Université Mohamed Kheidher –Biskra-Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie       1ère anné...
Plan de travail:IntroductionI-Dosage des acides nucléiquesMéthode basée sur la fluorescenceDosage par Spectrophotométrie...
Introduction:Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservationpour maintenir la structure des acides ...
I-Dosage des acides nucléiques :                Dosages des acides nucléiquesspectrofluorométrie                          ...
Estimation des quantités d’ADN et d’ARN : Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN àpartir d’un matériel ...
Principe : Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux defixation est directement lié a la quantité de ADN ém...
Utilisation du DAPI : Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie etspécifique de lADN fluoresce en bl...
Utilisation BET (bromure d’éthidium) : Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à descolorant, un des plus utili...
Méthode basée sur la spectrophotométrie:Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est uneméthode plus simp...
Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs eten solution homogène, certains contrôles doivent être...
Principe de spectrophotométrie :
Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, unepartie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’...
Dosage des acides nucléiques par                          absorption UVLes nucléotides ont une absorbance maximale vers 26...
Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2si le rapport est < 1,7 présence de protéines.Si le rapport ...
II- Conservation des acides nucléiques :                Conservation des acides nucléiques      Conservation              ...
- Conservation d’ADN :Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN    conservation   Le tampon   Le pH        La      d’A...
- Conservation d’ARN :Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié      Conservation        Le...
ConclusionAprès la réalisation de l’extraction et la purification des acidesnucléiques on entamer le dosage de ces dernier...
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  1. 1. Université Mohamed Kheidher –Biskra-Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie 1ère année Master Biochimie et Biologie moléculaire Exposé sur: 2011/2012
  2. 2. Plan de travail:IntroductionI-Dosage des acides nucléiquesMéthode basée sur la fluorescenceDosage par SpectrophotométrieII-Conservation des acides nucléiquesConservation de l’ADNConservation de l’ARNConclusion
  3. 3. Introduction:Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservationpour maintenir la structure des acides nucléotides.
  4. 4. I-Dosage des acides nucléiques : Dosages des acides nucléiquesspectrofluorométrie spectrophotométrie
  5. 5. Estimation des quantités d’ADN et d’ARN : Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN àpartir d’un matériel biologique. Méthode basée sur la fluorescence : On utilise un spéctrofluorimétre pour mesurer l’intensité dela fluorescence d’une solution des acides nucléiques enprésence d’un excès de fluorochrome.
  6. 6. Principe : Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux defixation est directement lié a la quantité de ADN émettra unequantité de fluorescence qui sera proportionnelle a laquantité de ADN présente.Les différents fluorochrome: - Se fixant spécifiquement sur des paires de bases: Bases A-T: DAPI Bases G-C: mithramycine . - Intercalant: Bromure dethidium et Acridine orange ( qui ont lavantage dêtre moins chers ).
  7. 7. Utilisation du DAPI : Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie etspécifique de lADN fluoresce en bleu.Cet isotope radioactif se lie spécifiquement à l’ADN double brin, àune longueur d’onde précise à la suite d’une excitation lumineuse.On utilise une longueur d’onde d’excitation de 369 nm et d’émissionde 460 nm. Les méthodes fluorimétrique sont très sensibles ; ellespermettent de doser des quantités d’ADN de 1 µg. elles sont pluslongues et plus couteuses que la méthode spectrophotométrie.
  8. 8. Utilisation BET (bromure d’éthidium) : Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à descolorant, un des plus utilisés est le bromure d’éthidium quis’intercale entre les bases et qui émet dans le rouge lorsqu’il estexcité par un rayonnement UV .il colore l’ADN mais aussi l’acidenucléique simple brin tel que l’ARN.
  9. 9. Méthode basée sur la spectrophotométrie:Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est uneméthode plus simple et plus rapide.les acides nucléiques ont la propriétéd’absorber les U.V .à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture del’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer laconcentration d’un échantillon d’un acide nucléique. La concentrationd’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant :Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilutionL’unité de densité optique à 260 nm correspond à :1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin.1 unité de A260=33 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin1unité de A260=40 µg/ml : une solution d’ARN
  10. 10. Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs eten solution homogène, certains contrôles doivent être effectués. Une lecture au spectrophotomètre en ultra-violet permet de vérifié lapureté de l’ADN obtenu. Pour vérifier que cet ADN purifié n’a pas été dénaturé en courd’expérience, cest-à-dire qu’il est toujours en double hélice, on feraune mesure de l’hyperchromicité (augmentation de A260) aprèsdénaturation alcalin par NaOH. Le pourcentage l’hyperchromicité estR=25%. Si l’ADN est dénaturé, le pourcentage d’hyperchromicité est égale à0%.%Hyperchromicité = A(ADN dénaturé)-A(ADN natif)×100 /A(ADN natif) .
  11. 11. Principe de spectrophotométrie :
  12. 12. Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, unepartie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de lalumière transmise est donc inférieure à I . On définit l’absorbance dela solution comme : Vidéo ici
  13. 13. Dosage des acides nucléiques par absorption UVLes nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due auxbases azotées A,C,G,T, U- Estimation de la concentration en acides nucléiques .- Estimation de la pureté de l’échantillon . Spectre d’absorbance
  14. 14. Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2si le rapport est < 1,7 présence de protéines.Si le rapport est > 2 présence d’ARN.
  15. 15. II- Conservation des acides nucléiques : Conservation des acides nucléiques Conservation Conservation d’ADN d’ARN
  16. 16. - Conservation d’ADN :Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN conservation Le tampon Le pH La d’ADN température Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à4 C court terme Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à – 20 C long terme
  17. 17. - Conservation d’ARN :Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié Conservation Le tampon Le pH La d’ARN température Stockage d’ARN -Tris-EDTA purifié à court -L’eau pure Rnase -80 C pendant un terme free avec ou sans- an EDTA Citrate de sodium Stockage d’ARN purifié à long L’éthanol Inférieur terme à -20 C Stockage d’ARN non purifié isothiocyanate de [-20 C à -80 C] guanidine Pendant 18 mois
  18. 18. ConclusionAprès la réalisation de l’extraction et la purification des acidesnucléiques on entamer le dosage de ces dernier par deux méthodesbasés sur la fluorescence et la spectrophotométrie. Et stockage d ADNet D ARN purifier et non purifier dans des conditions favorables cesétapes suivie par la séparation détection caractérisation etidentification des acides nucléiques

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