Cours complet du Dr.Sc.Leunis

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Cours complet sur le rôle de la flore intestinale Gram négatif et des oxydations par le groupe NO dans les pathologies neuro-dégénératives

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Cours complet du Dr.Sc.Leunis

  1. 1. Rôle de la flore intestinale Gramnégatif et des oxydations par legroupe NO dans les pathologies neuro-dégénératives J.C. Leunis Dr.Sc.Chimiste-Biochimiste-Biologiste Laboratoire ATEGIS
  2. 2. Les bactéries de l’écosystème intestinal :population de l’ordre de 500 espèces degermes saprophytes.Deux groupes :a)une flore dominante Gram positif, anaérobie stricte (99 % de la population).b) une flore sous-dominante Gram négatif.
  3. 3. Gramnégatif : une activité toxique liée à lacomposition de la structure membranaire dece type de bactérie. Activité toxique = « endotoxine »
  4. 4. Endotoxines : complexes macromoléculaires,fragments de membranes contenant deslipopolysaccharides (LPS) ancrés dans lacouche externe de la membrane.Les LPS sont présents de manièreconstitutive dans la membrane externe detoutes les bactéries Gram négatif.Chaque espèce de bactérie Gram négatifproduit un LPS spécifique.
  5. 5. La paroi des bactéries Gram positives et Gram négatives Porine Gram négative Lipoprotéine Chaînes latérales O de Braun Liposaccharide (LPS) Membrane externe Espace périplasmique et peptidoglycane Gram positive Membrane Phospholipides Peptidoglycane plasmique Acides Protéines lipotéichoïques Acides intrinsèque téichoïques Peptidoglycane Espacepériplasmique Membrane plasmique
  6. 6. Structure schématique : Les endotoxines : constituants hétérogènescomposées de trois régions principales:
  7. 7. 1. Le lipide A : sucres aminés et des acides gras variables selon les espèces bactériennes.Les principaux acides gras à courtes chaînescomposant le lipide A et estérifiant les sucressont les suivants :- l’acide laurique : H3C-(CH2)10-COOH,- l’acide myristique : H3C-(CH2)12-COOH,- l’acide palmitique : H3C-(CH2)14-COOH,- l’acide -hydroxymyristique : H3C-(CH2)11-CHOH-COOH.Pourquoi sont-ils saturés ? Réponse en fin d’exposé. Lintégrité de la structure du lipide A est nécessaire à lactivité toxique.
  8. 8. 2)Lecore oligosaccharidique fait le lien entre lelipide A et les sucres. Il est spécifique dune espèceà une autre (par exemple chez Salmonella : 5heptoses, 3 pentoses, 2 octoses).3) Les chaînes-O spécifiques formées par desunités répétitives portant les déterminantsantigéniques
  9. 9. Rôles des LPS1. Rôle de structure indispensable à la viabilité de la bactérie.2. Effet de barrière vis-à-vis des molécules hydrophobes.3. Barrière contre les protéines lytiques du complément.
  10. 10. Effets des LPS sur l’hôte1) hyperthermie2) agrégation des hématies3) activation du complément4) choc septique5) diminution de la pression artérielle6) activation de la coagulation7) activation du facteur XII (fibrinogène → fibrine)8) induction prostagl.E2 et A2, PAF et leucotriènes9) effet mitogène sur les lymphocytes BLa toxicité est uniquement liée au lipide A.
  11. 11. Lipide A : ne circule jamais libre dans le sang.Toujours complexé à des fragments de membranesbactériennes ou à des protéines transporteuses :l’albumine, la LBP -oula LPS binding protein -, desanticorps ou à des lipoprotéines du malade.Différentes cellules répondent aux endotoxines :- monocytes ou macrophages circulants- macrophages : production de °NO et de cytokines- cellules endothéliales par la forme solubledurécepteur CD14 présent dans le plasma (3 à 6 g/ml).- Rôle des TLR ou Toll-like receptors
  12. 12. Les Toll-like receptors ou TLRLes TLR sont des récepteurs de l’immunité innée quireconnaissent des structures à la fois exogènes etendogènes des microorganismes.Les TLR font partie de la famille de PRRs ou Pattern-Recognition Receptors.Ils reconnaissent les motifs moléculaires de diverspathogènes,motifsconservés au cours l’évolution, lesPAMPS ou les Pathogen-Associated Molecular Patternstels que des motifs bactériens, viraux,parasitaires etpolymériques comme des polysaccharides, protéines,des ARN ainsi que les ADN simple brin.
  13. 13. La stimulation des récepteurs CD14 et CD18 par lescomplexes LPS-LBP (LBP = LPS Binding Protein)induit la production du TNF, dIL-1, dIL-6 et d’IFN-ainsi qu’une augmentation de l’activité des NK.La production de NO est augmentée par le LPSqui stimule la iNOSCette stimulation du TNF, du NO, de l’IFN- et desNK explique l’activité antitumoraledu LPS.La glycoprotéine MD-2 intimement liée au TLR4 estindispensable à la reconnaissance innée du LPS parle TLR4. La MD-2 soluble = opsonine.
  14. 14. Voie d’activation du macrophageInduction de cytokines pro-inflammatoires
  15. 15. Rôles des cytokines produitesIL-1 produit par les macrophages et les cellules endothéliales. Rôle dans la fièvre, stimule la production de prostaglandines. Pyrogène (hypothalamus) Induit la diapédèse leucocytaire. Active Toll par MyD88 adaptateur de transduction activant les kinases IRAK qui amplifient le signal orchestrant l’inflammation.IL-6 produit par les macrophages, production induite par lIL-1. Régule la phase inflammatoire.IL-8 produit par les macrophages et les cellules endothéliales. Recrute neutrophiles. Rôle capital dans la recrutement leucocytaire et lechimiotactisme.Lensemble de ces cytokines a un effet bénéfique en permettant ledéveloppement dune réaction inflammatoire qui participe à lélimination delagent bactérien.
  16. 16. Le monoxyde d’azote : °NOLe radical °NO est messager multifonctionnel généré à partir del’arginine et par les NO synthases , 3 isoenzymes :- NOS constitutive- NOS endothéliale- NOS inductible ou iNOSLPS stimule iNOS dans les macrophages qui se mettent àproduire du NO, un puissant oxydant.But : détruire bactéries – champignons – cellules tumorales par inhibition de synthèse de l’ADN.Oxydation non contrôlée : ROS + NO → ONOO- peroxynitrite
  17. 17. A une agression doit correspondre une réponse immune correctement adaptée• Ladaptation fait appel à une participation équilibrée de différentes cellules du système immunitaire et parmi celles-ci on compte :• les lymphocytes T• les lymphocytes B• les cellules NK• les cellules dendritiques - APC• les macrophages• les mastocytes• des cellules myéloïdesCe que lon appelle " l’immunité " est la résultante d’une communication entre 2 systèmes :• L’immunité innéeréponse rapide, pas de spécificité antigénique et donc pas de mémoire• L’immunité adaptativeréponse lente avec mémoire de contact : LTm
  18. 18. L’immunité innée :Ensemble de défenses anti-infectieuses immédiatement mobilisables et faisant appel à la fois à des cellules et des facteurs solubles dont :• les neutrophiles• les phagocytes mono- et polynucléaires (monocytes et macrophages)• les cellules NK par le biais de l’IL-2• probablement des sous-population de cellules B : les Mz-B de la rate (Marginal zone B cells), et les B1 des cavités pleurales.• des facteurs du système du complément : les C3 et C4• des peptides antimicrobiens : les lantibiotiques de 20 à 40 aa (eucaryotes)• le lysozyme (qui doit avoir subi un choc oxydant pour être actif, d’où l’importance de l’activité myéloperoxydasique lors d’une infection bactérienne)• le TNF-a réprimant la réplication virale (sauf celle du virus HIV)• la transferrine et la lactoferrine régulant le fer disponible• la fibronectine qui en tapissant les bactéries induit le C3 et la phagocytose• la flore intestinale
  19. 19. Immunité adaptative Le système immun adaptatif met en jeu les lymphocytes T et B, la coopération entre ces cellules étant orchestrée par des macrophages. Les cellules mises en jeu sont :• descellules présentatrices d’antigènes (APC) ce sont des macrophages. On peut les appeler les sentinelles du système immunitaire.• Le rôle principal de ces cellules est la surveillance et la capture des antigènes qui seront apprêtés et puis associés aux molécules du complexe majeur dhistocompatibilité (CMH II) avant dêtre présentés aux lymphocytes T.• des cellules régulatrices (Th ou CD4)• des cellules effectrices (CD8 - NK -Lympho B)
  20. 20. L’immunité innée dépend de la génétique• L’immunité innée fait appel à des macrophages possédant « génétiquement » des récepteurs pour des antigènes (Ag) dérivant de groupes de pathogènes plutôt que des récepteurs pour des Ag spécifiques.• Il y aurait environ 50 gènes impliqués dans la réponse innée.• Parmi les Ag induisant l’immunité innée on compte :• - les LPS des Gram – (macrophages/monocytes CD14)• - le peptidoglycane et l’acide lipotéichoïque des Gram+• - la flagelline,• - des polysaccharides,• - des protéoglycans,• - de l’ARN double brin.
  21. 21. La peste (LPS de Yersinia pestis) Virulence : a) paralysie du système immunitaire inné, b) LPS tétra-acétylé non détecté par TLR4, c) APC maintenues immatures, d) Blocage de l’immunité adaptative. Pas d’inflammation mais infection létale. Si hexa-acétylation : reconnaissance par le TLR4 > inflammation > immunitéNature Immunology, 2006, 7, 1017-1019.
  22. 22. Augmentation de la concentrationplasmatique des LPS dans le sang :a) apport graisseuxb) résistance à l’insuline(Amar et Burcelin, Diabetes, avril 2007).Un régime gras modifie la flore intestinale etfacilite le passage de LPS au niveau del’intestin.=> Lien LPS – Diabète II
  23. 23. Rôle de la flore intestinale La citation de Pasteur : « un germe donne une maladie » est dépassée.
  24. 24. Yersinia enterolytica : - entérite- spondylarthrite si HLA B27+- maladie de CrohnSi HLA DR3 + :anticorps contre récepteur TSH thyroïditeauto-immuneMais ce n’est pas parce que le gène DR3 estprésent que le patient fera nécessairement lamaladie auto-immune. Cf. Haplotype étendu.Klebsiella pneumoniae, Pseudomonasaeruginosa et Helicobacter pylori,également associées à la SPA
  25. 25. En 2004, M. Geffard trouve, dans la SEP, laprésence d’anticorps IgM et IgA dirigés contredes constituants des germes intestinaux.D.Bodet et al. Immuno-analyse & Biologie spécialisée 19, 2004, 138-147.Divers LPS testés dans le modèle d’encéphaliteallergique expérimentale (EAE) chez le rat.Tous les LPS ne sont pas inducteurs de crised’encéphalite !Il y aurait une spécificité moléculaire liée auxLPS qui reconnaissent la protéine basique dela myéline (MBP).
  26. 26. Dans la SEP on ne détecte que des IgM et des IgA.La raison serait liée à : - la nature des néo-antigènes - leurs faibles poids moléculaires (haptènes) - la réponse auto-immune ferait appel à une sous-population de cellules B : les Mz-B de la rate -Marginal zone B cells et les B1 des cavités pleurales dont la réponse n’est pas médiée par les APC. Lanti-idiotypie de type IgM jouerait un rôle par neutralisation de la réponse Th1 (MAI). Autre possibilité : les cytokines moduleraient la production du type danticorps IgM et IgA. IL-5 et TGF-bIgA, IFN et IL-4IgG.
  27. 27. Prenons l’exemple de la SEP, nous constatons que :1)dans les phases rémittentes, on mesure surtout des IgM2)dans la phase dévolution progressive,on trouve des IgM et des IgA Avec le temps, les IgM disparaissent et lapparition des IgA correspond à une forme irréversible de la SEP. Il y aurait une spécificité moléculaire liée aux LPS qui reconnaissent la MBP.
  28. 28. Dans le cadre de l’étiologie oxydative des maladiesautoimmunes neurodégénératives certains types de composésou de fonctions chimiques jouent un rôle important :1) Le radical MDA2) Le radical °NO.3) La fonction amide -CO-NH-Exemple : CH3-( CH2 )7 -CH=CH- ( CH2 )7-COOH ac. oléique+NO ou NO2-HOOC-( CH2 )7 -COOH ac. azélaïqueHOOC-( CH2 )7-CO-NH amide azélaïqueFonction amide : rôle dans l’interface Protéine-Phospholipide telque entre la protéine basique de la myéline et lesphospholipides. C’est la fonction amide qui est importante.
  29. 29. On peut schématiser le processus de crise de SEP :Facteurs étiologiques dont LPS initiateurs de phases doxydation (NO) mobilisation des Ag membranaires réponse autoimmune démyélisation de la membrane crise de SEP
  30. 30. Dès la naissance, que des IgM dirigés contre le Soineutralisés ensuite par des IgG (anti-idiotypie). Cependant, dans la sclérose en plaques on ne trouve pas dIgG. Traitement de la SEP : corticoïdes, lIFN- et immunosuppresseurs. Ce type de traitement nest pas spécifique, ilengendre une immuno-suppression généralisée et donc tout à fait inadaptée.Peakman introduit l’idée d’une immunothérapie par des antigènes spécifiques. Mark Peakman, Colin M.Dayan., Immunology 2001, 104, 361-366.
  31. 31. Dun point de vue thérapeutique, il faudrait maintenir le patient dans la phase rémittente et mettre en œuvre un traitement bloquant lévolution progressive.
  32. 32. Autre approche thérapeutique : apport dimmunoglobulines. Ig en i.v. réprime la production des cytokines IL-2 et dIFN- par les Th1.L’auto-immunité fait partie de l’immunité adaptative,dans le pool d’immunoglobulines apportées aumalade, il doit donc se trouver des anticorps anti-idiotypiques de type IgM bloquant la réponse Th1.On peut aussi espérer pouvoir utiliser unethérapeutique basée sur des leurres immunologiquespermettant de dévier les anticorps IgM vers des ciblesmimant la composition lipidique de la myéline.
  33. 33. DC = sentinelles de lauto-immunité.Les DC– dendritic cells- vivent deux états différents :un état immature et un état mature.A létat immature, en labsence de stimuliinflammatoires, les DC captent par pinocytose toutesles molécules se trouvant à leur portée, même lesantigènes du soi.Dans cet état immature, les DC nactivent pas leslymphocytes T :Induction d’un état de tolérance et de suppression.
  34. 34. Dans un contexte peu inflammatoire, ou lors duneinfection limitée, les DC sont faiblement activéesmais suffisamment pour alerter le systèmeimmunitaire. Ce qui permet la différenciation de cellules Tm sans induire de réponse innée.
  35. 35. LPS antigène détecté par des récepteurs designaux de danger.Signaux de danger maturation des DC et migrationvers les ganglions, interaction avec les cellules T etstimulation de cytokines.Nous pensons que le maintien des DC dans l’étatimmature (ou le renversement de la maturationdes DC ?) doit pouvoir ouvrir la voie à desnouvelles thérapeutiques des maladies auto-immunes.Certains composés naturels empêchent la maturationdes cellules DC, parmi ceux-ci le FK 506, Tacrolimus,immunosuppresseur isolé à partir du Streptomycestsukabaensis, offre de nouvelles perspectives.
  36. 36. LPS et Maf (macrophage activating factor)Tant les LPS que le Gcmaf activent les macrophages.• Mais il n’y a jamais de stimulation simultanée ou concomitante.• On assiste à une affinité compétitive entre LPS et Gcmaf.• L’affinité du Gcmaf est nettement plus élevée pour les macrophages que l’affinité des LPS pour les macrophages. L’activation des macrophages par les LPS est fortement diminuée, si pas inhibée, par le Gcmaf dont la Gc ne peut pas être saturée en vitamine D.. Utilisation de leurres « immunologiques » de type polylysine portant les acides gras composant la myéline et mis au point par Geffard.• D’où nouvelles sources thérapeutiques.
  37. 37. LPS et MafRappelons que la stimulation du macrophage par unLPS provoque :• 1. une production de NO* et ONOO*• 2. une perte de contrôle redox.• 3. une cholestase et évidemment desTr.digestifs.• 4. une production d’Ac• 5. une auto-immunitéCe qui n’est pas le cas du Gcmaf constitutif.Mais il est trop tôt pour juger l’apport thérapeutiquede Gcmaf et ses conséquences immunologiques tant dansles cancers que dans le SFC.
  38. 38. Approches diagnostiques et thérapeutiques• Dosages des divers anticorps cf.analyses 07 et 08• Profil IPL cf. demande d’analyses poste 02• Profil phytothérapeutique cf. poste 01 demande d’analyses• Aromatogramme sur les selles cf. poste 06• Importance des huiles essentielles• Traiter la dysbiose intestinale• Phytothérapie• Réponse à la question page 7 : parce qu’il est difficile d’oxyder des acides gras saturés.
  39. 39. Références1.Normalization of leaky gut in chronic fatigue syndrome (CFS) is accompanied by a clinical improvement:effects of age, duration of illness and the translocation of LPS from gram-negative bacteria.• Maes M, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Dec;29(6):902-10.• 2.• An IgM-mediated immune response directed against nitro-bovine serum albumin (nitro-BSA) in chronic fatigue syndrome (CFS) and major depression: evidence that nitrosative stress is another factor underpinning the comorbidity between major depression and CFS.• Maes M, Mihaylova I, Kubera M, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Jun;29(3):313-9.• 3.• The gut-brain barrier in major depression: intestinal mucosal dysfunction with an increased translocation of LPS from gram negative enterobacteria (leaky gut) plays a role in the inflammatory pathophysiology of depression.• Maes M, Kubera M, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2008 Feb;29(1):117-24.• 4.• Increased serum IgM antibodies directed against phosphatidyl inositol (Pi) in chronic fatigue syndrome (CFS) and major depression: evidence that an IgM-mediated immune response against Pi is one factor underpinning the comorbidity between both CFS and depression.• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2007 Dec;28(6):861-7.
  40. 40. Références• 5.• Normalization of the increased translocation of endotoxin from gram negative enterobacteria (leaky gut) is accompanied by a remission of chronic fatigue syndrome.• Maes M, Coucke F, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2007 Dec;28(6):739-44.• 6.• Chronic fatigue syndrome is accompanied by an IgM-related immune response directed against neopitopes formed by oxidative or nitrosative damage to lipids and proteins.• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2006 Oct;27(5):615-21.• 7.• Increased serum IgA and IgM against LPS of enterobacteria in chronic fatigue syndrome (CFS): indication for the involvement of gram-negative enterobacteria in the etiology of CFS and for the presence of an increased gut- intestinal permeability.• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.• J Affect Disord. 2007 Apr;99(1-3):237-40. Epub 2006 Sep 27.• 8.• In chronic fatigue syndrome, the decreased levels of omega-3 poly-unsaturated fatty acids are related to lowered serum zinc and defects in T cell activation.• Maes M, Mihaylova I, Leunis JC.• Neuro Endocrinol Lett. 2005 Dec;26(6):745-51.
  41. 41. Références9. IgM-mediated autoimmune responses directed against anchorage epitopes are greater in Myalgic Encephalomyelitis/Chronic Fatigue Syndrome (ME/CFS) than in major depression. Maes M, Mihaylova I, Kubera M, Leunis JC, Twisk FN, Geffard M. Metab Brain Dis. 2012 May 22. [Epub ahead of print]10. Increased IgA and IgM responses against gut commensals in chronic depression: Further evidence for increased bacterial translocation or leaky gut. Maes M, Kubera M, Leunis JC, Berk M. J Affect Disord. 2012 Mar 11. [Epub ahead of print]11. Increased IgA responses to the LPS of commensal bacteria is associated with inflammation and activation of cell-mediated immunity in chronic fatigue syndrome. Maes M, Twisk FN, Kubera M, Ringel K, Leunis JC, Geffard M. J Affect Disord. 2012 Feb;136(3):909-17. Epub 2011 Oct 2.
  42. 42. MERCI et RESTEZ CURIEUX

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