Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen
Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen

19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach

Mesenchymale Stammzellen (MSZ)

•  Stammzellnische (Knochenmark, Knorpel, Fettgewebe, Blut u. a.)

•  chemische Signale
•  Zellform
•  mechanische Signale
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à regenerative Medizin

19.02.12 © 2012 Universität Rostock | Medizinische Fakultät | MBT | Anne Langenbach 2

Zielstellung

Hat die Modiﬁkation des Aktinzytoskeletts durch
Inhibitoren Einﬂuss auf die Mechanotransduktion in
MSZ?


Zielstellung

Hat die Modifikation des Aktinzytoskeletts durch
Inhibitoren Einfluss auf die Mechanotransduktion in
MSZ?

•  humane MSZ aus dem Knochenmark
•  Modifikation des Aktinzytoskeletts
•  mechanische Stimulation
•  Signaltransduktion (ERK und AKT)


Zytoskelett

Aktinﬁlamente

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Fokaladhäsion und Mechanotransduktion

Integrin

Fokale Adhäsionskinase
Vinculin

Aktin

modiﬁziert nach www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm



Integrin

Vinculin
P

Aktin




Integrin

Vinculin
P

Aktin

ERK1/2
P




Integrin

Vinculin
P

Aktin AKT
P

ERK1/2
P



Aktin und Inhibitoren

Jasplakinolid

G-Aktin F-Aktin Cytochalasin D
Latrunculin A


Verwendung der Inhibitoren

•  Konzentrationen ohne Beeinträchtigung der Zellvitalität

•  Jasplakinolid: 0,01 µM

•  Cytochalasin D: 0,5 µM

•  Latrunculin A: 0,1 µM

•  Kontrolle: 0,1 % DMSO

0,01 µM 0,1 µM


Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett

0,01 µM 0,1 µM


Kontrolle (DMSO)
Jasplakinolid 0,01 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Jasplakinolid

0,01 µM


Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D

0,01 µM 0,1 µM


Kontrolle (DMSO)
Cytochalasin D 0,5 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Cytochalasin D

0,01 µM 0,1 µM


Kontrolle (DMSO) Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A

0,01 µM


Kontrolle (DMSO)
Latrunculin A 0,1 µM Morphologie und Aktinzytoskelett – Latrunculin A


Mechanische Stimulation

MSZ
Integrine
Paramagnetische
Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead

modiﬁziert nach Kasten et al., 2010



MSZ
Integrine
Paramagnetische
Clustern Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead




MSZ
Integrine
Paramagnetische
Clustern Mikrobeads
= 0,2 nN / Bead

Reiz



Aktivierung von ERK und AKT

Magnetfeld
Kontrolle

Clustern

Reiz
mit DMSO



Magnetfeld
Kontrolle

Clustern

Reiz
mit DMSO

B 800
**

700

phERK
600

**
Intensität in %

500

400 DMSO 0,1 %
300 Jasp 0,01 µM

200

p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0

Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz n=3


Aktivierung von ERK und AKT – Jasplakinolid

Magnetfeld

Magnetfeld
Kontrolle

Kontrolle
Clustern

Clustern
Reiz

Reiz
mit DMSO Jasplakinolid 0,01 µM

B 800
**

700

phERK
600

**
Intensität in %

500

400 DMSO 0,1 %
300 Jasp 0,01 µM

200

p ≤ 0,1
100
**p ≤ 0,05
0




C 700
**
600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
**
Jasp 0,01 µM
200

p ≤ 0,1
100

**p ≤ 0,05
0



C 700
*

600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
*
Jasp 0,01 µM
200

p ≤ 0,1
100

**p ≤ 0,05
0



C 700
*

600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
*
Jasp 0,01 µM
200

p ≤ 0,1
100

**p ≤ 0,05
0

•  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT


Aktivierung von ERK und AKT – Cytochalasin D

Magnetfeld

Magnetfeld
Kontrolle

Kontrolle
Clustern

Clustern
Reiz

Reiz
mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM



Magnetfeld

Magnetfeld
Kontrolle

Kontrolle
Clustern

Clustern
Reiz

Reiz
mit DMSO Cytochalasin D 0,5 µM
B
700 *

*
600

phERK
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
CytoD 0,5 µM
200

100 p ≤ 0,1

0
**p ≤ 0,05



C
700

*
600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
**
300
CytoD 0,5 µM
200

100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
Kontrolle Clustern Magnetfeld Reiz
n=3



C
700

*
600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
**
300
CytoD 0,5 µM
200

100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
n=3

•  keine Hemmung der Aktivierung von ERK
•  Hemmung der Aktivierung von AKT nach Zugstress


Aktivierung von ERK und AKT – Latrunculin A

Magnetfeld

Magnetfeld
Kontrolle

Kontrolle
Clustern

Clustern
Reiz

Reiz
mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM



Magnetfeld

Magnetfeld
Kontrolle

Kontrolle
Clustern

Clustern
Reiz

Reiz
mit DMSO Latrunculin A 0,1 µM
B 700
**

600

phERK
500
*
Intensität in %

400

DMSO
300
LatA 0,1 µM
200

100 p ≤ 0,1

0
**p ≤ 0,05
n=3



C 700

**
600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
**
LatA 0,1 µM
200

100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
n=3



C 700

**
600

phAKT
500
Intensität in %

400

DMSO 0,1 %
300
**
LatA 0,1 µM
200

100 p ≤ 0,1
0 **p ≤ 0,05
n=3

•  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT


Zusammenfassung

Jasplakinolid
•  verdickte Aktinbündel
•  keine Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT

Cytochalasin D
•  Fragmentierung des Aktinzytoskeletts
•  keine Hemmung der Aktivierung von ERK
•  Hemmung der Aktivierung von AKT nach mechanischer Reizung

Latrunculin A
•  Aktinﬁlamente nicht mehr parallel
•  komplette Hemmung der Aktivierung von ERK und AKT


Fazit

•  Inhibitoren des Aktinzytoskeletts wie Latrunculin A können
die durch mechanische Interferenz induzierte Aktivierung von
ERK und AKT hemmen

•  allerdings führte eine strukturelle Modiﬁkation des
Aktinzytoskeletts nicht immer zur Hemmung der
Signaltransduktion

•  das spricht für kompensatorische Mechanismen innerhalb
des gesamten Zytoskeletts


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit


Quellen

•  Caplan AI (2009) Why are MSZs therapeutic? New data: new insight. J Pathol 217(2): 318-24
•  Casella JF, Flanagan MD und Lin S (1981) Cytochalasin D inhibits actin polymerization and induces depolymerization of
actin filaments formed during platelet shape change. Nature 293(5830): 302-5
•  del Rio A, Perez-Jimenez R, Liu R, Roca-Cusachs P, Fernandez JM und Sheetz MP (2009) Stretching single talin rod molecules
activates vinculin binding. Science 323(5914): 638-41
•  Disanza A, Steffen A, Hertzog M, Frittoli E, Rottner K und Scita G (2005) Actin polymerization machinery: the finish line of
signaling networks, the starting point of cellular movement. Cell Mol Life Sci 62(9): 955-70
•  Discher DE, Mooney DJ und Zandstra PW (2009) Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells.
Science 324(5935): 1673-7
•  Horwitz A, Duggan K, Buck C, Beckerle MC und Burridge K (1986) Interaction of plasma membrane fibronectin receptor
with talin-a transmembrane linkage. Nature 320(6062): 531-3
•  Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini FC, Deans RJ, Krause DS und Keating A (2005)
Clarification of the nomenclature for MSZ: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 7(5):
393-5
•  Kasten A, Müller P, Bulnheim U, Groll J, Bruellhoff K, Beck U, Steinhoff G, Möller M und Rychly J (2010) Mechanical Integrin
Stress and Magnetic Forces Induce Biological Responses in Mesenchymal Stem Cells Which Depend on Environmental
Factors. J Cell Biochem 111(6): 1586-97
•  Pantaloni D, Le Clainche C und Carlier MF. (2001) Mechanism of Actin-Based Motility. Science 292(5521): 1502-6
•  Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S und Marshak
DR (1999) Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells. Science 284(5411): 143-7


Quellen

•  Scadden DT (2006) The stem-cell niche as an entity of action. Nature 441(7097): 1075-9
•  Scott VR, Boehme R und Matthews TR (1988) New class of antifungal agents: jasplakinolide, a cyclodepsipeptide from the
marine sponge, Jaspis species. Antimicrob Agents Chemother 32(8): 1154-7
•  Spector I, Shochet NR, Blasberger D und Kashman Y (1989) Latrunculins--novel marine macrolides that disrupt microﬁlament
organization and affect cell growth: I. Comparison with cytochalasin D. Cell Motil Cytoskeleton 13(3): 127-44
•  www.sciencephoto.com
•  www.reading.ac.uk/nitricoxide/intro/migration/adhesion.htm


Anhang


Anhang

www.invitrogen.com


Kontrolle (ohne DMSO)
Kontrolle (mit DMSO) DMSO – Morphologie und Aktinzytoskelett

0,01 µM 0,1 µM


Jasp und Lat A – Morphologie

Kontrolle (ohne DMSO) Jasplakinolid 0,01 µM Jasplakinolid 0,1 µM

Kontrolle (mit DMSO) Latrunculin A 0,01 µM Latrunculin A 0,1 µM Latrunculin A 0,5 µM

0,01 µM 0,1 µM


Vitalitätstest - MTS


Vitalitätstest - KV


Vitalitätstest – MTS / KV


Schematischer Ablauf des Integrinreizes


Coomassie

Latrunculin A

Jasplakinolid

Cytochalasin D


Kontrolle

2100

**
**
1800

1500
phERK
Intensität in %

1200
EM
**
900 DMSO 0,1 %

600

300

0
K Cl MF Reiz


Kontrolle

600

**
500

400
**
phAKT
Intensität in %

EM
300
DMSO 0,1 %

200

100

0
K Cl MF Reiz


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