Virus de l'hépatite A et E
                 Virus et marqueurs diagnostiques




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Historique VHA
 “La Jaunisse”
 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
 1908 : McDonald, "notion de virus…"
 Reproduction d...
Virus de l’Hépatite A


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Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
         Attachement

                               Libération     ...
Propriétés Physiques du VHA
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Génotypes et
         phylogénie
    VP1/P2A
    Génotypes : >15% variations
    Sous types : 7.5% variations




     D'a...
VHA : Paramètres Biologiques
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination
IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)

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Marqueurs biochimiques

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Difficultés diagnostiques
                                     En routine
                   Adresser prélèvements
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Historique VHE
       Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
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VHE                                           Virus non enveloppé
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Similarités des souches humaines et animales
Bilic et al. Journal of General Virology
          (2009), 90, 863–873




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                                  Culture et Modèles animaux

• Culture
       Difficile...
VHE : Paramètres Biologiques

                                                                  Titre peu élevé
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Immunodépression, hépatite chronique et
                stratégie diagnostique




     Dans le cadre d'une investigation ...
Stratégie Diagnostique
                        Se donner les moyens de faire le diagnostic

                Diagnostic Ind...
Adresser les prélèvements
                              au
             Centre national de référence du VHE

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Thibault Vha Vhe

  1. 1. Virus de l'hépatite A et E Virus et marqueurs diagnostiques Vincent THIBAULT Laboratoire de Virologie Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière Assistance Publique Hôpitaux de Paris V.Thibault DU_janv.-2010 1 Hépatites virales mode de transmission préférentiel parentéral féco-oral B non A, non B A 1965 D 1972 1977 C E 1990 1991 F, G, TTV, autres… V.Thibault DU_janv.-2010 2
  2. 2. Historique VHA “La Jaunisse” 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques 1908 : McDonald, "notion de virus…" Reproduction de la maladie 1942 : Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum Entité clinique : 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum") Visualisation : 1973 (Feinstone) Développement de la sérologie : épidémiologie 1979 : culture (Provost et Hilleman) 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques 1991… : Vaccination 2006 : Déclaration obligatoire V.Thibault DU_janv.-2010 3 Virus de l'hépatite A V.Thibault DU_janv.-2010 4
  3. 3. Virus de l’Hépatite A • Famille : Picornaviridae Capside (entérovirus type 72) • Genre : hépatovirus • Taille 27-32 nm 27-32nm ARN (+) • Non enveloppé • Structure icosaèdrique • ARN simple brin, Vpg • polarité positive • lié de façon covalente à une protéine Vpg V.Thibault DU_janv.-2010 5 P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa IRES 3 Traduction 2A A-B VP2 VP3 VP1 2B 2C 3C (PRO) 3D (POL) poly- protéine VP4 2 227 AA ? Vpg Protéase Liaison NTP Hélicase ARN VP0 Polymérase VP2 VP3 VP1 Réplication VP4 2A VP2 VP3 VP1 X5 – X12 VP4 Protéines de surface 2A Maturation finale immunogénicité V.Thibault DU_janv.-2010 6
  4. 4. Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules Attachement Libération Réplication du génome Espace + de Disse - ire Traduction ce l l u l a Synthèse + de la polyprotéine - rane Memb P3 Maturation P2 Réticulum endoplasmique P1 Empaquetage Canalicule Relargage biliaire V.Thibault DU_janv.-2010 7 VHA : physiopathologie Absence d'effet cytopathique direct : cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte, médiation cellulaire médiation humorale V.Thibault DU_janv.-2010 8
  5. 5. Propriétés Physiques du VHA Agents Stabilité Chaleur Autoclavage (121°C, 20') Inactivation 100°C Inactivation 60°C Stable 1 heure température ambiante Stable 1 mois (selles, eaux, sols) Plusieurs jours sur surface sèche 4 h. Sur les mains 4°C Stable plusieurs mois Congelé Stable des mois ou années Acide-base pH 1 : stable 5 h. PH 3-11 : stable au moins 30' U.V. Inactivation Chimiques Chlore, ozone, Inactivation glutaraldéhyde, iode Alcool 70° 3' : inactivation partielle V.Thibault DU_janv.-2010 9 Variabilité génétique P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa Comparaison nucléotidique 7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII Homme : génotype I (90%), (III, II=VII) Singes : IV, V, VI Sérotype unique Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3 Tests immunologiques Vaccination (HM175, CR326) virus inactivé cultivé sur MRC-5 V.Thibault DU_janv.-2010 10
  6. 6. Génotypes et phylogénie VP1/P2A Génotypes : >15% variations Sous types : 7.5% variations D'après Nainan et al. 2006 Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79 IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, Kenya VI Nonhuman primate, Indonesia Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates in the VP1/P2B region (315-bp fragment). V.Thibault DU_janv.-2010 11 Répartition mondiale des génotypes Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert. Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7. V.Thibault DU_janv.-2010 12
  7. 7. VHA : Paramètres Biologiques Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique) protection contre réinfection Ag foie IgG Symptomes Ictère VHA Selles IgM VHA Sang 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 V.Thibault DU_janv.-2010 13 Semaines IgM HAV uniquement à bon escient ! 1% 11 % 82 % Faux positifs Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887 Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV 32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86) Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection… NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË V.Thibault DU_janv.-2010 14
  8. 8. Marqueurs biochimiques Diagnostic  Transaminases (ALAT, ASAT)  Bilirubine  Phosphatase alcaline  Facteurs de coagulation Sérologie +++ IgM anti VHA : infection récente IgG anti VHA : infection passée ou vaccination IgM et IgG anti VHA Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études] Virémie : techniques sensibles (105 v./mL) Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante (109v./mL), épidémiologie Salive : IgG (ELISA) V.Thibault DU_janv.-2010 15 Génome viral (RT-PCR) Hépatite A : le vaccin virus inactivé AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie  Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC- 5 , inactivé HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue  Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines diploïdes MRC5 Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard. La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur jusqu'à 10 ans (20 ans ?) après primo-immunisation. Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17 V.Thibault DU_janv.-2010 16
  9. 9. Difficultés diagnostiques En routine Adresser prélèvements au Centre national de référence du VHA Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse 12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-2010 17 SRAS ? Hépatite E ? Grippe V.Thibault DU_janv.-2010 18
  10. 10. Historique VHE Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites 1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH" Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A : Inde : prévalence de l’hépatite A importante Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan) Hépatite à J36 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm) Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus) Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB) 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage "VHE" 1991 : Tam et al. VHE 2000 : Panda et al. cDNA infectieux V.Thibault DU_janv.-2010 19 V.Thibault DU_janv.-2010 20
  11. 11. VHE Virus non enveloppé Sphérique (SRV) Famille : Hepeviridae Surface irrégulière Genre : Hepevirus Capside 27-34 nm Symétrie icosaédrique ARN simple brin hélice droite polarité + 7,5kb poly-A extrémité 3’ Stabilité Au laboratoire : instable(-70 à +8°C) Décongélation/congélation Tractus GI : stable (pH) V.Thibault DU_janv.-2010 21 Organisation génomique Non structurales Structurales 7 200 nt ARN polarité + 3’NC 5’ NC 28 5109 7124 Poly-A ORF3 MeT Y Pro P X Hel RdRp ORF2 Génotypes 1-3 Protéines DIAGNOSTIC immunogènes Hétérogénéité génétique Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux : Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype  Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)  Vaccin : ORF 2 recombinante V.Thibault DU_janv.-2010 22
  12. 12. Similarités des souches humaines et animales Bilic et al. Journal of General Virology (2009), 90, 863–873 humaines aviaires Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region V.Thibault DU_janv.-2010 23 Similarités des souches humaines et animales Zhao et al. Journal of Medical Virology 81:1371–1379 (2009) Phylogenetic tree of based on full-length sequences HEV genotypes 1, 2, 3, 4, and avian HEV and the new genotype from rabbits. V.Thibault DU_janv.-2010 24
  13. 13. V.Thibault DU_janv.-2010 25 Culture et Modèles animaux • Culture Difficile Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus) Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007) Cellule embryonnaire • Modèles animaux Primates : reproduction de la pathologie humaine Volontaires... VHE du porc, du poulet Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton... V.Thibault DU_janv.-2010 26
  14. 14. VHE : Paramètres Biologiques Titre peu élevé protection contre réinfection ? IgG Symptomes Ictère VHE Selles IgM VHE Sang 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 V.Thibault DU_janv.-2010 27 Jours HEV – virémie- selle transmission serum salive Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM IgG autologue IgM Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75. V.Thibault DU_janv.-2010 28
  15. 15. Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé, La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée ! (ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR) Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748 V.Thibault DU_janv.-2010 29 Stratégie Diagnostique Marqueurs non biologiques circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie) A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?) clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez l'immunocompétent ! ) Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D) Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès) Marqueurs sérologiques spécifiques IgM anti-HEV IgG anti-HEV (+++) RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles) V.Thibault DU_janv.-2010 30
  16. 16. Stratégie Diagnostique Se donner les moyens de faire le diagnostic Diagnostic Indirect Diagnostic Direct Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur IgM anti VHE prélèvements sang et selles IgG anti VHE Diagnostic IgG IgM RT-PCR Certain ++ ++ + Probable - ou + - + Douteux +++ - - Immunité ancienne + - - V.Thibault DU_janv.-2010 31 VHE et vaccination 20 µg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium. 3 injections Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE Efficacité : 95,5% après 3 doses Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9 V.Thibault DU_janv.-2010 32
  17. 17. Adresser les prélèvements au Centre national de référence du VHE Dr E Nicand Laboratoire de biologie HIA Val de Grâce Tel : 01 40 51 40 00 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-2010 33

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