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Prof. P. Kestemont
         Ass. Prof. F. Silvestre



   Environmental Physiology &
                   Toxicology
Ecophysiology – Ecotoxicology (PK)
       Systems Ecotoxicology (FS)
2

Research at different organization levels
                                            From the gene to the field


                                 Studies at molecular and cellular levels
   Precision - Reproducibility




                                                     Studies at population/community levels

                                            Complexity - Representativity
3

Sujets de mémoires 2012
v    Adaptations physiologiques à des polluants et impacts transgénérationnels chez des
      vertébrés aquatiques

v    Etude in vitro des réponses moléculaires des lymphocytes chez l’anguille européenne
      Anguilla anguilla suite à une exposition à différents xénobiotiques. Développement d’une
      approche multi-biomarqueurs non invasive par l’analyse sub-protéomique.

v    Neurotoxicité du méthylmercure chez l’anguille européenne Anguilla anguilla.

v    Effets d’une mixture de PCBs, l’Aroclor 1254 sur les systèmes UPR et UPS des têtards du
      xénope Xenopus laevis : approche transcriptomique, protéomique et enzymatique.

v    Impacts des perturbateurs endocriniens œstrogéniques et androgéniques sur le système
      immunitaire de la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss

v    Etude des mécanismes différentiels d’interaction entre le stress et les fonctions
      reproductrices et immunitaires chez deux téléostéens : la perche commune et le tilapia

v    Etude in vitro de la régulation de l’immunité de la perche commune (Perca fluviatilis L.) par
      les corticostéroïdes et leurs récepteurs

v    Étude de gènes clés impliqués dans la transdifférenciation du sexe chez la truite arc-en-ciel
      par une approche in vitro.

v    Effects of nutritional status on environmental stress tolerance in green (Acipenser
      medirostris) and white Sturgeon (A. transmontanus)
Adaptations physiologiques à des polluants et impacts
Pollutant/stress                                     transgénérationnels chez des vertébrés aquatiques
                              F1                     F2

                                                                                                          F. Silvestre
                                                                                                          V. Gillardin


                                                                                  Acclima'on/adapta'on	
  
                                                                                    Phenotypic	
  plas'city	
  

                   Acclima'on/adapta'on	
  
                    Phenotypic	
  plas'city	
  




                                                                             Evolu'on	
  of	
  the	
  ofnvironmental	
  
                                                                              New theories e evolution
                                                                                    stress	
  response	
  
5
Etude in vitro des réponses moléculaires des lymphocytes chez l’anguille européenne Anguilla
anguilla suite à une exposition à différents xénobiotiques. Développement d’une approche multi-
biomarqueurs non invasive par l’analyse sub-protéomique.
                                                                                                              F. Silvestre
                                                                                                              P. Kestemont
                                                                                                              K. Roland




                                                   pH	
  	
  	
  	
  	
  4	
                   7




                                              MW
                                                                           Proteomic analysis after cell exposure


          Isolation of PBMC
                                                              Biomarkers
                                                          Mechanisms of action
6
 Neurotoxicité du méthylmercure chez l’anguille européenne Anguilla anguilla.
                                                                                                                  P. Kestemont
                                                                                                                  F. Silvestre
                                                                                                                  JF Rees
                                                                                                                  D. Scaion

• 	
  Contamina'on	
  in	
  vivo	
  d’anguilles	
  avec	
  du	
  MeHg	
  
              à	
  doses	
  environnementales	
  
• 	
  Prélèvements	
  de	
  cerveaux	
  après	
  contamina'on	
  




                                                         Analyses	
  protéomiques	
  et	
  biochimiques	
  
                                                             • 	
  gels	
  d’électrophorèse	
  2D	
  (URBO)	
  
                                                      • 	
  enzymes	
  an'oxydantes	
  (UCL-­‐Prof.	
  JF	
  Rees)	
  
                                                  • 	
  dosage	
  de	
  marqueurs	
  neurologiques	
  (dopamine,	
  
                                                                          sérotonine)	
  (URBO)	
  
P. Kestemont   7
Effets des PCBs sur les systèmes UPR et UPS de Xenopus laevis
                                                                                          F. Silvestre
Approches transcriptomique, protéomique et enzymatique                                    V. Gillardin


                                    PCBs et amphibiens?                                 Malformations




                   Modulation de l’expression des gènes      Impact sur la survie, la croissance et
                              et des protéines                        la métamorphose




                                                                      HYPOTHESE
             Surexpression
                      •  Protéines cytosoliques modifiées:UPR
                      •  Protéines du RE modifiées: UPS


                                 Exposition courte (72h00) à une mixture de PCBs (AROCLOR 1254)


•  UPR: Analyse par western blot des protéines chaperonnes Grp58, GRP78 et PDI et niveau d expression
        des gènes par Q-PCR.
•  UPS: Activité enzymatique du protéasome et quantification de l Ubiquitin par western blot.
       Aspects protéomiques et transcriptomiques si le temps le permet
Impacts des perturbateurs endocriniens oestrogéniques et androgéniques sur le 8
                                         système immunitaire de la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss


                                                                                                                                   P. Kestemont
                                                                                                                                   S. Massart

                                                                                   système	
  reproducteur	
  
                                                         Effets	
  
                                                                                    système	
  immunitaire	
  	
  	
  

Perturbateurs	
  endocriniens	
  (PE)	
  




          Expérience	
  in	
  vivo	
        Analyses	
  des	
  paramètres	
  immunitaires	
                 Étude	
  transcriptomique	
  

  Exposi'on	
  des	
  poissons	
  et	
         Complément,	
  lysozyme,	
                            Test	
  de	
  l’expression	
  de	
  gènes	
  
  prélèvements	
  des	
  organes	
          immunoglobulines,	
  distribu'on	
                           spécifiques	
  par	
  qPCR	
  
                                                   leucocytaire	
  
9
EDC et intersexualité chez les poissons.
Incidence environnementale et approche in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires


 P. Kestemont
 S. Depiereux



                                               Effluents
                                                  STP

                                                  EDCs

        in vivo contamination          in vitro contamination      Validation in rivers with
                                      Effluent fragmentation           sentinel species
           EE2             Effluent                 -EE2
                                                    -Estrone
                                                    -Nonylphenol
                                                    -Estradiol




           Transcriptomic signature        Testis culture
P. Kestemont                                                                                                               Action du stress sur la régulation des mécanismes de10
                                                R. Mandiki                                                                                                                        reproduction et d immunité chez les poissons
                                                C. Mathieu

                                                                                                                                                  Confinement, densité,
                                                                                                                                                                                              Stress aigu                   Hormones
                                                                                                                                                       Territorialité/
                                                                                                                                                                                             ou chronique                   de stress
                                                                                                                                                      comportement
                                           5    5        5   5     5 55 5 5 55 5             5 5 55 5 5
                                                                                                5   5              5   5     5 5

                                                    20                 20 5 5
                                                                         20          5   5         20 5 5
                                                                                                      20     5 5           205   5        5 5
      5 5        5   5     5 5     5 5               5       5   5 5            20                      20                           20
                                                                  60
            02                   02 Gouttelettes  Gouttelettes 5 5
                                                   02                        5 5 60          5 5    5 5             5 5  5 5


                                                                                                                                                                                                      Effets délétères:
                                      lipidiques    lipidiques 55      5 5         5 Mitochondrie
                                                                                     5   5 5
                                                                                          60           Mitochondrie
                                                                                                     5 5    5 5
                                          55 5
                                             5
                                                5 5 5 Gouttelettes 5 5 5 5 5 55 20 55 5 5 5 5 5 20 Mitochondrie20
                                               55 55
                                                                       5 5
                                                             lipidiques5 20
                                                              5 5 5 20 5         5
                                                                                                 5
                                                                                                 20        5 5
                                 06             Glycogène tuoG Glycogène      RER             RER
                                                    settelet
eirdnohcotiM
                                                  205
                                                  20 20 u5 idipil20
                                                      se q 5 5
                                                       5                   20 5
                                                                            5
                                                                            20     5 5
                                                                            Glycogène 20      20 5 RER
                                                                                               5      5 20
                                                                                                        5
                                               5 5 5            5 5    5 5         5 560 5 5
                                                       Gouttelettes
                                                            20                  20
                                                                                                 6020
                                                           Gouttelettes
                                                         lipidiques
                                                                                                          Mitochondrie
                     RER           enègocy20lG                      20                 20                              Mitochondrie
                                Gouttelettes
                                         Gouttelettes        lipidiques 60
                                                                   60
                                 lipidiques
                                          lipidiques                        60 60
                                                                         Glycogène
                                                                                      Mitochondrie
                                                                                              Mitochondrie
                                                                                                 RER



                                                                                                                                                                                            -  Système reproducteur - Immunité
                             GouttelettesGouttelettes               60
                                 Gouttelettes                                   Glycogène              Mitochondrie
                                                                                                  Mitochondrie
                                                                                                               RER
                              lipidiques lipidiquesGlycogène
                                  lipidiques     Glycogène                     RER     Mitochondrie
                                                                                     RER




                                                                                                                                                Approche in vitro
                                                                       Glycogène                            RER
                                                             Glycogène
                                                              Glycogène                      RER            RER




                                                                                                                                                                                            -  Mécanismes d’action: pas élucidés


                                                                                                                                                                                          Approche in vivo

                                                                                                                                                                                   -  Perche: pondeur unique
                                                                                                                                                                                  -  Tilapia: pondeur multiple



                                                                                                                                                                         Géniteurs confinés vs Géniteurs + implants cortisol
                                                             Culture d’organes lymphoïdes                                                                                             Organes: rate, foie, sang

                                                                                 Rate – Leucocytes                                                                                  v  Réponse physiologique:
                                                                            + cortisol et/ou DOC                                                                               Expression des récepteurs GR/RT-PCR
                                                                                                                                                                             Autres indicateurs de stress/RIA ou ELISA


                                                                                                                                                                                      v  Réponse immunitaire
                                                                                                                                                                            Activité lysozyme, - CH50,- etc/Spectrométrie
                                                                                                                                                                            Expression des gènes de l’immunité/RT-PCR
11
Effects of nutritional status on environmental stress tolerance
in green and white Sturgeon                                                                                                    P. Kestemont
                                                                                                                               SSO. Hung




                                       Decline	
  of	
  green	
  &	
  white	
  sturgeon	
  popula'ons	
  
                                        Habitat	
  loss	
  –	
  Overfishing	
  –	
  Pollu'on	
  (Se,	
  Hg)	
  

                                               Research hypotheses

   •  Higher nutritional status is positively correlated with tolerance to thermal and salinity
                         stressors and to these stressors in combination.
                  •  Sensitivity to environmental stressors is age dependent
     •  Green and white sturgeon species, with the same nutritional status, will respond
                            differently to environmental stressors.
                      Experiment: manipulation of nutritional status of WS & GS

                  Responses: Fitness (swimming performance, UCTL), growth, RNA/DNA
                                            Resistance to environmental stressors
                      Analysis of physiological and cellular responses (HSPs, apotosis, etc.)


                                                                                                                  Co-promotor:
                                                                                                                 Prof. S.S.O Hung
12

                        More info


http://webapps.fundp.ac.be/system-ecotox




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  • 1. Prof. P. Kestemont Ass. Prof. F. Silvestre Environmental Physiology & Toxicology Ecophysiology – Ecotoxicology (PK) Systems Ecotoxicology (FS)
  • 2. 2 Research at different organization levels From the gene to the field Studies at molecular and cellular levels Precision - Reproducibility Studies at population/community levels Complexity - Representativity
  • 3. 3 Sujets de mémoires 2012 v  Adaptations physiologiques à des polluants et impacts transgénérationnels chez des vertébrés aquatiques v  Etude in vitro des réponses moléculaires des lymphocytes chez l’anguille européenne Anguilla anguilla suite à une exposition à différents xénobiotiques. Développement d’une approche multi-biomarqueurs non invasive par l’analyse sub-protéomique. v  Neurotoxicité du méthylmercure chez l’anguille européenne Anguilla anguilla. v  Effets d’une mixture de PCBs, l’Aroclor 1254 sur les systèmes UPR et UPS des têtards du xénope Xenopus laevis : approche transcriptomique, protéomique et enzymatique. v  Impacts des perturbateurs endocriniens œstrogéniques et androgéniques sur le système immunitaire de la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss v  Etude des mécanismes différentiels d’interaction entre le stress et les fonctions reproductrices et immunitaires chez deux téléostéens : la perche commune et le tilapia v  Etude in vitro de la régulation de l’immunité de la perche commune (Perca fluviatilis L.) par les corticostéroïdes et leurs récepteurs v  Étude de gènes clés impliqués dans la transdifférenciation du sexe chez la truite arc-en-ciel par une approche in vitro. v  Effects of nutritional status on environmental stress tolerance in green (Acipenser medirostris) and white Sturgeon (A. transmontanus)
  • 4. Adaptations physiologiques à des polluants et impacts Pollutant/stress transgénérationnels chez des vertébrés aquatiques F1 F2 F. Silvestre V. Gillardin Acclima'on/adapta'on   Phenotypic  plas'city   Acclima'on/adapta'on   Phenotypic  plas'city   Evolu'on  of  the  ofnvironmental   New theories e evolution stress  response  
  • 5. 5 Etude in vitro des réponses moléculaires des lymphocytes chez l’anguille européenne Anguilla anguilla suite à une exposition à différents xénobiotiques. Développement d’une approche multi- biomarqueurs non invasive par l’analyse sub-protéomique. F. Silvestre P. Kestemont K. Roland pH          4   7 MW Proteomic analysis after cell exposure Isolation of PBMC Biomarkers Mechanisms of action
  • 6. 6 Neurotoxicité du méthylmercure chez l’anguille européenne Anguilla anguilla. P. Kestemont F. Silvestre JF Rees D. Scaion •   Contamina'on  in  vivo  d’anguilles  avec  du  MeHg   à  doses  environnementales   •   Prélèvements  de  cerveaux  après  contamina'on   Analyses  protéomiques  et  biochimiques   •   gels  d’électrophorèse  2D  (URBO)   •   enzymes  an'oxydantes  (UCL-­‐Prof.  JF  Rees)   •   dosage  de  marqueurs  neurologiques  (dopamine,   sérotonine)  (URBO)  
  • 7. P. Kestemont 7 Effets des PCBs sur les systèmes UPR et UPS de Xenopus laevis F. Silvestre Approches transcriptomique, protéomique et enzymatique V. Gillardin PCBs et amphibiens? Malformations Modulation de l’expression des gènes Impact sur la survie, la croissance et et des protéines la métamorphose HYPOTHESE Surexpression •  Protéines cytosoliques modifiées:UPR •  Protéines du RE modifiées: UPS Exposition courte (72h00) à une mixture de PCBs (AROCLOR 1254) •  UPR: Analyse par western blot des protéines chaperonnes Grp58, GRP78 et PDI et niveau d expression des gènes par Q-PCR. •  UPS: Activité enzymatique du protéasome et quantification de l Ubiquitin par western blot. Aspects protéomiques et transcriptomiques si le temps le permet
  • 8. Impacts des perturbateurs endocriniens oestrogéniques et androgéniques sur le 8 système immunitaire de la truite arc-en-ciel Oncorhynchus mykiss P. Kestemont S. Massart système  reproducteur   Effets   système  immunitaire       Perturbateurs  endocriniens  (PE)   Expérience  in  vivo   Analyses  des  paramètres  immunitaires   Étude  transcriptomique   Exposi'on  des  poissons  et   Complément,  lysozyme,   Test  de  l’expression  de  gènes   prélèvements  des  organes   immunoglobulines,  distribu'on   spécifiques  par  qPCR   leucocytaire  
  • 9. 9 EDC et intersexualité chez les poissons. Incidence environnementale et approche in vitro des mécanismes cellulaires et moléculaires P. Kestemont S. Depiereux Effluents STP EDCs in vivo contamination in vitro contamination Validation in rivers with Effluent fragmentation sentinel species EE2 Effluent -EE2 -Estrone -Nonylphenol -Estradiol Transcriptomic signature Testis culture
  • 10. P. Kestemont Action du stress sur la régulation des mécanismes de10 R. Mandiki reproduction et d immunité chez les poissons C. Mathieu Confinement, densité, Stress aigu Hormones Territorialité/ ou chronique de stress comportement 5 5 5 5 5 55 5 5 55 5 5 5 55 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 5 5 20 5 5 20 5 5 20 5 5 205 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 20 60 02 02 Gouttelettes Gouttelettes 5 5 02 5 5 60 5 5 5 5 5 5 5 5 Effets délétères: lipidiques lipidiques 55 5 5 5 Mitochondrie 5 5 5 60 Mitochondrie 5 5 5 5 55 5 5 5 5 5 Gouttelettes 5 5 5 5 5 55 20 55 5 5 5 5 5 20 Mitochondrie20 55 55 5 5 lipidiques5 20 5 5 5 20 5 5 5 20 5 5 06 Glycogène tuoG Glycogène RER RER settelet eirdnohcotiM 205 20 20 u5 idipil20 se q 5 5 5 20 5 5 20 5 5 Glycogène 20 20 5 RER 5 5 20 5 5 5 5 5 5 5 5 5 560 5 5 Gouttelettes 20 20 6020 Gouttelettes lipidiques Mitochondrie RER enègocy20lG 20 20 Mitochondrie Gouttelettes Gouttelettes lipidiques 60 60 lipidiques lipidiques 60 60 Glycogène Mitochondrie Mitochondrie RER -  Système reproducteur - Immunité GouttelettesGouttelettes 60 Gouttelettes Glycogène Mitochondrie Mitochondrie RER lipidiques lipidiquesGlycogène lipidiques Glycogène RER Mitochondrie RER Approche in vitro Glycogène RER Glycogène Glycogène RER RER -  Mécanismes d’action: pas élucidés Approche in vivo -  Perche: pondeur unique -  Tilapia: pondeur multiple Géniteurs confinés vs Géniteurs + implants cortisol Culture d’organes lymphoïdes Organes: rate, foie, sang Rate – Leucocytes v  Réponse physiologique: + cortisol et/ou DOC Expression des récepteurs GR/RT-PCR Autres indicateurs de stress/RIA ou ELISA v  Réponse immunitaire Activité lysozyme, - CH50,- etc/Spectrométrie Expression des gènes de l’immunité/RT-PCR
  • 11. 11 Effects of nutritional status on environmental stress tolerance in green and white Sturgeon P. Kestemont SSO. Hung Decline  of  green  &  white  sturgeon  popula'ons   Habitat  loss  –  Overfishing  –  Pollu'on  (Se,  Hg)   Research hypotheses •  Higher nutritional status is positively correlated with tolerance to thermal and salinity stressors and to these stressors in combination. •  Sensitivity to environmental stressors is age dependent •  Green and white sturgeon species, with the same nutritional status, will respond differently to environmental stressors. Experiment: manipulation of nutritional status of WS & GS Responses: Fitness (swimming performance, UCTL), growth, RNA/DNA Resistance to environmental stressors Analysis of physiological and cellular responses (HSPs, apotosis, etc.) Co-promotor: Prof. S.S.O Hung
  • 12. 12 More info http://webapps.fundp.ac.be/system-ecotox Facebook group : www.facebook.com/pages/URBE/144441178954491