SlideShare une entreprise Scribd logo
1  sur  73
Télécharger pour lire hors ligne
UNIVERSITE CONSTANTINE 3 SALEH BOUBNIDER
FACULTE DE MEDECINE
Année universitaire: 2020/2021
La biologie moléculaire désigne l’étude des
acides nucléique, ribonucléique (ARN) et
désoxyribonucléique (ADN).
Ses techniques reposent essentiellement sur:
• Hybridation moléculaire,
• Réaction de polymérisation en chaine (PCR),
• Séquençage des acides nucléiques.
• Apparition en 1970,
• Développement exponentiel,
• Recueillir en quelques heures les données à
l’échelle du génome entier.
En parasitologie:
• Diagnostic de:
– Toxoplasmose,
– Paludisme,
– Leishmanioses,
– Candidoses et aspergilloses invasives.
• Bénéfice largement de l’apport des outils
moléculaires.
Diagnostic parasitologique direct :
• Manque de sensibilité,
• Ne permet pas toujours l’identification de
l’espèce,
• Personnel entraîné,
• Peu adapté à la détection de parasite
tissulaire.
Les techniques sérologiques :
• Nombreuses, commercialisées, standardisées, simple à
réaliser et automatisées.
• Inconvénients:
– Ne permet pas toujours différentier une infection évolutive
d’une immunité ancienne.
– Réactions croisées entre les Helminthes.
– Distinction difficile entre les parasites du même genre.
– Moins performantes chez les immunodéprimés.
Techniques mycologiques d’identification :
• 3 groupes de champignons:
– Levures,
– Champignons filamenteux,
– Champignons dimorphiques.
Techniques mycologiques d’identification :
Identification des levures:
– Caractéristiques morphologiques + Analyse des caractères
biochimiques (assimilation et fermentation des sucres) par
des tests standardisés.
– Tests: identifier avec précision les levures les plus
couramment identifiées en pathologie humaine
• Inconvénient:
– Insuffisantes pour l’identification des levures du genre
Trichosporon, des levures émergentes comme Candida
dubliniensis, C. famata.
Techniques mycologiques d’identification :
L'identification des champignons filamenteux:
• Caractères morphologiques.
• Inconvénient:
– Certains champignons filamenteux ont une
croissance lente et difficile sur les milieux
standards et ne développent pas touts les critères
nécessaires au diagnostic de l'espèce.
Techniques mycologiques d’identification :
Champignons dimorphiques:
• Identification dans des laboratoires
spécialisés à cause du risque de
contamination du manipulateur (Histoplasma
sp.).
Techniques mycologiques d’identification :
• Impossibilité d'obtenir une culture in vitro à
partir de prélèvement biologique due à
l'inhibition des culture par traitement
antifongique.
• Extraction des AN,
• Réaction de polymérisation en chaine (PCR),
• Séquençage des AN,
• Techniques de génotypage.
Extraction des AN:
• Étape initiale de l'examen de biologie
moléculaire.
• Objectif:
Isoler une quantité suffisante d'AN purifié.
Extraction des AN:
• 4 Étapes de l'extraction de L'AN à partir du sang, LCR, LBA, selles, urines..:
1. Lyse cellulaire: Libérer de L'AN de la cellule cible par lyse des parois et/ou
membranes..
2. Elimination des inhibiteurs de PCR: Inhibiteurs de PCR sont des
inhibiteurs d'ADN polymérase, leur présence dans l'échantillon donne des
faux négatifs. Ex: l'hémoglobine et les IgG dans le sang.
3. Inactivation des nucléases libérées.
4. Isolement de l'AN cibles: Séparation de l'AN des autres composés
solubles et sa concentration.
La PCR est une technique de biologie
moléculaire utilisé pour la détection d'ADN ou
d'ARN.
PRINCIPE:
• Amplification spécifique d'une séquence
nucléotidique:
• Repérer un fragment d'ADN ou de gène précis,
même en quantité infime dans un
prélèvement biologique, puis de le multiplier.
PRINCIPE:
• Utilisation d'une enzyme polymérase qui
permet de recopier à partir des amorces
nucléotidiques une séquence cible de L'ADN.
ACTEURS DE LA PCR:
• ADN cible: sous forme de double brin, contient le fragment à
amplifier.
• Amorces d'ADN: petits fragments complémentaires de chaque brin
de la séquence à amplifier, et correspond à une de ses 2 extrémités.
• Taq polymérase: ADN polymérase thermostable, extraite de la
bactérie Thermus aquaticus.
• 4 nucléotides: dGTP, dATP, dTTP, dCTP
(désoxynucléotides_tri_phosphates), qui sont utilisés par la Taq
polymérase pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires.
TECHNIQUE:
• PCR est constituée d'une trentaine de cycles chacun d'eux
comportant 3 étapes:
1. Dénaturation,
2. Hybridation,
3. Elongation.
• Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un
tube qui sera placé dans un thermocycleur qui permet de monter à
la température qui correspond à chaque étape rapidement.
• Chaque cycle dure 1 à 3 mn selon le type de l'appareillage.
TECHNIQUE:
1.Dénaturation:
• Tube chauffé quelques secondes à 94°C.
• Deux brins d'ADN se séparent.
TECHNIQUE:
2.Hybridation:
• Température rapidement abaissée à 55°C.
• Amorces s'hybrident sur leur séquence
complémentaire sur les brins d'ADN cible.
TECHNIQUE:
3.Elongation:
• Température augmentée à
72 °C,
• Taq polymérase ajouter des
nucléotides complémentaires
à la séquence cible, aux
amorces hybridées, dans le
sens 5' vers 3'.
TECHNIQUE:
• 1er cycle: 2 copies de la séquence d'ADN cible.
• 3ème cycle: apparaissent les amplicons (ADN
double brins borné par les amorces).
• 30 cycles: 1 h 30 à 4 h, 2³º copies de la
séquence cible.
Détection des amplicons:
• Produit d'amplification analysé par
électrophorèse.
• Séquence amplifiée apparaît sous forme de
bande après coloration au bromure
d'éthylium (molécule intercalante de l'ADN,
fluorescente à l'UV) ou après hybridation avec
une sonde correspondant à cette séquence.
TYPE DES TECHNIQUES PCR:
• PCR en point final "PCR conventionnelle ou
classique":
• PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR
quantitative ou qPCR:
• PCR multiplex:
• Nested PCR (PCR nichée):
TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR en point final "PCR conventionnelle
ou classique":
• Détection à partir du produit final de la
réaction.
TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR
quantitative ou qPCR:
• Mesurer la quantité d'ADN polymérisé à
chaque cycle grâce à l'utilisation d'amorces ou
de sondes fluorescentes.
TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR multiplex:
• Amplification de plusieurs
cibles simultanément dans
le même tube en utilisant
plusieurs couples d'amorces.
TYPE DES TECHNIQUES PCR:
Nested PCR (PCR nichée):
• Est une PCR en deux étapes:
– 1ère étape: PCR classique.
– 2ème étape: amplification de
l'amplicon à l'aide d'un couple
d'amorces situé dans la partie
interne de la séquence
précédemment amplifiée.
• Augmenter la sensibilité et
la spécificité.
Avantages et inconvénients:
Avantages:
• Technique rapide, sensible et spécifique.
• Applications nombreuses: recherche de
parasites, champignons, virus, oncogène..
Avantages et inconvénients:
Inconvénients:
• Nécessite des conditions optimales: amorces,
température, nombre de cycles...
• Inhibiteur de PCR.
• Risque de contamination: produit amplifié
contamine un tube prêt à être amplifié
donnant un faux positif.
Il consiste à déterminer l'ordre d'enchainement
des nucléotides pour un fragment d'ADN
donné.
Principaux types des techniques de
séquençage:
• Séquençage type Sanger:
• Séquençage haut débit (SHD OU NGS):
Séquençage type Sanger:
Méthode de synthèse enzymatique sélective
d'où on part d'un brin d'ADN dont on connait
au moins une partie de la séquence.
Séquençage type Sanger:
Technique:
• 1ère étape:
Synthèse d'un brin complémentaire d'un brin cible à l'aide d'une
polymérase à partir d'une amorce, en présence de:
– 4 désoxyribonucléotides
– Faible concentration de 4 didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP) dont chacun est marqué par un fluorochrome de
couleur différente qui jouent le rôle de terminateur de chaine
(stopper la polymérisation).
• 2ème étape:
Détection et enregistrement de la fluorescence en fonction de
temps et construire la séquence.
Séquençage haut débit (SHD OU NGS):
• Obtenir des millions de séquences de l'ordre
d'une centaine de paires de bases.
• Ne nécessitent pas une extraction particulière des
AN.
• Principales techniques de SHD:
– Étude du génome complet:
– Étude du génome ciblé:
Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Étude du génome complet:
• Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN
présent dans le prélèvement.
Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Étude du génome ciblé:
• Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN
après une 1ère PCR plus ou moins ciblée.
Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Lecture:
• Comparer les millions de brin d'ADN à un
génome ou séquence d'ADN dans la base des
données.
Techniques de génotypage sont fondées sur
l'analyse du polymorphisme génétique d'un
individu d'une même espèce.
2 types majeurs de polymorphisme sont
utilisés comme marqueurs génétique des
parasites et des champignons:
• Polymorphisme nucléotidique:
• Polymorphisme de longueur des
microsatellites:
Le polymorphisme nucléotidique:
• Variation d'un seul nucléotide à un endroit
précis du génome.
Le polymorphisme nucléotidique:
• 2 méthodes sont disponibles pour mettre en évidence le
polymorphisme nucléotidique:
– PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphisme):
Analyse le polymorphisme de restriction intragénique.
– MLST (multi locus sequence typing):
Fondée sur le séquençage d'ADN,
Analyse des séquences nucléotidiques de plusieurs loci codant
des fragment de gène de ménage (non soumis à des pressions
de sélection qui modifient l'interprétation des relations entre les
souches).
Le polymorphisme de longueur des
microsatellites:
• Microsatellites: répétitions en tandem d'un
court motif de bases nucléotidiques (2 à 5
nucléotides).
• Ex: TATATATATATATA OU CTCTCTCTCTCT
Le polymorphisme de longueur des
microsatellites:
• MEE de ce type de polymorphisme se fait en 2
étapes:
– Amplifier par PCR la séquence d'ADN contenant le
microsatellite.
– Analyse électrophorétique.
La PCR et ses variantes ont été largement
utilisées pour détecter l'ADN parasitaire à
partir de prélèvements biologiques variés:
sang, LBA, LCR, liquide amniotique, humeur
aqueuse, biopsie...
Méthodes moléculaires sont appliquées dans:
• Le diagnostic de certaines parasitoses,
• Recherche de marqueurs moléculaires de
résistance aux médicaments,
• Le typage des parasites.
Diagnostic de parasitoses:
• Toxoplasmose:
• Paludisme:
• Leishmaniose:
• Trypanosomoses américaine ou maladie de
Chagas:
• Amoebose:
Toxoplasmose:
Toxoplasmose congénitale:
• Diagnostic anténatal:
Diagnostic précoce par détection de l'ADN toxoplasmique
par technique PCR dans le liquide amniotique.
Résultat obtenu en 24 à 48 h (6 semaines /inoculation à la
souris).
La PCR est un examen indispensable.
• Diagnostic postnatal:
La PCR est pratiquée sur le placenta, couplée à la sérologie
du nouveau-né.
Toxoplasmose:
Toxoplasmose du sujet immunodéprimé:
• Sida:
Détection de l'ADN toxoplasmique dans LCR, sang,moelle
osseuse et LBA par technique PCR est un examen essentiel
pour le diagnostic des formes sévères.
• Greffe de moelle osseuse ou transplantation d'organe
(cœur, rein, foie):
PCR est un examen essentiel pour le diagnostic chez le
greffé par détection de l'ADN dans le sang, moelle osseuse
et biopsie du greffon.
Toxoplasmose:
Toxoplasmose oculaire:
• Détection de l'ADN toxoplasmique dans
l'humeur aqueuse par PCR.
Paludisme:
• PCR sur le sang: technique complémentaire des
méthodes conventionnelles du diagnostic (frottis
sanguin, gouttes épaisses et QBC).
• PCR facilite le diagnostic d'une espèce difficile sur
frottis sanguin lors de modification morphologique
sous l'effet du traitement.
• PCR et plus performante pour mettre en évidence des
associations d'espèce.
Leishmaniose viscérale:
• PCR sur le sang ou la moelle osseuse:
– Diagnostic,
– Suivi post thérapeutique,
• Avantage: sensibilité et rapidité.
Trypanosomoses américaine ou maladie
de Chagas:
• PCR permet un diagnostic précoce de la
maladie congénitale que la sérologie.
• La PCR est devenue extrêmement utile durant
la phase chronique de la maladie.
Amoebose:
• PCR est la technique de référence pour
distinguer Entamoeba histolytica (pathogène)
de l'E.dispar et l'E. moshkovski (non
pathogènes).
Recherche de marqueurs moléculaires de
résistance aux médicaments:
• La mise en évidence de polysmorphismes
nucléotidiques associés à de résistance du à P.
falciparum aux antipaludiques.
Typage parasitaire:
• Techniques moléculaires sont massivement utilisées pour le
typage des parasites, au niveau du genre, de l'espèce voire
de la souche.
• Ex:
– Souches de toxoplasmes,
– Espèces et souches de Leishmania,
– Espèces d'amibes,
– Génotype de Giardia intestinalis et Dientamoeba fragilis,
– Espèces de Blastocystis,
– Espèces de microsporidies et de Cryptosporidium,
– Espèce et génotype de Trichinella.
• Diagnostic:
• Exploration des mécanismes de résistance
aux antifongiques:
• Enquête épidémiologique:
Diagnostic:
Techniques de biologie moléculaire
permettent d'identifier avec précision les
espèces de champignons et de diagnostiquer
plus précocement:
• Infections fongiques invasives dues aux
levures du genre Candida et aux moisissures
du genre Aspergillus.
Exploration des mécanismes de résistance
aux antifongiques:
• Recherche des mutations associées à la
résistance, acquise sous traitement ou
d'origine environnementale.
• Ex:
– Résistance aux azolés de l'Aspergillus fumigatus,
– Résistance acquise des levures du genre Candida
aux échinocandines.
Enquête épidémiologique:
Typage moléculaire d'isolats de
l'environnement et de malades permet de
définir:
• Mode de transmission et
• Source des épidémies fongiques nosocomiales
(candidoses et aspergilloses).
Bibliographie:
1. ANOFEL. Parasitologie et mycologie médicale. Guide des analyses et pratiques
diagnostiques.
2. Guillaume V. fiches pratiques parasitologie sanguine.
3. Bessières M-H et al. Apport de la biologie moléculaire au diagnostic des
parasitoses. Elsevier SAS. Médecine et maladies infectieuses 35(2005) S52-S53.
4. Paugam A. Application de la biologie moléculaire au diagnostic de la
toxoplasmose et d’autres protozooses. Elsevier, Paris. Revue française des
laboratoires,1999, N°315.
5. Cassaing S. et al. Biologie moléculaire et quantification: application en
parasitologie. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2002, N°351.
6. Bougnoux M-E. Nouvelles applications des techniques de biologie moléculaire en
mycologie médicale. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2003,
N°351.
7. Paugam A. Apports et limites de la biologie moléculaire en mycologie médicale.
Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,1999, N°315.
8. Vassias I. Principe de l’amplification en chaine par polymérase. EMC biologie
médicale 2012 ;7(1):1-5 [ article 90-60-001-A].
Biologie moleculaire en parasitologie et mycologie

Contenu connexe

Tendances

Techniques de concentration en parasitologie
Techniques de concentration en parasitologieTechniques de concentration en parasitologie
Techniques de concentration en parasitologieS/Abdessemed
 
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...Pasteur_Tunis
 
La recherche des parasites sanguicoles
La recherche des parasites sanguicolesLa recherche des parasites sanguicoles
La recherche des parasites sanguicolesIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Les technique de protozoaires
Les technique de protozoairesLes technique de protozoaires
Les technique de protozoairesabir
 
Atlas de poche microbiologie
Atlas de poche   microbiologieAtlas de poche   microbiologie
Atlas de poche microbiologieS/Abdessemed
 
Les examens bactériologiques
Les examens bactériologiquesLes examens bactériologiques
Les examens bactériologiquesMeriamme Oue
 
Parasitologie
ParasitologieParasitologie
ParasitologieMansour1
 
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halima
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halimaDermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halima
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halimaIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Sérologie de la rubéole
Sérologie de la rubéole Sérologie de la rubéole
Sérologie de la rubéole S/Abdessemed
 
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...Dr Taoufik Djerboua
 
Photothèque:parasitologie
Photothèque:parasitologiePhotothèque:parasitologie
Photothèque:parasitologieS/Abdessemed
 
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptx
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptxFlagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptx
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Coloration et examen des frottis sanguins
Coloration et examen des frottis sanguinsColoration et examen des frottis sanguins
Coloration et examen des frottis sanguinsS/Abdessemed
 
La famille des Enterobacteriaceae
La famille des EnterobacteriaceaeLa famille des Enterobacteriaceae
La famille des EnterobacteriaceaeDr Taoufik Djerboua
 
Generalites sur les champignons dermatophyties
Generalites sur les champignons   dermatophytiesGeneralites sur les champignons   dermatophyties
Generalites sur les champignons dermatophytiesRIADH HAMMEDI
 

Tendances (20)

Techniques de concentration en parasitologie
Techniques de concentration en parasitologieTechniques de concentration en parasitologie
Techniques de concentration en parasitologie
 
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...
Le séquençage haut débit: NGS, une révolution de la biologie moléculaire au s...
 
La recherche des parasites sanguicoles
La recherche des parasites sanguicolesLa recherche des parasites sanguicoles
La recherche des parasites sanguicoles
 
Amibes
AmibesAmibes
Amibes
 
Les technique de protozoaires
Les technique de protozoairesLes technique de protozoaires
Les technique de protozoaires
 
Atlas de poche microbiologie
Atlas de poche   microbiologieAtlas de poche   microbiologie
Atlas de poche microbiologie
 
Les examens bactériologiques
Les examens bactériologiquesLes examens bactériologiques
Les examens bactériologiques
 
Parasitologie
ParasitologieParasitologie
Parasitologie
 
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halima
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halimaDermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halima
Dermatophytes et dermatophyties dr benlaribi imane halima
 
COURS 2 PCR.ppt
COURS 2 PCR.pptCOURS 2 PCR.ppt
COURS 2 PCR.ppt
 
Sérologie de la rubéole
Sérologie de la rubéole Sérologie de la rubéole
Sérologie de la rubéole
 
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...
Les tests de sensibilite aux antibiotiques / Antimicrobial susceptibility tes...
 
Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie
Le diagnostic biologique du paludisme par microscopieLe diagnostic biologique du paludisme par microscopie
Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie
 
Amibes et amibiases
Amibes et amibiasesAmibes et amibiases
Amibes et amibiases
 
Photothèque:parasitologie
Photothèque:parasitologiePhotothèque:parasitologie
Photothèque:parasitologie
 
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptx
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptxFlagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptx
Flagellés et ciliés des cavités ouvertes Dr Benlaribi 2023.pptx
 
Nematodes a transmission per os
Nematodes a transmission per osNematodes a transmission per os
Nematodes a transmission per os
 
Coloration et examen des frottis sanguins
Coloration et examen des frottis sanguinsColoration et examen des frottis sanguins
Coloration et examen des frottis sanguins
 
La famille des Enterobacteriaceae
La famille des EnterobacteriaceaeLa famille des Enterobacteriaceae
La famille des Enterobacteriaceae
 
Generalites sur les champignons dermatophyties
Generalites sur les champignons   dermatophytiesGeneralites sur les champignons   dermatophyties
Generalites sur les champignons dermatophyties
 

Similaire à Biologie moleculaire en parasitologie et mycologie

Techniques de PCR.pptx
Techniques de PCR.pptxTechniques de PCR.pptx
Techniques de PCR.pptxHICHAM215202
 
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdf
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdfcours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdf
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdfkristinacraft1
 
Biologie_moleculaire_CA.pdf
Biologie_moleculaire_CA.pdfBiologie_moleculaire_CA.pdf
Biologie_moleculaire_CA.pdfMajdaHelal
 
La pcr
La  pcr La  pcr
La pcr BeTy10
 
Les Empreintes Genetiques
Les Empreintes GenetiquesLes Empreintes Genetiques
Les Empreintes GenetiquesLonexax
 
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...Pôle Qualiméditerranée
 
Anticorps thérapeutiques
Anticorps thérapeutiquesAnticorps thérapeutiques
Anticorps thérapeutiquesSofia Azirar
 
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques Ayyoub lachgar
 
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitroLa réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitroInstitut Pasteur de Madagascar
 
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèlesEntomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèlesInstitut Pasteur de Madagascar
 

Similaire à Biologie moleculaire en parasitologie et mycologie (20)

Exposé pcr
Exposé pcrExposé pcr
Exposé pcr
 
Techniques de PCR.pptx
Techniques de PCR.pptxTechniques de PCR.pptx
Techniques de PCR.pptx
 
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdf
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdfcours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdf
cours2pcr-221104185906-d4700dd6.pdf
 
Clonage
ClonageClonage
Clonage
 
Biologie_moleculaire_CA.pdf
Biologie_moleculaire_CA.pdfBiologie_moleculaire_CA.pdf
Biologie_moleculaire_CA.pdf
 
La pcr
La  pcr La  pcr
La pcr
 
Nothern blot
Nothern blotNothern blot
Nothern blot
 
Les Empreintes Genetiques
Les Empreintes GenetiquesLes Empreintes Genetiques
Les Empreintes Genetiques
 
Le diagnostic : méthodes
Le diagnostic : méthodesLe diagnostic : méthodes
Le diagnostic : méthodes
 
Les puces à adn
Les puces à adnLes puces à adn
Les puces à adn
 
Pourquoi un diagnostic du paludisme ?
Pourquoi un diagnostic du paludisme ?Pourquoi un diagnostic du paludisme ?
Pourquoi un diagnostic du paludisme ?
 
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...
Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesur...
 
puce à adn
puce à adnpuce à adn
puce à adn
 
Puce à ADN
Puce à ADN Puce à ADN
Puce à ADN
 
Southern blot
Southern blotSouthern blot
Southern blot
 
Anticorps thérapeutiques
Anticorps thérapeutiquesAnticorps thérapeutiques
Anticorps thérapeutiques
 
ADN et génotypage
ADN et génotypageADN et génotypage
ADN et génotypage
 
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques
Marqueurs microsatellites et recherche d’amorces spécifiques
 
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitroLa réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro
La réponse immunitaire cellulaire et les mesures in vitro
 
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèlesEntomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles
Entomologie moléculaire et étude de la structuration génétique des anophèles
 

Plus de IMANE HALIMA BENLARIBI

LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptx
LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptxLES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptx
LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptx
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptxECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptx
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptx
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptxLES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptx
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptx
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptxPARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptx
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptx
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptxLes protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptx
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptx
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptxLES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptx
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptxIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane Halima
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane HalimaLes amibes libres Dr. benlaribi Imane Halima
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane HalimaIMANE HALIMA BENLARIBI
 
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halima
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halimaDiagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halima
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halimaIMANE HALIMA BENLARIBI
 

Plus de IMANE HALIMA BENLARIBI (8)

LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptx
LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptxLES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptx
LES BABESIOSES ET LES THEILERIOSES Dr Benlaribi Imane Halima.pptx
 
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptx
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptxECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptx
ECHINOCOCCOSE KYSTIQUE Dr BENLARIBI I H ACTUALITE 2024.pptx
 
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptx
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptxLES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptx
LES PRELEVEMENT EN PARASITOLOGIE Dr BENLARIBI IMANE HALIMA.pptx
 
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptx
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptxPARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptx
PARASITOSES, MYCOSES ET SIDA DR BENLARIBI.pptx
 
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptx
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptxLes protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptx
Les protozoaires de la cavité buccale CHIRURGIE DENTAIRE 2023 24.pptx
 
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptx
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptxLES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptx
LES TRYPANOSOMOSES DR BENLARIBI IMANE.pptx
 
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane Halima
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane HalimaLes amibes libres Dr. benlaribi Imane Halima
Les amibes libres Dr. benlaribi Imane Halima
 
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halima
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halimaDiagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halima
Diagnostic des opportunistes dr benlaribi imane halima
 

Biologie moleculaire en parasitologie et mycologie

  • 1. UNIVERSITE CONSTANTINE 3 SALEH BOUBNIDER FACULTE DE MEDECINE Année universitaire: 2020/2021
  • 2. La biologie moléculaire désigne l’étude des acides nucléique, ribonucléique (ARN) et désoxyribonucléique (ADN).
  • 3. Ses techniques reposent essentiellement sur: • Hybridation moléculaire, • Réaction de polymérisation en chaine (PCR), • Séquençage des acides nucléiques.
  • 4. • Apparition en 1970, • Développement exponentiel, • Recueillir en quelques heures les données à l’échelle du génome entier.
  • 5. En parasitologie: • Diagnostic de: – Toxoplasmose, – Paludisme, – Leishmanioses, – Candidoses et aspergilloses invasives. • Bénéfice largement de l’apport des outils moléculaires.
  • 6. Diagnostic parasitologique direct : • Manque de sensibilité, • Ne permet pas toujours l’identification de l’espèce, • Personnel entraîné, • Peu adapté à la détection de parasite tissulaire.
  • 7. Les techniques sérologiques : • Nombreuses, commercialisées, standardisées, simple à réaliser et automatisées. • Inconvénients: – Ne permet pas toujours différentier une infection évolutive d’une immunité ancienne. – Réactions croisées entre les Helminthes. – Distinction difficile entre les parasites du même genre. – Moins performantes chez les immunodéprimés.
  • 8. Techniques mycologiques d’identification : • 3 groupes de champignons: – Levures, – Champignons filamenteux, – Champignons dimorphiques.
  • 9. Techniques mycologiques d’identification : Identification des levures: – Caractéristiques morphologiques + Analyse des caractères biochimiques (assimilation et fermentation des sucres) par des tests standardisés. – Tests: identifier avec précision les levures les plus couramment identifiées en pathologie humaine • Inconvénient: – Insuffisantes pour l’identification des levures du genre Trichosporon, des levures émergentes comme Candida dubliniensis, C. famata.
  • 10. Techniques mycologiques d’identification : L'identification des champignons filamenteux: • Caractères morphologiques. • Inconvénient: – Certains champignons filamenteux ont une croissance lente et difficile sur les milieux standards et ne développent pas touts les critères nécessaires au diagnostic de l'espèce.
  • 11. Techniques mycologiques d’identification : Champignons dimorphiques: • Identification dans des laboratoires spécialisés à cause du risque de contamination du manipulateur (Histoplasma sp.).
  • 12. Techniques mycologiques d’identification : • Impossibilité d'obtenir une culture in vitro à partir de prélèvement biologique due à l'inhibition des culture par traitement antifongique.
  • 13. • Extraction des AN, • Réaction de polymérisation en chaine (PCR), • Séquençage des AN, • Techniques de génotypage.
  • 14. Extraction des AN: • Étape initiale de l'examen de biologie moléculaire. • Objectif: Isoler une quantité suffisante d'AN purifié.
  • 15. Extraction des AN: • 4 Étapes de l'extraction de L'AN à partir du sang, LCR, LBA, selles, urines..: 1. Lyse cellulaire: Libérer de L'AN de la cellule cible par lyse des parois et/ou membranes.. 2. Elimination des inhibiteurs de PCR: Inhibiteurs de PCR sont des inhibiteurs d'ADN polymérase, leur présence dans l'échantillon donne des faux négatifs. Ex: l'hémoglobine et les IgG dans le sang. 3. Inactivation des nucléases libérées. 4. Isolement de l'AN cibles: Séparation de l'AN des autres composés solubles et sa concentration.
  • 16. La PCR est une technique de biologie moléculaire utilisé pour la détection d'ADN ou d'ARN.
  • 17. PRINCIPE: • Amplification spécifique d'une séquence nucléotidique: • Repérer un fragment d'ADN ou de gène précis, même en quantité infime dans un prélèvement biologique, puis de le multiplier.
  • 18. PRINCIPE: • Utilisation d'une enzyme polymérase qui permet de recopier à partir des amorces nucléotidiques une séquence cible de L'ADN.
  • 19. ACTEURS DE LA PCR: • ADN cible: sous forme de double brin, contient le fragment à amplifier. • Amorces d'ADN: petits fragments complémentaires de chaque brin de la séquence à amplifier, et correspond à une de ses 2 extrémités. • Taq polymérase: ADN polymérase thermostable, extraite de la bactérie Thermus aquaticus. • 4 nucléotides: dGTP, dATP, dTTP, dCTP (désoxynucléotides_tri_phosphates), qui sont utilisés par la Taq polymérase pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires.
  • 20. TECHNIQUE: • PCR est constituée d'une trentaine de cycles chacun d'eux comportant 3 étapes: 1. Dénaturation, 2. Hybridation, 3. Elongation. • Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un tube qui sera placé dans un thermocycleur qui permet de monter à la température qui correspond à chaque étape rapidement. • Chaque cycle dure 1 à 3 mn selon le type de l'appareillage.
  • 21. TECHNIQUE: 1.Dénaturation: • Tube chauffé quelques secondes à 94°C. • Deux brins d'ADN se séparent.
  • 22. TECHNIQUE: 2.Hybridation: • Température rapidement abaissée à 55°C. • Amorces s'hybrident sur leur séquence complémentaire sur les brins d'ADN cible.
  • 23. TECHNIQUE: 3.Elongation: • Température augmentée à 72 °C, • Taq polymérase ajouter des nucléotides complémentaires à la séquence cible, aux amorces hybridées, dans le sens 5' vers 3'.
  • 24.
  • 25.
  • 26. TECHNIQUE: • 1er cycle: 2 copies de la séquence d'ADN cible. • 3ème cycle: apparaissent les amplicons (ADN double brins borné par les amorces). • 30 cycles: 1 h 30 à 4 h, 2³º copies de la séquence cible.
  • 27.
  • 28. Détection des amplicons: • Produit d'amplification analysé par électrophorèse. • Séquence amplifiée apparaît sous forme de bande après coloration au bromure d'éthylium (molécule intercalante de l'ADN, fluorescente à l'UV) ou après hybridation avec une sonde correspondant à cette séquence.
  • 29.
  • 30.
  • 31. TYPE DES TECHNIQUES PCR: • PCR en point final "PCR conventionnelle ou classique": • PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR quantitative ou qPCR: • PCR multiplex: • Nested PCR (PCR nichée):
  • 32. TYPE DES TECHNIQUES PCR: PCR en point final "PCR conventionnelle ou classique": • Détection à partir du produit final de la réaction.
  • 33. TYPE DES TECHNIQUES PCR: PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR quantitative ou qPCR: • Mesurer la quantité d'ADN polymérisé à chaque cycle grâce à l'utilisation d'amorces ou de sondes fluorescentes.
  • 34. TYPE DES TECHNIQUES PCR: PCR multiplex: • Amplification de plusieurs cibles simultanément dans le même tube en utilisant plusieurs couples d'amorces.
  • 35. TYPE DES TECHNIQUES PCR: Nested PCR (PCR nichée): • Est une PCR en deux étapes: – 1ère étape: PCR classique. – 2ème étape: amplification de l'amplicon à l'aide d'un couple d'amorces situé dans la partie interne de la séquence précédemment amplifiée. • Augmenter la sensibilité et la spécificité.
  • 36. Avantages et inconvénients: Avantages: • Technique rapide, sensible et spécifique. • Applications nombreuses: recherche de parasites, champignons, virus, oncogène..
  • 37. Avantages et inconvénients: Inconvénients: • Nécessite des conditions optimales: amorces, température, nombre de cycles... • Inhibiteur de PCR. • Risque de contamination: produit amplifié contamine un tube prêt à être amplifié donnant un faux positif.
  • 38. Il consiste à déterminer l'ordre d'enchainement des nucléotides pour un fragment d'ADN donné.
  • 39. Principaux types des techniques de séquençage: • Séquençage type Sanger: • Séquençage haut débit (SHD OU NGS):
  • 40. Séquençage type Sanger: Méthode de synthèse enzymatique sélective d'où on part d'un brin d'ADN dont on connait au moins une partie de la séquence.
  • 41. Séquençage type Sanger: Technique: • 1ère étape: Synthèse d'un brin complémentaire d'un brin cible à l'aide d'une polymérase à partir d'une amorce, en présence de: – 4 désoxyribonucléotides – Faible concentration de 4 didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) dont chacun est marqué par un fluorochrome de couleur différente qui jouent le rôle de terminateur de chaine (stopper la polymérisation). • 2ème étape: Détection et enregistrement de la fluorescence en fonction de temps et construire la séquence.
  • 42.
  • 43. Séquençage haut débit (SHD OU NGS): • Obtenir des millions de séquences de l'ordre d'une centaine de paires de bases. • Ne nécessitent pas une extraction particulière des AN. • Principales techniques de SHD: – Étude du génome complet: – Étude du génome ciblé:
  • 44. Séquençage haut débit (SHD OU NGS): Étude du génome complet: • Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN présent dans le prélèvement.
  • 45. Séquençage haut débit (SHD OU NGS): Étude du génome ciblé: • Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN après une 1ère PCR plus ou moins ciblée.
  • 46. Séquençage haut débit (SHD OU NGS): Lecture: • Comparer les millions de brin d'ADN à un génome ou séquence d'ADN dans la base des données.
  • 47.
  • 48.
  • 49. Techniques de génotypage sont fondées sur l'analyse du polymorphisme génétique d'un individu d'une même espèce.
  • 50. 2 types majeurs de polymorphisme sont utilisés comme marqueurs génétique des parasites et des champignons: • Polymorphisme nucléotidique: • Polymorphisme de longueur des microsatellites:
  • 51. Le polymorphisme nucléotidique: • Variation d'un seul nucléotide à un endroit précis du génome.
  • 52. Le polymorphisme nucléotidique: • 2 méthodes sont disponibles pour mettre en évidence le polymorphisme nucléotidique: – PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphisme): Analyse le polymorphisme de restriction intragénique. – MLST (multi locus sequence typing): Fondée sur le séquençage d'ADN, Analyse des séquences nucléotidiques de plusieurs loci codant des fragment de gène de ménage (non soumis à des pressions de sélection qui modifient l'interprétation des relations entre les souches).
  • 53. Le polymorphisme de longueur des microsatellites: • Microsatellites: répétitions en tandem d'un court motif de bases nucléotidiques (2 à 5 nucléotides). • Ex: TATATATATATATA OU CTCTCTCTCTCT
  • 54. Le polymorphisme de longueur des microsatellites: • MEE de ce type de polymorphisme se fait en 2 étapes: – Amplifier par PCR la séquence d'ADN contenant le microsatellite. – Analyse électrophorétique.
  • 55.
  • 56. La PCR et ses variantes ont été largement utilisées pour détecter l'ADN parasitaire à partir de prélèvements biologiques variés: sang, LBA, LCR, liquide amniotique, humeur aqueuse, biopsie...
  • 57. Méthodes moléculaires sont appliquées dans: • Le diagnostic de certaines parasitoses, • Recherche de marqueurs moléculaires de résistance aux médicaments, • Le typage des parasites.
  • 58. Diagnostic de parasitoses: • Toxoplasmose: • Paludisme: • Leishmaniose: • Trypanosomoses américaine ou maladie de Chagas: • Amoebose:
  • 59. Toxoplasmose: Toxoplasmose congénitale: • Diagnostic anténatal: Diagnostic précoce par détection de l'ADN toxoplasmique par technique PCR dans le liquide amniotique. Résultat obtenu en 24 à 48 h (6 semaines /inoculation à la souris). La PCR est un examen indispensable. • Diagnostic postnatal: La PCR est pratiquée sur le placenta, couplée à la sérologie du nouveau-né.
  • 60. Toxoplasmose: Toxoplasmose du sujet immunodéprimé: • Sida: Détection de l'ADN toxoplasmique dans LCR, sang,moelle osseuse et LBA par technique PCR est un examen essentiel pour le diagnostic des formes sévères. • Greffe de moelle osseuse ou transplantation d'organe (cœur, rein, foie): PCR est un examen essentiel pour le diagnostic chez le greffé par détection de l'ADN dans le sang, moelle osseuse et biopsie du greffon.
  • 61. Toxoplasmose: Toxoplasmose oculaire: • Détection de l'ADN toxoplasmique dans l'humeur aqueuse par PCR.
  • 62. Paludisme: • PCR sur le sang: technique complémentaire des méthodes conventionnelles du diagnostic (frottis sanguin, gouttes épaisses et QBC). • PCR facilite le diagnostic d'une espèce difficile sur frottis sanguin lors de modification morphologique sous l'effet du traitement. • PCR et plus performante pour mettre en évidence des associations d'espèce.
  • 63. Leishmaniose viscérale: • PCR sur le sang ou la moelle osseuse: – Diagnostic, – Suivi post thérapeutique, • Avantage: sensibilité et rapidité.
  • 64. Trypanosomoses américaine ou maladie de Chagas: • PCR permet un diagnostic précoce de la maladie congénitale que la sérologie. • La PCR est devenue extrêmement utile durant la phase chronique de la maladie.
  • 65. Amoebose: • PCR est la technique de référence pour distinguer Entamoeba histolytica (pathogène) de l'E.dispar et l'E. moshkovski (non pathogènes).
  • 66. Recherche de marqueurs moléculaires de résistance aux médicaments: • La mise en évidence de polysmorphismes nucléotidiques associés à de résistance du à P. falciparum aux antipaludiques.
  • 67. Typage parasitaire: • Techniques moléculaires sont massivement utilisées pour le typage des parasites, au niveau du genre, de l'espèce voire de la souche. • Ex: – Souches de toxoplasmes, – Espèces et souches de Leishmania, – Espèces d'amibes, – Génotype de Giardia intestinalis et Dientamoeba fragilis, – Espèces de Blastocystis, – Espèces de microsporidies et de Cryptosporidium, – Espèce et génotype de Trichinella.
  • 68. • Diagnostic: • Exploration des mécanismes de résistance aux antifongiques: • Enquête épidémiologique:
  • 69. Diagnostic: Techniques de biologie moléculaire permettent d'identifier avec précision les espèces de champignons et de diagnostiquer plus précocement: • Infections fongiques invasives dues aux levures du genre Candida et aux moisissures du genre Aspergillus.
  • 70. Exploration des mécanismes de résistance aux antifongiques: • Recherche des mutations associées à la résistance, acquise sous traitement ou d'origine environnementale. • Ex: – Résistance aux azolés de l'Aspergillus fumigatus, – Résistance acquise des levures du genre Candida aux échinocandines.
  • 71. Enquête épidémiologique: Typage moléculaire d'isolats de l'environnement et de malades permet de définir: • Mode de transmission et • Source des épidémies fongiques nosocomiales (candidoses et aspergilloses).
  • 72. Bibliographie: 1. ANOFEL. Parasitologie et mycologie médicale. Guide des analyses et pratiques diagnostiques. 2. Guillaume V. fiches pratiques parasitologie sanguine. 3. Bessières M-H et al. Apport de la biologie moléculaire au diagnostic des parasitoses. Elsevier SAS. Médecine et maladies infectieuses 35(2005) S52-S53. 4. Paugam A. Application de la biologie moléculaire au diagnostic de la toxoplasmose et d’autres protozooses. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,1999, N°315. 5. Cassaing S. et al. Biologie moléculaire et quantification: application en parasitologie. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2002, N°351. 6. Bougnoux M-E. Nouvelles applications des techniques de biologie moléculaire en mycologie médicale. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2003, N°351. 7. Paugam A. Apports et limites de la biologie moléculaire en mycologie médicale. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,1999, N°315. 8. Vassias I. Principe de l’amplification en chaine par polymérase. EMC biologie médicale 2012 ;7(1):1-5 [ article 90-60-001-A].