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Université Mohamed Kheidher –Biskra-
Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie
       1ère année Master Biochimie et Biologie moléculaire



 Exposé sur:




                             2011/2012
Plan de travail:
Introduction
I-Dosage des acides nucléiques
Méthode basée sur la fluorescence
Dosage par Spectrophotométrie
II-Conservation des acides nucléiques
Conservation de l’ADN
Conservation de l’ARN
Conclusion
Introduction:




Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservation
pour maintenir la structure des acides nucléotides.
I-Dosage des acides nucléiques :


                Dosages des acides nucléiques




spectrofluorométrie                             spectrophotométrie
Estimation des quantités d’ADN et d’ARN :
 Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à
partir d’un matériel biologique.
  Méthode basée sur la fluorescence :

 On utilise un spéctrofluorimétre pour mesurer l’intensité de
la fluorescence d’une solution des acides nucléiques en
présence d’un excès de fluorochrome.
Principe :
 Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux de
fixation est directement lié a la quantité de ADN émettra une
quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la
quantité de ADN présente.
Les différents fluorochrome:
 - Se fixant spécifiquement sur des paires de bases:
           Bases A-T: DAPI
           Bases G-C: mithramycine .


 - Intercalant: Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui
 ont l'avantage d'être moins chers ).
Utilisation du DAPI :
 Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie et
spécifique de l'ADN fluoresce en bleu.
Cet isotope radioactif se lie spécifiquement à l’ADN double brin, à
une longueur d’onde précise à la suite d’une excitation lumineuse.
On utilise une longueur d’onde d’excitation de 369 nm et d’émission
de 460 nm. Les méthodes fluorimétrique sont très sensibles ; elles
permettent de doser des quantités d’ADN de 1 µg. elles sont plus
longues et plus couteuses que la méthode spectrophotométrie.
Utilisation BET (bromure d’éthidium) :

 Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à des
colorant, un des plus utilisés est le bromure d’éthidium qui
s’intercale entre les bases et qui émet dans le rouge lorsqu’il est
excité par un rayonnement UV .il colore l’ADN mais aussi l’acide
nucléique simple brin tel que l’ARN.
Méthode basée sur la spectrophotométrie:
Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est une
méthode plus simple et plus rapide.les acides nucléiques ont la propriété
d’absorber les U.V .à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture de
l’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer la
concentration d’un échantillon d’un acide nucléique. La concentration
d’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant :

Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilution

L’unité de densité optique à 260 nm correspond à :
1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin.
1 unité de A260=33 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin
1unité de A260=40 µg/ml : une solution d’ARN
Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs et
en solution homogène, certains contrôles doivent être effectués.

 Une lecture au spectrophotomètre en ultra-violet permet de vérifié la
pureté de l’ADN obtenu.

 Pour vérifier que cet ADN purifié n’a pas été dénaturé en cour
d’expérience, c'est-à-dire qu’il est toujours en double hélice, on fera
une mesure de l’hyperchromicité (augmentation de A260) après
dénaturation alcalin par NaOH. Le pourcentage l’hyperchromicité est
R=25%.
 Si l’ADN est dénaturé, le pourcentage d’hyperchromicité est égale à
0%.
%Hyperchromicité = A(ADN dénaturé)-A(ADN natif)×100 /A(ADN natif) .
Principe de spectrophotométrie :
Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, une
partie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de la
lumière transmise est donc inférieure à I . On définit l’absorbance de
la solution comme :
          Vidéo ici
Dosage des acides nucléiques par
                          absorption UV

Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux
bases azotées A,C,G,T, U
- Estimation de la concentration en acides nucléiques .
- Estimation de la pureté de l’échantillon .


    Spectre d’absorbance
Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2
si le rapport est < 1,7 présence de protéines.
Si le rapport est > 2 présence d’ARN.
II- Conservation des acides nucléiques :

                Conservation des acides nucléiques




      Conservation                                   Conservation
        d’ADN                                          d’ARN
- Conservation d’ADN :
Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN



    conservation   Le tampon   Le pH        La
      d’ADN                             température


     Stockage à    Tris-EDTA    = 8,0      à4 C
     court terme


      Stockage à   Tris-EDTA    = 8,0     à – 20 C
      long terme
- Conservation d’ARN :
Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié

      Conservation        Le tampon          Le pH        La
        d’ARN
                                                      température

     Stockage d’ARN     -Tris-EDTA
      purifié à court   -L’eau pure Rnase            -80 C pendant un
          terme         free avec ou sans-                  an
                        EDTA
                        Citrate de sodium
     Stockage d’ARN
       purifié à long       L’éthanol                    Inférieur
           terme                                          à -20 C


     Stockage d’ARN
        non purifié     isothiocyanate de             [-20 C à -80 C]
                            guanidine                 Pendant 18 mois
Conclusion
Après la réalisation de l’extraction et la purification des acides
nucléiques on entamer le dosage de ces dernier par deux méthodes
basés sur la fluorescence et la spectrophotométrie. Et stockage d ADN
et D ARN purifier et non purifier dans des conditions favorables ces
étapes suivie par la séparation détection caractérisation et
identification des acides nucléiques
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  • 1. Université Mohamed Kheidher –Biskra- Faculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie 1ère année Master Biochimie et Biologie moléculaire Exposé sur: 2011/2012
  • 2. Plan de travail: Introduction I-Dosage des acides nucléiques Méthode basée sur la fluorescence Dosage par Spectrophotométrie II-Conservation des acides nucléiques Conservation de l’ADN Conservation de l’ARN Conclusion
  • 3. Introduction: Après la réalisation des techniques de dosage utilisée la conservation pour maintenir la structure des acides nucléotides.
  • 4. I-Dosage des acides nucléiques : Dosages des acides nucléiques spectrofluorométrie spectrophotométrie
  • 5. Estimation des quantités d’ADN et d’ARN : Cette estimation est indispensable après extraction d’ADN à partir d’un matériel biologique. Méthode basée sur la fluorescence : On utilise un spéctrofluorimétre pour mesurer l’intensité de la fluorescence d’une solution des acides nucléiques en présence d’un excès de fluorochrome.
  • 6. Principe : Les fluorochromes qui se fixe sur le ADN et dont le taux de fixation est directement lié a la quantité de ADN émettra une quantité de fluorescence qui sera proportionnelle a la quantité de ADN présente. Les différents fluorochrome: - Se fixant spécifiquement sur des paires de bases: Bases A-T: DAPI Bases G-C: mithramycine . - Intercalant: Bromure d'ethidium et Acridine orange ( qui ont l'avantage d'être moins chers ).
  • 7. Utilisation du DAPI : Le DAPI(Di Aminido Phenyl lndol) colorant utilisé en cytochimie et spécifique de l'ADN fluoresce en bleu. Cet isotope radioactif se lie spécifiquement à l’ADN double brin, à une longueur d’onde précise à la suite d’une excitation lumineuse. On utilise une longueur d’onde d’excitation de 369 nm et d’émission de 460 nm. Les méthodes fluorimétrique sont très sensibles ; elles permettent de doser des quantités d’ADN de 1 µg. elles sont plus longues et plus couteuses que la méthode spectrophotométrie.
  • 8. Utilisation BET (bromure d’éthidium) : Les acide nucléiques peuvent aussi être dosé grâce à des colorant, un des plus utilisés est le bromure d’éthidium qui s’intercale entre les bases et qui émet dans le rouge lorsqu’il est excité par un rayonnement UV .il colore l’ADN mais aussi l’acide nucléique simple brin tel que l’ARN.
  • 9. Méthode basée sur la spectrophotométrie: Le dosage des acides nucléiques par la spectrophotométrie est une méthode plus simple et plus rapide.les acides nucléiques ont la propriété d’absorber les U.V .à une longueur d’onde de 260 nm, une lecture de l’absorbance à cette longueur d’onde permettra de déterminer la concentration d’un échantillon d’un acide nucléique. La concentration d’un acide nucléique donné est obtenue par la relation suivant : Concentration (µg /ml) = DO (densités optiques) 260nm× 50×facteur de dilution L’unité de densité optique à 260 nm correspond à : 1 unité de A260=50 µg /ml : une solution d’ADN double brin. 1 unité de A260=33 µg/ml : une solution d’ ADN simple brin 1unité de A260=40 µg/ml : une solution d’ARN
  • 10. Ces valeurs s’appliquant à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène, certains contrôles doivent être effectués. Une lecture au spectrophotomètre en ultra-violet permet de vérifié la pureté de l’ADN obtenu. Pour vérifier que cet ADN purifié n’a pas été dénaturé en cour d’expérience, c'est-à-dire qu’il est toujours en double hélice, on fera une mesure de l’hyperchromicité (augmentation de A260) après dénaturation alcalin par NaOH. Le pourcentage l’hyperchromicité est R=25%. Si l’ADN est dénaturé, le pourcentage d’hyperchromicité est égale à 0%. %Hyperchromicité = A(ADN dénaturé)-A(ADN natif)×100 /A(ADN natif) .
  • 12. Lorsqu’une lumière d’intensité I₀ passe à travers une solution, une partie de celle-ci est absorbée par le(s) soluté(s). L’intensité de la lumière transmise est donc inférieure à I . On définit l’absorbance de la solution comme : Vidéo ici
  • 13. Dosage des acides nucléiques par absorption UV Les nucléotides ont une absorbance maximale vers 260 nm due aux bases azotées A,C,G,T, U - Estimation de la concentration en acides nucléiques . - Estimation de la pureté de l’échantillon . Spectre d’absorbance
  • 14. Échantillon d’ADN pur : Abs 260/Abs 280 compris entre 1,8 et 2 si le rapport est < 1,7 présence de protéines. Si le rapport est > 2 présence d’ARN.
  • 15.
  • 16. II- Conservation des acides nucléiques : Conservation des acides nucléiques Conservation Conservation d’ADN d’ARN
  • 17. - Conservation d’ADN : Tableau 01 : Les conditions de stockage d’ADN conservation Le tampon Le pH La d’ADN température Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à4 C court terme Stockage à Tris-EDTA = 8,0 à – 20 C long terme
  • 18. - Conservation d’ARN : Tableau 02 : les conditions de conservation d’ARN purifié et non purifié Conservation Le tampon Le pH La d’ARN température Stockage d’ARN -Tris-EDTA purifié à court -L’eau pure Rnase -80 C pendant un terme free avec ou sans- an EDTA Citrate de sodium Stockage d’ARN purifié à long L’éthanol Inférieur terme à -20 C Stockage d’ARN non purifié isothiocyanate de [-20 C à -80 C] guanidine Pendant 18 mois
  • 19. Conclusion Après la réalisation de l’extraction et la purification des acides nucléiques on entamer le dosage de ces dernier par deux méthodes basés sur la fluorescence et la spectrophotométrie. Et stockage d ADN et D ARN purifier et non purifier dans des conditions favorables ces étapes suivie par la séparation détection caractérisation et identification des acides nucléiques