................................................................7 Liste des figures...................................................................................................................................8 Introduction ........................................................................................................................................9 Problématique ..................................................................................................................................10 I. Présentation de l’office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires (ONSSA)......12 i. La création de l’ONSSA............................................................................................................12 ii. L’organigramme et les ressources humaines.........................................................................12 II. Présentation du laboratoire régional des analyses et de recherches d’Agadir (LRARA)...........15 1. La création de LRARA ............................................................................................................15 2. Les attributions et missions ...................................................................................................15 iii. L’organigramme du laboratoire (LRARA) .............................................................................15 I. Généralité sur Escherichia coli....................................................................................................18 1. Historique...............................................................................................................................18 2. Taxonomie..............................................................................................................................18 II. Aperçu Sur Lben.........................................................................................................................29 1. Introduction ...........................................................................................................................29 2. Définition du Leben:..............................................................................................................29 iv. Composition du babeurre : ...................................................................................................30 v. Processus de fabrication : ......................................................................................................32 [Génie Bio-Industriel] Page 3
  4. 4. vi. Intérêt nutritionnel et hygiénique.........................................................................................34 vii. Contamination de « Leben » par E. coli................................................................................34 I. Matériels et méthodes................................................................................................................37 1. Matériels................................................................................................................................37 Incubateur, autoclave, balance de précision, broyeur homogénéisateur stomacher, hotte à flux laminaire, pipettes jetables, tubes à essai, boîtes de Pétri, agitateur vortex, sachets stérile, baguettes d’étanchéité ..................................................................................................................37 2. Méthodes...............................................................................................................................38 II. Résultats et discussion ..............................................................................................................44 1. Résultats.................................................................................................................................44 Soit en utilise des clés d’identification..........................................................................................47 Soit on utilise la fiche de lecture API20E......................................................................................47 Soit on utilise un catalogue API20E après avoir compléter une petite feuille API20E.................47 Soit on utilise un logiciel dans lequel on entre les résultats obtenus..........................................47 Avec le catalogue analytique : les tests sont regroupes en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4) est indiquée pour chacun. Additionner a l’intérieur de chaque groupe les nombres correspondants aux tests positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification ...................47 Comme ca, on a obtenu les résultats figurant dans la fiche suivante : .......................................51 2. Discussions.............................................................................................................................52 Conclusion :.......................................................................................................................................54 D’autre part, le Leben industriel est conforme à 100% : il est prêt à être consommer grâce à la pasteurisation qu’il subit. Pour conclure, Nos choix alimentaires doivent consister sur des critères sages et inoffensifs. Puisqu’on peut consommer les mêmes caractéristiques organoleptiques et nutritionnelles, consommons donc cette boisson saine industrielle.....................................................54 Bibliographie......................................................................................................................................55 Annexes.............................................................................................................................................57 [Génie Bio-Industriel] Page 4
  5. 5. [Génie Bio-Industriel] Page 5
  6. 6. LiSte DeS aBReViationS ADH : Arginine Dihydrolase. Aw : Activité de l’eau. CIT : Citrate. °D : Dégréé Dornic. E. coli : Escherichia coli. EPT : Eau peptonée tamponnée. GEL : Gélatinase. H2S : Sulfure d'hydrogène. LRARVA : laboratoire régional des analyses et de recherches vétérinaires d’Agadir. LDC : La lysine décarboxylase. MRS: La gélose de Man,Ragosa,Sharpe. ODC : Ornithine Décarboxylase. ONPG: L'orthonitrophényl-β-galactoside. ONSSA : Office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires. pH: Potentiel d’hydrogène. SHU : Syndrome Hémolytique et Urémique. STEC : Shiga Toxine Escherichia Coli TBX : Gélose Tryptone Bile X-Glucuronide. TSA : Gélose Trypto-caséine soja. UFC : unité formant colonie. URE : Uréase. VP : Reaction de Voges Proskaueur. [Génie Bio-Industriel] Page 6
  7. 7. LiSte DeS taBLeaux Tableau 1 : Les personnels de l’ONSSA.............................................................................................15 Tableau 2 : Les caractéristiques biochimiques du Genre Escherichia...............................................20 Tableau 3 : Caractéristiques de croissance d’E. Coli O157:H7..........................................................26 Tableau 4: Résultats des études concernant la recherche des E. coli 0157 (1995-1999) dans divers matrices alimentaires..........................................................................................................27 Tableau 5 : l'analyse physico-chmique classique du lben marocain.................................................30 Tableau 6: Valeurs nutritives pour Lebn...........................................................................................31 Tableau 7 : Tableau de lecture de la galerie API20E.........................................................................45 [Génie Bio-Industriel] Page 7
  8. 8. LiSte DeS figuReS Figure 1 : L'organigramme de l’ONSSA à l’échelle national..............................................................14 Figure 2 : L'organigramme de LRARA................................................................................................16 Figure 3 : Morphologie et structure de la bactérie E. coli.................................................................20 Figure 4 : Les modes d'actions des grands pathovars de la bactérie Escherichia coli induisant des diarrhées.................................................................................................................................................23 Figure 5 : Positionnement des EHEC au sein de l’espèce E. coli.......................................................25 Figure 6: Processus de fabrication traditionnel du Lben...................................................................29 Figure 7: Outre en peau de chèvre et Jarre en terre cuite pour la fermentation et le barattage du .................................................................................................................................................................33 Figure 8 : Processus de fabrication traditionnel du Lben..................................................................34 Figure 9 : Diagramme causes – effets (5M), établir a la contamination du Leben à E. coli .............35 Figure 10 : première partie du protocole de recherche d’E. Coli......................................................39 Figure 11 : Deuxième partie du protocole de recherche d’E. Coli....................................................41 Figure 12 : L’ensemencement de la galerie API 20E.........................................................................43 Figure 13 : L’aspect de la galerie contenant E. Coli du 5eme échantillon après Incubation............46 Figure 14 : Fiche API20E d’E.coli de l’échantillon 5...........................................................................51 [Génie Bio-Industriel] Page 8
  9. 9. intRoDuction La sécurité sanitaire des produits alimentaires est devenue l'une, sinon la première préoccupation des consommateurs, particulièrement dans les pays industriels. C'est pour cela, des stratégies sont élaborées visant à assurer cette sécurité, par la maitrise de l’hygiène au cours de la chaine de production. Ces stratégies permettent aussi de réduire le taux des intoxications alimentaires, notamment celles d'origine microbiologique. Tout aliment peut provoquer des intoxications et les produits laitiers n’y font pas exception. Les animaux producteurs de lait véhiculent des germes qui veut être pathogènes ou offensives, est comme titre d'exemple Escherichia coli qui est recherché dans le cadre des analyses obligatoire car elle peut être pathogène et elle peut nous amener à des conséquences graves; Comme il peut être un indicateur de contamination fécale et possible un index de présence des microorganismes pathogènes. En outre, la composition des aliments à base de lait comme ‘’Leben’’, constituent un milieu favorable au développement de micro-organismes pathogènes. Et l'un des effets les mieux connus de ces bactéries contaminants nos aliments est la dégradation de la qualité hygiénique et la qualité marchande du produit. Dans ce cadre précis se situe l’objectif de notre étude où nous avons préalablement fixé comme but, la recherche et l’identification d’Escherichia coli dans le babeurre traditionnel appelé communément « Lben ». En Comparant ce dernier au Leben industriel. Notre présente étude est répartie en deux volumes, dont le premier a été consacré à une synthèse bibliographique relative à E. coli et au babeurre, tandis que le second a été réservé à la partie expérimentale qui englobe le matériel utilisé et les méthodes suivies, ainsi que les résultats qui seront par la suite discutés. [Génie Bio-Industriel] Page 9
  10. 10. PRoBLématique Suite à ses valeurs nutritionnels, le Lben est considéré l’une des boissons les plus consommables au Maroc, soit le Lben traditionnel ou industriel. Mais le consommateur n’est pas conscient que ce produit agréable donne un milieu propice à la prolifération de microbes, comme E. coli, qui est recherchée dans le cadre des analyses obligatoires pour l’autocontrôle dans le cadre d’une production industriel qui respecte les règles d’hygiène .Car cette bactérie peut impliquer des intoxications alimentaires mortelles. Par conséquent, la problématique posée par notre étude peut être résumée par la question suivante : • Est ce que Escherichia coli existe dans le Lben étant industriel ou semi industriel ? [Génie Bio-Industriel] Page 10
  11. 11. PaRtie i : PRéSentation De L’étaBLiSSement D’accueiL PaRtie i : PRéSentation De L’étaBLiSSement D’accueiL [Génie Bio-Industriel] Page 11
  12. 12. I. Présentation de l’office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires (ONSSA) i. La création de l’ONSSA Le plan Maroc vert est une stratégie visant l'amélioration de la productivité et de la compétitivité des produits agricoles et agro- alimentaires. Parmi les objectifs tracés par cette stratégie : • Améliorer la qualité des produits agricoles. •Garantir la sécurité sanitaire des produits alimentaires tout au long de la chaine alimentaire. • Améliorer la compétitivité des agricoles et agro-alimentaires. • Consolider la confiance du consommateur dans la fiabilité du système d’inspection et de contrôle des produits alimentaires. Pour atteindre ces objectifs, la création de l’office national de sécurité sanitaire des produits alimentaires (ONSSA) est venue en tant qu’outil de mise en œuvre du plan Maroc vert (lois25-08). L’ONSSA est une structure d'encadrement, d'inspection et de certification qui permettra de garantir d'une manière continue la salubrité et la qualité des produits alimentaires et la sécurité du consommateur. ii. L’organigramme et les ressources humaines 2.1. L’organigramme : Le schéma ci-dessous représente l’organigramme de l’ONSSA. [Génie Bio-Industriel] Page 12
  13. 13. [Génie Bio-Industriel] Page 13
  14. 14. 2.2. Les ressources humaines : Afin d’assurer les missions qui lui sont dévolues, l'ONSSA dispose dans l'ensemble de ses services aussi bien au niveau central, régional que provincial d'un capital humain réparti comme suit : [Génie Bio-Industriel] Page 14 Catégorie Total Ingénieurs 289 Médecins vétérinaires 291 Administrateurs et assimilés 83 Agent de maîtrise 926 Agents d'appui 654 Total 2243 Figure 1 : L'organigramme de l’ONSSA à l’échelle national.
  15. 15. Tableau 1 : Les personnels de l’ONSSA II. Présentation du laboratoire régional des analyses et de recherches d’Agadir (LRARA) 1. La création de LRARA Le LRARVA a été crée en 1980 pour couvrir les besoins de la zone de sud du Maroc en matière d'analyse et contrôle de qualité des produits agro-alimentaires, halieutiques et santé animale. Après une période de formation du personnel et la mise en place des équipements, le laboratoire a démarré ses activités techniques en 1985. En 2010 le LRARVA est converti à l’ONSSA(LRARA) . Il fait partie des laboratoires régionaux qui s’occupent du diagnostic, d’analyses épidémiologiques et de contrôle des denrées alimentaires animales et végétales. 2. Les attributions et missions Les principales missions de LRARA sont : • Contrôle et analyse des produits agro- alimentaire • Le diagnostic des maladies animales, • L’analyse des produits animaux et d’origine animale ainsi que l’alimentation du bétail, • La réalisation d’enquêtes épidémiologiques, • Le contrôle de l’utilisation des produits pharmaceutiques et biologiques vétérinaire. iii. L’organigramme du laboratoire (LRARA) Le laboratoire ONSSA est structuré en plusieurs directions et services qui suivent une hiérarchisation présentée dans la figure suivante : [Génie Bio-Industriel] Page 15
  16. 16. [Génie Bio-Industriel] Page 16 Figure 2 : L'organigramme de LRARA
  17. 17. PARTIE II : ETudE BIBlIogRAPhIquE PARTIE II : ETudE BIBlIogRAPhIquE [Génie Bio-Industriel] Page 17
  18. 18. I. Généralité sur Escherichia coli 1. Historique E. coli ou "colibacille" est une bactérie intestinale des mammifères très commune chez l’Homme. Découverte en 1885 par Théodore Escherichia, c’est un coliforme fécal généralement commensal, non pathogène. Plus de 95 % des souches d’E. Coli ne sont pas dangereuses et nous en avons besoin pour vivre. Théodore Escherichia, en observant la fréquence des diarrhées néonatales chez l’Homme, avait déjà posé la question de l’implication du colibacille dans les entérites. Après la seconde guerre mondiale, les connaissances ont convergé pour établir le concept de virulence de certaines souches d’E. Coli. Dans les années 1950, de nombreuses souches d’E. Coli ont été incriminées en tant qu’agent étiologique de diarrhées infantiles chez l’Homme et des diarrhées, gastro- entérites, infections urinaires, méningites, septicémies, etc. chez l’animal. 2. Taxonomie I.1. Les entérobactéries Les entérobactéries sont une famille très hétérogène pour ce qui est de leur pathogénie et de leur écologie. Les espèces qui composent cette famille sont en effet soit parasites (Shigella, Yersinia pestis), soit commensales (Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella sp), soit encore saprophytes (Serratia sp, Enterobacter sp). La famille des entérobactéries se définit par les caractères suivants : • Bacilles à Gram négatif. • Mobiles avec ciliature péritriche ou immobiles. • Poussant sur milieux de culture ordinaires. • Aérobies - anaérobies facultatifs. [Génie Bio-Industriel] Page 18
  19. 19. • Fermentant le glucose avec ou sans production de gaz. • Réduisant les nitrates en nitrites. • Oxydase négatif. Le genre Escherichia regroupe cinq espèces : E. blattae, E. coli, E. fergusonii, E. hermanii et E. vulneris. Chaque espèce d’Escherichia possède des caractéristiques biochimiques particulières, permettant de les différencier. Escherichia coli fait partie de la microflore commensale intestinale de l’homme et de nombreux animaux à sang chaud. Il représente près de 80% de la microflore intestinale. Pour cette raison Escherichia coli est recherché dans les aliments comme indicateurs de contamination fécale ; sa présence fournit ainsi une indication sur une éventuelle contamination de l’aliment par des bactéries pathogènes d’origine intestinale (e.g.Salmonella thyphimurium, E. coli O157:H7…). I.2. L’espèce Escherichia coli. Escherichia coli est un coliforme fécal généralement commensal, non pathogène, vivant sur la peau et les muqueuses sans nuire l’hôte qui l’héberge. En outre, bien que la majorité des souches d’E. Coli soient commensales, certaines d’entre elles sont associées à des pathologies intestinales ou extra-intestinales très diverses chez l’homme. Comme la plupart des pathogènes des muqueuses, les souches d’E. Coli pathogènes utilisent une stratégie d'infection dont les points clés sont la colonisation des muqueuses, éventuellement l’invasion des cellules, la multiplication, l’évasion des défenses de l’hôte et les dommages à l’hôte. La classification des colibacilles est la suivante : • Règne : Procaryota • Domaine : Bacteria • Phylum : Proteobacteria • Classe : Gammaproteobacteria • Ordre : Enterobacteriales • Famille : Enterobacteriaceae • Genre : Escherichia • Espèce : Escherichia coli [Génie Bio-Industriel] Page 19
  20. 20. a. Caractéristique morphologique. E. coli est un bacille, donc de forme cylindrique (bâtonnets), gram négatif, uniformément coloré, non sporulé, de 2μm à 3μm de long sur 0.7μm de large. Il se présente soit seul ou groupé le plus souvent par deux (diplobacilles), très rarement ils sont rencontrés en amas. Ils sont mobiles grâce à une ciliature péritriche (Figure 4). Figure 3 : Morphologie et structure de la bactérie E. coli Source : http://reflexions.ulg.ac.be/cms/c_43025/escherichia-coli b. Caractères biochimiques. Tableau 2 : Les caractéristiques biochimiques du Genre Escherichia. [Génie Bio-Industriel] Page 20
  21. 21. [Génie Bio-Industriel] Page 21
  22. 22. I.3. Classification d’Escherichia Coli pathogènes. Il est important de rappeler qu’il n’existe pas de classification standardisée des souches appartenant à l’espèce E. coli. Les scientifiques utilisent une classification basée sur la pathogénie des syndromes diarrhéiques comprenant 5 groupes (Figure 5) : [Génie Bio-Industriel] Page 22 Caractéristique Réaction Méthyle + désaminase - VP - lactose + ONPG + Mannitol + Uréase - Indole + Citrate - Acétoine - H2S - saccharose + salicine + LDC +
  23. 23. Figure 4 : Les modes d'actions des grands pathovars de la bactérie Escherichia coli induisant des diarrhées. • E. coli entérotoxigéniques (ETEC) : Les ETEC sont une cause majeure de diarrhée aqueuse aiguë avec déshydratation chez les enfants de bas âge (moins de 3 ans) dans les pays en voie de développement, et sont aussi responsables de la « diarrhée des voyageurs » appelée aussi « turista ». Des ETEC sont également une cause fréquente de diarrhées néonatales souvent fatales chez des animaux d’élevage (veau, mouton, porcelet). [Génie Bio-Industriel] Page 23
  24. 24. • E. coli entéroinvasives (EIEC) : Les EIEC sont responsables de syndromes dysentériques caractérisés par une forte fièvre, des crampes abdominales et des nausées, accompagnés d’une diarrhée aqueuse qui évolue rapidement en une dysenterie. Les EIEC Sont des caractères biochimiques, antigéniques, génétiques et fonctionnels très proches de ceux des Shigella, et mettent en œuvre un mécanisme de pathogénicité similaire. • E. coli Entéropathogènes (EPEC) : Les EPEC sont responsables de diarrhées infantiles. Lors d’infections apparaissent des lésions histopathologiques particulières, appelées lésions d’attachement et effacement (lésions A/E). Ce phénotype est caractérisé par l’effacement des microvillosités intestinales et par l’adhérence intime entre les bactéries et la membrane cytoplasmique des entérocytes. • E. coli Entéroaggrégatifs (EAEC) : Elles présentent un phénotype d’adhésion aux cellules Hep-2 proche de celui des EPEC mais toutefois différent puisqu’il s’agit d’une adhérence non pas localisée mais diffuse. En revanche, ces souches ne produisent aucune entérotoxine. Les EAEC sont de plus en plus reconnus comme étant responsables de retards de croissance et de diarrhées persistantes dans les pays en voie de développement ainsi que les pays industrialisés. • E. coli Enterohémorragiques (EHEC) : Ils sont à l’origine de troubles plus ou moins sévères allant d’une « simple » diarrhée peu hémorragique à des colites hémorragiques, voire à un Syndrome Hémolytique et Urémique (SHU) chez l’enfant ou à un Purpura Thrombotique et Thrombocytopénique (PTT) chez l’adulte, pouvant conduire parfois à la mort du patient. La transmission à l'homme se fait avant tout par la consommation d'aliments (viande, légumes ou fruits crus ainsi que produits à base de lait cru), ou d'eau de table contaminée et par le contact avec de l'eau de baignade contaminée, mais aussi par contact direct avec des sécrétions corporelles (excréments) provenant d'animaux ou d'humains infectés. Parmi ces derniers, la souche E. coli O157 : H7, la plus fréquemment rencontrée dans les pathologies. [Génie Bio-Industriel] Page 24
  25. 25. I.4. La souche d’Escherichia coli O157 : H7 Le sérotype O157:H7 d'E. Coli est une forme mutante qui a acquis une toxine extrêmement puissante d'une autre bactérie : Shigella dysenteriae. La classification d’E. Coli O157 :H7 la plus utilisée par les microbiologistes est fondée en grande partie sur les travaux de Kauffman (1947) et se base sur la détermination : •Du sérogroupe, identifié par rapport aux antigènes somatiques O. •Du sérotype, identifié au sein du sérogroupe par rapport aux antigènes d’autres structures présentes à la surface des bactéries. Il s’agit essentiellement des antigènes H du flagelle (56 antigènes différents), cette variante est identifié par l’antigène numéro7. Figure 5 : Positionnement des EHEC au sein de l’espèce E. coli. I.5. Les sources d’Escherichia Coli O157 : H7 Ce n'est qu'à partir de 1982 que deux épidémies de colites hémorragiques dues à une infection a E. coli O157:H7 aux Etas Unis dues à la consommation de hamburger qu'on a commencé a s'intéresse aux E. coli O157:H. Les Sources d’Escherichia Coli O157 : H7 sont avant tout les produits d'origine animale avec en premier lieu les steaks haches de bœufs insuffisamment cuit, les produits laitiers, les ovo-produits mais également les produits d'origine végétale (laitues, pomme de terre, concombre...) [Génie Bio-Industriel] Page 25
  26. 26. Certains ruminants tels les bovins, les chevreuils, les chèvres et les moutons, sont naturellement porteurs d’E. Coli O157:H7 dans leur organisme. Toutefois, les bovins sont considérés, à l’échelle mondiale, comme les sources principales d’E. Coli O157:H7. En effet, de nombreuses études ont démontré une présence fréquente d’E. Coli O157:H7 chez les bovins laitiers et le bétail de boucherie, et aussi le fait qu’on retrouve ce sérotype chez ces animaux et dans leur entourage dans la plupart des pays du monde. E. Coli O157:H7 n’est pas une cause de maladie pour les bovins, de sorte que la plupart des agriculteurs ignorent si leurs animaux en sont porteurs ou non. Le pathogène vit dans le tractus intestinal des animaux et contamine l’environnement par l’intermédiaire du fumier. C’est pourquoi le bétail est considéré comme un réservoir et une source d’infection majeurs, même si différents aliments (et sources d’eau) ont souvent un rôle à jouer dans les éclosions d’infections par E. coli chez l’être humain. Le tableau suivant présente les caractéristiques de croissance de la majeure partie des souches d’E. coli O157:H7, le sérotype le plus étudié. Tableau 3 : Caractéristiques de croissance d’E. Coli O157:H7 [Génie Bio-Industriel] Page 26 Paramètre Croissa nce Optimum extrême Température (°C) 40 (6 - 45,5) pH (6 - 7) (4,4 – 9) aw 0,995 0,95 NaCl (%) 0 8,5
  27. 27. • Lait et produit laitiers : Les produits laitiers sont à l’ origine de différents foyers épidémiques à E. Coli O157:H7 dans le monde depuis plusieurs années. La voie de contamination du lait actuellement retenue est celle de la contamination à partir des matières fécales de bovins lors de la traite, même si certaines études suggèrent l'existence possible d'une voie de contamination du lait avant la traite. Depuis 1995, des plans de surveillance ont été mis en place par la Direction générale de l’alimentation. Ils concernent principalement la recherche d’E. Coli O157:H7 dans des aliments considérés comme sensibles, comme par exemple, les steaks hachés de bœuf ou les fromages au lait cru. Dans ce contexte, les méthodes bactériologiques ont été utilisées pour la recherche et l’identification de colonies d’E. Coli O157:H7.Les résultats de ces plans de surveillance et des différents travaux publiés sont présentés dans le tableau suivant : Tableau 4: Résultats des études concernant la recherche des E. coli 0157 (1995-1999) dans divers matrices alimentaires. Période d’étude Matrice testes Nombre échantillo n Méthodes utilisés Résultats obtenus Juin 1995 Fromage au lait cru 140 VIDAS Absence Février à avril 1997 Steaks hachée réfrigère 90 VIDAS E.coli O157 : H7 Février 1998 Fromage lait cru (brebis, chèvre, vache) 519 DYNAL ou VIDAS 14 souches E.coli O157 : H7 (7 sans facteurs de virulence) [Génie Bio-Industriel] Page 27
  28. 28. I.6. Interaction entre E. coli et les bactéries lactiques dans le petit lait : Les bactéries lactiques regroupent un ensemble d’espèces hétérogènes dont le trait commun est la production d’acide lactique. Elles appartiennent à divers genres comme Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus, Alloicoccus et Carnobacterium. Elles interviennent dans l’industrie laitière et dans la fermentation de nombreux autres produits alimentaires (saumurage des légumes, boulangerie, fabrication du vin…).Elles contribuent à la texture, à la saveur des aliments et à la production de composés aromatiques. Elles fermentent les glucides en acide lactique, d’où une diminution du pH favorable à la conservation des aliments. Leur pouvoir antagoniste résulte aussi d’une compétition pour les substrats et, si les conditions de développement sont favorables ; de l’élaboration de bactériocines comme la nisine. a. L’activité antagoniste des bactéries lactiques. L’effet inhibiteur des bactéries lactiques est du a plusieurs mécanismes : • La production d'acides organiques (acide lactique, acétique), de peroxyde d'hydrogène, et de bactériocines limitent le développement des entérobactéries. • les souches peuvent inhiber l'implantation des germes pathogènes par compétition. • Ces probiotiques peuvent également produire des métabolites susceptibles de neutraliser certains toxines bactériennes. • Certaines souches ont la capacité de déconjuguer les sels biliaires qui sont alors plus inhibiteurs sur le développement des bactéries pathogènes. [Génie Bio-Industriel] Page 28
  29. 29. II. Aperçu Sur Lben 1. Introduction La fermentation du lait est utilisée depuis très longtemps pour prolonger sa conservation. En fait, toutes les populations humaines pratiquant l'élevage ont su développer des modes traditionnels de fermentation du lait de leurs troupeaux (vaches ou autres), d'où une panoplie impressionnante de produits laitiers fermentés, dont certains sont maintenant fabriqués industriellement. En plus d'être plus faciles à conserver, ces produits sont également plus digestes que le lait d'origine et leurs qualités organoleptiques sont très appréciés. L'une des caractéristiques communes à toutes les transformations des produits laitiers, est la coagulation du lait. Celle-ci provient d'une déstabilisation de la caséine, principale protéine du lait. Elle peut être obtenue de deux manières: par acidification ou par action enzymatique (présure). Cette coagulation donne lieu à la formation d'un gel qui peut être consommé directement (laits fermentes) ou préalablement égoutté afin d'éliminer une partie de l'eau (fromages). Figure 6: Processus de fabrication traditionnel du Lben. 2. Définition du Leben: Le Lben marocain est une boisson préparée par fermentation spontanée du lait cru jusqu'à coagulation (ou bien par l’ajout des ferments sélectifs dans le processus industriel) , suivie d'un léger [Génie Bio-Industriel] Page 29
  30. 30. mouillage, puis d'un barattage, permettant de recueillir une part plus ou moins importante de matière grasse sous forme de beurre dit « beldi » iv. Composition du babeurre : 3.1. Physico-chimique : Lebn est une excellente source de riboflavine (Vitamine B2). Il est riche en acide lactique et pauvre en gras. Il contient du zinc, de l'acide pantothénique, de la niacine ainsi que de la thiamine. a. Extrait sec : L’extrait sec ou la matière sèche du babeurre désigne tous ses constituants autres que l’eau. Il doit être au moins égal à l’extrait sec d’un lait normal. c. Matière grasse : Le taux de matière grasse va dépendre du type de lait mis en œuvre pour préparer le babeurre (leben). En d’autres termes, ce taux varie selon qu’on a utilisé du lait écrémé ou non. Tableau 5 : l'analyse physico-chmique classique du lben marocain d. Acidité du Lben : Cette acidité résulte de la production d’acides organiques, en particulier d’acide lactique par les bactéries lactiques. La quantité d’acide lactique libre contenue dans le lait fermenté ne doit pas être supérieure à 0,8g pour 100g de lait fermenté lors de la vente au consommateur. [Génie Bio-Industriel] Page 30
  31. 31. Tableau 6: Valeurs nutritives pour Lebn [Génie Bio-Industriel] Page 31 Composition Valeur nutritionnel en 1000g babeurre pH 4.4 Acidité 75°D Eau 908 Protéines, g 34,3 Matière grasse, g 5,78 -Saturés, g 3,60 -Mono-insaturés, g 1,67 -Polyinsaturés, g 0,22 -Cholestérol, mg 69 Glucides, g 49,0 Calcium, mg 1184 Potassium, mg 1592 Phosphore, mg 933 Sodium, mg 517 Magnésium, mg 110
  32. 32. 3.2. Microbiologique : L’évolution des germes du babeurre dépend de la contamination initiale. En effet sous l’action des microorganismes, l’acidification du lait permettait une protection contre le développement de la flore pathogène d’une part et l’amélioration de la qualité organoleptique d’autre part. Il sera nécessaire d’avoir une connaissance de la fermentation lactique pour maîtriser les bactéries responsables, car elles peuvent entraîner des effets indésirables aboutissant à l’altération du produit ou le rendant impropre à la consommation. Les streptocoques lactiques et les Leuconostoc sont les principaux groupes responsables de l'acidification du lait au cours de sa transformation en Leben. Les espèces les plus importantes sont Streptococcus lactis, S. diacetylactis, Leuconostoc lactis et L. cremoris. Les lactobacilles, très faiblement représentés, ne semblent pas jouer un rôle important dans l'élaboration du Leben. v. Processus de fabrication : 4.1. Le processus traditionnel : Sa préparation, très simple, est demeurée au stade familial ou artisanal : le lait est abandonné à lui-même dans une jarre en terre cuite ou une outre en peau de chèvre jusqu'à sa coagulation. Celle- ci se fait à température ambiante et dure 24 à 48 h suivant la saison. Le barattage qui lui succède est réalisé soit dans l'outre, qu'un manipulateur doit secouer énergiquement avec les deux mains, soit dans une jarre, en utilisant un instrument constitué d'un manche long portant à son extrémité inférieure deux disques en bois de diamètres différents. Dans un cas comme dans l'autre, cette opération dure 30 à 40 min. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10 % du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre. Celui-ci est récupéré, généralement à la main, mais certains fabriquant filtrent le babeurre sur une toile, dans le but de recueillir le maximum de beurre (beldi), produit de grande valeur marchande. [Génie Bio-Industriel] Page 32
  33. 33. Figure 7: Outre en peau de chèvre et Jarre en terre cuite pour la fermentation et le barattage du Leben. 4.2. Le processus semi-industriel : C’est une combinaison entre les deux processus : traditionnel et industriel Se base sur l’utilisation des machines automatique pour le barattage avec une fermentation et coagulation spontanées, par fois sur un barattage automatique en utilisant des ferments sélections 4.3. Le processus industriel : En battant le beurre, la matière grasse s’agglomère en une masse compacte et se sépare du babeurre liquide. Le beurre formé à partir de crème acidifiée par des bactéries lactiques donne du babeurre acidulé. Si la crème douce est battue en beurre, on obtient du babeurre doux. Ce dernier est acidifié a posteriori ou réutilisé pour fabriquer des denrées alimentaires. Dans le commerce, on ne trouve presque que du babeurre acidulé. La pasteurisation permet d’accroître la durée de conservation du produit. La date limite de consommation figure sur l’emballage. La figure suivante montre le diagramme de fabrication du Leben Industriel (babeurre) [Génie Bio-Industriel] Page 33
  34. 34. Figure 8 : Processus de fabrication traditionnel du Lben vi. Intérêt nutritionnel et hygiénique Les produits laitiers fermentés ajoutent leurs propriétés aux qualités nutritionnelles du lait utilisé, il y a probablement un accroissement de la valeur biologique du lait suite à l’hydrolyse des glucides de lait. En outre le Leben favorise un bon équilibre de la flore intestinale chez l’enfant à bas âge. L’acidification résultante de l’action d’enzymes hydrolytiques, constitue un atout majeur en point de vue hygiénique. En effet, elle prévient la croissance de la plupart des germes pathogènes et assure par des moyens très simples, la conservation du lait. vii. Contamination de « Leben » par E. coli L'origine des contaminations par E. coli varie en fonction de la nature du produit et de son mode de production et de transformation. La contamination du lait et des produits laitiers par les germes pathogènes peut être d'origine endogène, et elle fait alors suite à une excrétion mammaire de l'animal malade .Elle peut aussi être d'origine exogène, il s’agit alors d’un manque d'hygiène lors de la traite du lait. Soit par un contact direct avec des troupeaux infectés, soit d'un apport de l'environnement (eaux, personnel). Le diagramme suivant donne les causes possibles de la contamination du babeurre par E. Coli : [Génie Bio-Industriel] Page 34
  35. 35. Figure 9 : Diagramme causes – effets (5M), établir a la contamination du Leben à E. coli . [Génie Bio-Industriel] Page 35
  36. 36. PARTIE III : ETudE ExPéRImEnTAlE PARTIE III : ETudE ExPéRImEnTAlE [Génie Bio-Industriel] Page 36
  37. 37. I. Matériels et méthodes. 1. Matériels. I.1. Matériels de prélèvement. Il est constitué d’une petite glacière contient trois outres de CO2 congelé pour le transport des bouteilles des échantillons. I.2. Matériels de dénombrement. a. Matériels de laboratoire. Incubateur, autoclave, balance de précision, broyeur homogénéisateur stomacher, hotte à flux laminaire, pipettes jetables, tubes à essai, boîtes de Pétri, agitateur vortex, sachets stérile, baguettes d’étanchéité b. Matériels biologique. Milieu TBX, milieu EPT. I.3. Matériels de L’identification biochimique. a. Matériels de laboratoire : incubateur pipette pasteur, bec bunsen, boites de pétri, couvercle. b. Matériels biologique : Milieu TSA, galerie Api, Eau distille stérile, Huile de paraffine. [Génie Bio-Industriel] Page 37
  38. 38. 2. Méthodes 2.1. Echantillonnage Notre travail consiste à chercher E.Coli dans le babeurre traditionnel (crémeries) et industriel. Pour ce fait, nous avons prélevé 7 échantillons comme il est détaillé dans le tableau suivant : Echantillon Genre Zone/Marque 1 Semi-Industriel Lbatoire 2 Dcheira 3 Inezgane 4 Ait Melloul 5 Tikiouine 6 Industriel Silda 7 Jaouda 8 Central laitier 2.2. Dénombrement d’E. Coli. a. Préparation de l’échantillon.  Dans des sachets stérile et sous la hotte on met 25,5 de l’échantillon et après on ajoute l’EPT jusqu'à 255 ml. Après on ferme les sachets par les baguettes et on les mets dans le stomacher pour bien homogénéiser le mélange.  On utilise L’EPT pour la dilution et en même temps pour activer les bactéries qui sont en stress. [Génie Bio-Industriel] Page 38 25,5 de l’échantillon + 229,5 de EPT =255ml
  39. 39.  On laisse le mélange dans la température ambiante pendant 30 min. Les étapes de préparation de l’échantillon sont présentées dans la figure suivante : Figure 10 : première partie du protocole de recherche d’E. Coli. b. Préparation des dilutions et le collage des boites.  Après l’incubation on prend 1ml de l’échantillon et on ajoute 9 ml de EPT (pour avoir la dilution 2) on prend 1ml du tube de la dilution 2 en on ajoute 9ml(on répète la même chose jusqu'à la dilution 4). [Génie Bio-Industriel] Page 39 Echantillon 25,5ml Incubation pendant 30 min à 37°C. Dilution 10-1 229,5ml (Vt=255 ml) Première dilution. EPT
  40. 40.  Pour l’ensemencement en masse, on prend 5 boites de Pétris pour chaque échantillon : une pour la solution mère (SM) et quartes pour les dilutions : 10-1 ,10- 2 ,10-3 et 10-4 .  Après le marquage des boites, on verse 1 ml de chaque tube des dilutions et de chaque solution mère ; dans chaque boite correspondante.  On ajoute une quantité du milieu TBX.  Toutes ces manipulations sont faites dans une hotte à flux laminaire.  Après solidification et refroidissement des boites, on les met s’incuber dans l’étuve à température 44°C pendant 24 heures. Les étapes de dénombrement sont présentées dans la figure suivante : [Génie Bio-Industriel] Page 40 1ml 1ml 1ml Dilution 10-1 d 10-2 d 10-3 d 10-4 1ml 1ml 1ml 1ml d 10-1 d 10-2 d 10-3 d 10-4 1ml Gélose TBX (solution mère) (Incubation pendant 24h a 44°C)
  41. 41. Figure 11 : Deuxième partie du protocole de recherche d’E. Coli. [Génie Bio-Industriel] Page 41
  42. 42. 2.3. Identification Par Galerie API. a. Ensemencement de la douche test : • On prend une colonie de la boite TBX dilution 10-4 , car les colonies sont très claires et peu nombreux. • On fait l’isolement par stries, dans une boite de la gélose TSA. • Apres On Incube la boite à 44°C pendant 24h. • Apres Incubation, On préparé 5ml d’un tube d’eau distillée stérile. • On prélève une colonie bien isolée sur le milieu TSA. • En fin, on réalise une suspension bactérienne en homogénéisant soigneusement les bactéries dans le milieu. b. Préparation de la galerie. • On met de l’eau distillée sur le fond de la boîte (partie alvéolée), toutes les alvéoles doivent être remplies, en éliminant l’excès d’eau en renversant la boîte au dessus de l’évier. • Placer la galerie sur le fond de la boîte elle doit être manipulée avec la pince. • Recouvrir la boîte avec son couvercle. • Inscrire nom, référence souche, date et température d’incubation sur la languette latérale de la boîte. c. Inoculation de la galerie • On Introduit la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, pointe en appuyant à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles.et on distingue 3 types de remplissage: [Génie Bio-Industriel] Page 42
  43. 43.  Pour les tubes qui sont marqués par des caractères ni soulignés, ni encadrés. On Remplit seulement le tubule.  Pour ceux qui ont marques par caractères soulignés. On Remplit seulement le tubule et on le fermer avec 3 gouttes d’huile de paraffine (ADH, LDC, ODC, H2S, URE).  Enfin pour les tubes qui sont marqués par des caractères encadrés. On Remplit le tubule et La cupule (CIT, VP, GEL). • On refermer la boîte d’incubation et on la place dans l’étuve à 37° C pendant 24 heures. Les figures suivantes démontrent le mode de remplissage des tubes, les parties de ces derniers et l’aspect de la galerie après remplissage. Figure 12 : L’ensemencement de la galerie API 20E. [Génie Bio-Industriel] Page 43
  44. 44. II. Résultats et discussion 1. Résultats. 1.1. Dénombrement d’E. Coli. La formule pour l’expression des résultats est la suivante : ΣC N = V (n1 + 0,1 n2) d N : Nombre de germes /ml ΣC: Somme des colonies comptées sur toutes les boîtes retenues de deux dilutions successives V : volume de l’inoculum appliqué à chaque boîte (en ml) n1 : Nombre de boîtes retenues à la première dilution n2 : Nombre de boîtes retenues à la deuxième dilution d : Taux de dilution de la première boîte retenue. Donc, les résultats finaux seront comme suite : Echantillons Nombre d’UFC par ml 1 9.105 2 9.104 3 6.104 4 9.102 5 4.105 6 <1 7 <1 [Génie Bio-Industriel] Page 44
  45. 45. 8 <1 1.2. Résultats de L’ensemencement de la galerie. a. La lecture des résultats : La détermination de la positivité et la négativité de chaque test consiste sur une lecture ; soit directe (sans ajouter aucun réactif) soit indirecte (en ajoutant des réactifs spécifiques ) . La lecture est faite en se basant sur le tableau ci-dessous : Tableau 7 : Tableau de lecture de la galerie API20E. b. Interprétation des résultats : [Génie Bio-Industriel] Page 45
  46. 46. • Détermination du profil numérique : Sur la fiche de résultats, les tests sont séparés par groupes de trois et une valeur 1, 2 ou 4 est indiquée pour chacun. En additionnant à l'intérieur de chaque groupe les valeurs correspondant à des réactions positives, on obtient 7 chiffres ; la réaction de l'oxydase qui constitue le 21° test est affectée de la valeur 4 lorsqu'elle est positive. Les figures suivantes représentent l’aspect final de 2 galeries Api 20E : l’une montre le résultat d’ensemencement d’une colonie bien isolée d’une souche pure du 5eme échantillon (Leben traditionnel de Tikiouine), et l’autre montre le résultat d’ensemencement d’une souche de stéréotype E. Coli O 157 H : 7. Figure 13 : L’aspect de la galerie contenant E. Coli du 5eme échantillon après Incubation. • Identification. Il existe plusieurs moyes d’arriver a l’identification d’une souche : [Génie Bio-Industriel] Page 46
  47. 47. • Soit en utilise des clés d’identification. • Soit on utilise la fiche de lecture API20E. • Soit on utilise un catalogue API20E après avoir compléter une petite feuille API20E. • Soit on utilise un logiciel dans lequel on entre les résultats obtenus. Avec le catalogue analytique : les tests sont regroupes en groupe de 3, et une valeur (1,2 ou 4) est indiquée pour chacun. Additionner a l’intérieur de chaque groupe les nombres correspondants aux tests positifs. On obtient un nombre à 7 chiffres qui sert de code d’identification . [Génie Bio-Industriel] Page 47
  48. 48. [Génie Bio-Industriel] Page 48
  49. 49. [Génie Bio-Industriel] Page 49
  50. 50. [Génie Bio-Industriel] Page 50
  51. 51. Comme ca, on a obtenu les résultats figurant dans la fiche suivante : Figure 14 : Fiche API20E d’E.coli de l’échantillon 5. [Génie Bio-Industriel] Page 51
  52. 52. 2. Discussions. II.1. Dénombrement a. Le babeurre traditionnel. Tous les échantillons ont été contaminés par E. coli, avec des teneurs variant entre 9.102 et 4.104 UFC /ml.Nous notons que l’échantillon 5 est de loin le plus contaminé. Ce micro-organisme est un témoin de contamination fécale. Et Ce nombre élevé de coliforme s’explique par le fait que les conditions d’hygiènes ou de stockage qui sont mauvaises et surtout que le leben ne subit aucun traitement thermique. b. Le babeurre industriel. Tous les échantillons ont été sains et exempts d’E. Coli. Ceci témoigne une bonne hygiène des manipulations. Ainsi que la pasteurisation qui joue un grand rôle dans l’élimination des germes pathogènes et d’altération y compris E. Coli qui ce mène a la conservation du Leben. c. Comparaison entre les résultats des dénombrements. Les analyses du leben traditionnel montrent que tous les échantillons sont contaminés par E. Coli à un nombre supérieur au critère qui est de m= 0 dans Lebn. Par contre, les résultats du leben industriel sont conformes avec la norme. Pour conclure, Le Leben traditionnel reste non satisfaisant malgré la fermentation à cause de mauvaises conditions d’hygiène, l’absence de pasteurisation et surtout par le fait que E. Coli sont des pseudo-lactiques. Ils sont capables de prendre la place des lactobacilles et orienter la fermentation lorsqu’ils sont initialement nombreux. II.2. Identification biochimique. D’après le résultat du test d’E. Coli O157H :7, ce stéréotype n’est pas capable de fermenter le sorbitol et le saccharose, ce qui le caractérise des autres types d’E. Coli .Outre E. Coli O157 H : 7 se comporte comme les entérobactéries pathogènes, shigella et salmonella qui ne peuvent pas fermenter aussi les deux substances mentionnés ci-dessus. [Génie Bio-Industriel] Page 52
  53. 53. A partir de l’autre test d’E. Coli, on constate que la bactérie isolée du Leben traditionnel fermente le sorbitol et le saccharose, ce qui implique qu’il ne s’agit pas d’une E. Coli O157 H : 7. On peut donc conclure que le type d’E.coli trouvé dans l’échantillon, est un type commensal ou un pathogène opportuniste, qui peut causer des symptômes banals. Malgré que cette E. Coli soit inoffensive, elle reste un indicateur de contamination fécale et probablement indicateur d’existence d’autres germes pathogènes. Pour ce fait, il est obligatoire en suivant les normes ; de rejeter ces produits pour prévenir tous risques d’infection. [Génie Bio-Industriel] Page 53
  54. 54. ConClusion : Le Lben marocain est un lait fermenté utilisé surtout comme boisson rafraîchissante et apprécié pour ses qualités organoleptiques (acidité, arôme ...), mais sa valeur nutritionnelle est loin d'être négligeable. En effet, Il serait également salutaire de fixer des normes microbiologiques afin d'assurer au consommateur une qualité suffisante aux plans nutritionnel, organoleptique et hygiénique. L’objectif de cette étude était tout d’abord de rechercher E. coli dans Lben et de l’identifier d’après, notre méthodologie nous a mené à des résultats qui nous ont guidé à déclencher l’alarme de prévention au consommateur, il ne s’agit non seulement d’un gout appréciable du produit, mais il s’agit plutôt d’une denrée alimentaire saine, exempte de germes soient pathogènes ou indicateur d’un manque d’hygiène durant sa fabrication. En guise de conclusion, E. Coli trouvée dans le leben traditionnel est un indicateur de contamination du produit pendant sa fabrication, se qui signifie que la fabrication manque d’hygiène .C’est pour cela qu’il est déconseiller de boire le Leben traditionnel d’origine inconnu. D’autre part, le Leben industriel est conforme à 100% : il est prêt à être consommer grâce à la pasteurisation qu’il subit. Pour conclure, Nos choix alimentaires doivent consister sur des critères sages et inoffensifs. Puisqu’on peut consommer les mêmes caractéristiques organoleptiques et nutritionnelles, consommons donc cette boisson saine industrielle. [Génie Bio-Industriel] Page 54
  55. 55. BiBliographie. • Analyse microbiologique dans les industries agroalimentaires.- Paris : Edition de l’usine nouvelle.-239p. • Afssa (2003). Bilan des connaissances relatives aux Escherichia coli producteurs de Shiga-toxines (STEC). • Bolton FJ (2000). Guidelines for the control of infection with verocytotoxin producing E. coli. Commun. Dis Public Health. • Dineen, S.S., Takeuchi K., Soucah, J.E. and Boor, K.J. (1998) Persistence of Escherichia coli O157:H7 in dairy fermentation systems. J. Food Prot. 61: 1602-1608. • FAIRBROTHER J.M et NADEAU E., 2006.- Escherichia coli: On-farm contamination of animals. • Grimont, P. (1987) Taxonomie des Escherichia. Méd Mal Infect, 6-10. • HARRATI(E.) (1974). - Recherches sur le Lben et le Klila algériens. Thèse de doctorat de spécialité, Université de Caen (France). • HAMZA A.D., 1996 Contribution à l’étude de la qualité des lait caillé du Niger. Thèse : Méd.Vét. : Dakar ; 12 • JENNESS(R.) and PATTON(S.) (1959). - Principles of dairy chemistry. 446 p, John Wiley and sons, Inc. Publishers, New York-London. • Kaper JB et al. (2004) Pathogenic Escherichia coli. Nat Rev Microbiol 2 :123. • Le Lait, (1983),63,230-245, A. TANTAOUI-ELARAKI, M. BERRADA, A. EL MARRAKCHI et A. BERRAMOU. Institut Agronomique et Vétérinaire Hassan II, B.P. 6202 Rabat-Instituts, Rabat (Maroc). • Microbiologie et toxicologie des aliments: Hygiène et sécurité alimentaire : Par Guy Leyral,Élisabeth Vierling • Michel ClaudP,Champagne J,Reitz A,Maryse L et Ismail F (2002).Microbiologie de lait.Science et technologie de lait. [Génie Bio-Industriel] Page 55
  56. 56. • RRIGAN(W. F.) and Mc CANCE(Margaret E.) (1976). - Laboratory Methods in Food and dairy Microbiology. Academie Press, London, New York,. • Sperandio, V., Kaper J. B., Bortolini M. R., Neves B. C., Keller R. and Tozzi L. R. (2001) Epidemiology of human infections by Escherichia coli O157 and other verocytotoxin- producing E. coli. • Yang G Z. 2000 Antimicrobial compounds and extracellular Polysaccharides produced by lactic acid bacteria : structure and properties. Les sites internet : http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/escherichiacoli_g.htm http:// www.jibal.ma/normes_et_process.php http://www.bio-top.net/Microbio/TP/Api.htm http: //www.onssa.gov http://www.cfsan.fda.gov [Génie Bio-Industriel] Page 56
  57. 57. annexes Annexe 1 : La gélose TSA La gélose Trypto-caséine soja (TSA) est un milieu universel convenant pour un large éventail d'emplois. Du fait de son excellente nutritivité, elle peut être utilisée, d'une part pour les culture et isolement des bactéries aérobies et anaérobies, d'autre part pour favoriser la croissance des germes particulièrement exigeants. [Génie Bio-Industriel] Page 57
  58. 58. Annexe 2 : La gélose TBX. La gélose TBX est un milieu sélectif destiné au dénombrement des Escherichia coli β-D-glucuronidase positive dans les produits alimentaires. Le résultat est obtenu directement par comptage des colonies caractéristiques après seulement 24 heures d'incubation, sans qu'il soit nécessaire de pratiquer une étape de confirmation. En 1949, Buehler et al. furent les premiers à relever la présence d'une β-D-glucuronidase chez Escherichia coli. Depuis cette époque, la plupart des études ont montré que 94 à 97% des Escherichia coli d'origine humaine ou issues de l'environnement possèdent cette activité enzymatique. Cette dernière a été également détectée chez les Citrobacter, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella et Yersinia, mais sa présence ne concerne qu'un nombre réduit de souches dans chacune des espèces citées. La β- D-glucuronidase peut donc être considérée comme un indicateur valable pour la détection d'Escherichia coli dans les produits alimentaires et dans les eaux. En 1990, Restaino a utilisé avec succès un nouveau substrat chromogène : le BCIG. Une fois incorporé dans une gélose au tergitol, cette dernière permettait d'effectuer la numération en 24 heures des Escherichia coli présents dans les produits carnés. La gélose TBX ne contient pas de tergitol, ce dernier composé étant remplacé par des sels biliaires qui assurent des propriétés sélectives similaires. [Génie Bio-Industriel] Page 58
  59. 59. Annexe 3 : Résultat du comptage des colonies d’E. Coli (colonies vertes) obtenus après 24h incubation ; donne les résultats suivants : SM Dilution 10-1 Dilution 10-2 Dilution 10-3 Dilution 10-4 1 >300 >300 >300 101 19 2 >300 >300 107 25 2 3 >300 >300 70 7 1 4 >300 107 20 3 1 5 >300 >300 >300 188 49 6 0 0 0 0 0 7 0 0 0 0 0 8 0 0 0 0 0 107 : exemple de nombre de colonies gardé qui varie entre 30 <N< 300 [Génie Bio-Industriel] Page 59
  60. 60. [Génie Bio-Industriel] Page 60
  61. 61. Annexe 4 : Critères microbiologique des produits laitiers. [Génie Bio-Industriel] Page 61

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