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Quantification des phages par qPCR : Optimisation <ul><li>Traitement à la DNase I: </li></ul><ul><ul><ul><li>DNase I : Sig...
Quantification des phages par qPCR <ul><li>Production de phages pour toutes les souches (sauf VTH7 et 90.0105)  </li></ul>...
Expression des gènes stx1 et eae : Optimisation Choix du kit d’extraction :  RNeasy ®  Mini kit (Qiagen) , Pure Link™ RNA ...
Profil d’expression des gènes  stx1  et  eae Profil 1   Profil 2   Profil 3 Profil 1   Profil 2   Profil 3    Augmentatio...
Conclusions <ul><li>Sensibilité différente des souches à la mitomycine    Profil 1, 2 et 3 </li></ul><ul><li>Souches alim...
Perspectives <ul><li>Etudier l’impact des phages stx sur la cinétique de croissance (mécanisme de lyse) </li></ul><ul><li>...
Merci de votre attention
Perte de phage Testé sur la souche 277.2 (stx1/stx2) à T24h après dénombrement : Sur 30 colonies en  condition A  :    To...
Dénombrement de la souche 277.2 En condition B, les dénombrement effectués à T8h et T24h ne sont pas corréler aux DO     ...
Epidémie en Allemagne <ul><li>  Source :  graines  </li></ul><ul><li>  germées </li></ul><ul><li>Sérotype :  O104:H4 </li>...
Epidémie en France Source :  Steak haché Sérogroupe :   O157 Séropathotype :  A
Bilan des connaissances <ul><li>Induction/acquisition de phages stx:  in vitro </li></ul><ul><li>Production de phage </li>...
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Appréciation moléculaire du risque lié à la présence d’E. coli O26:H11 dans les aliments

  1. 1. Appréciation moléculaire du risque lié à la présence d’ E. coli O26:H11 dans les aliments Master de Sciences et Technologies Mention Biologie Moléculaire et Cellulaire Spécialité Microbiologie Niveau 2 Parcours Microbiologie - Appliquée – Environnement - Santé Masson Patricia ANSES – Laboratoire de sécurité des aliments de Maisons-Alfort Unité EDB Encadrant de stage : Frédéric Auvray
  2. 2. Les STEC : E. coli producteurs de Shiga toxines Mb cytoplasmique Paroi/mb externe: Lipopolysaccharides (LPS) antigène somatique « O » ou sérogroupe (n=181) Flagelle: antigène flagellaire « H » (n=56) E.coli cytoplasme Colites hémorragiques, SHU STEC
  3. 3. Les STEC : E. coli producteurs de Shiga toxines (Karmali et al, 2003) King et al , 2009 Séro pathotype Association épidémies Association SHU, CH Sérotypes Incidence relative A fréquente oui O157:H7, O157:NM élevée D rare non multiple E multiple n.a. n.a. faible non humain C rare oui O91:H21, O113:H21, O104 :H21, etc… faible B moins fréquente oui O26:H11, O103:H2, O111:H8, O145:H28 O121:H19 modérée Dangerosité Principaux sérogroupes de STEC responsables de SHU chez l’enfant de moins de 15 ans en France 1996 - 2009
  4. 4. Les facteurs de virulence chromosome Plasmide pEHEC ehxA katP catalase-peroxydase enterohémolysine Locus d’effacement des entérocytes (LEE ) Système de sécrétion de type III O Islands (OI-122, OI-71, OI-57…) Effecteurs de type III (N= 32) (ex: TccP, NleB, NleE, EspL…) Intimine Effecteurs de type III Prophage - stx2  7 sous-types - stx1  4 sous-types espP Serine protease Rosenshine et al . 1996 Gyles et al . 2008 Pedroso et al . 1993 Atteintes intestinales, rénales et neurologiques eae stxA stxB
  5. 5. Les facteurs de virulence : Les shiga toxines Prophage Division Division Multiplication du génome phagique Perte du prophage (très rare) 1ère étape: attachement du phage à la bactérie hôte Capside ADN phage Injection ADN phage Encapsidation des génomes phagiques Cycle lytique Cycle lysogénique Lyse de la bactérie et libération des phages * Lésions ADN (UV, antibiotique, etc…)  Mise en place du système SOS libération Stx SHU induction stx * infection d’autres E.coli émergence de nouveaux clones
  6. 6. <ul><li>Préciser le risque associé à la présence d’ E. coli O26:H11 dans les aliments </li></ul><ul><li>Analyse de la stabilité des phages stx chez les STEC O26:H11 ( in vitro, au cours de l’isolement ?) </li></ul><ul><ul><li> Étude de la capacité à produire des phages (in vitro) </li></ul></ul><ul><ul><li> Étude du niveau d’expression des gènes stx (RT-PCR) </li></ul></ul>Contexte et Objectifs Etude sur 400 fromages au lait cru (2009) => Prévalence non négligeable de STEC O26:H11 et d’ E. coli O26:H11 stx- Induction de phages stx: in vitro => entre 18 % et 89% des STEC produisent des phages en présence de mitomycine C (Garcia-Aljaro et al . 2009; Muniesa et al . 2004) Induction des phages stx in vivo : => Isolement de souches stx- chez les animaux et chez l’homme Objectifs du stage:
  7. 7. Matériels et Méthodes Isolement sur boite de Pétri 24h à 37°C Préculture dans un bouillon de TSB 18-24h à 37°C 240rpm Ensemencement à 5% d’un nouveau bouillon TSB contenant 0,5 mM de CaCl 2 final À DO 600nm ≈ 0.3 A = Sans ATB B = MitoC 0.5µg/ml Cinétique sur 24h à 37°C 240rpm À T24h, Centrifugation, récupération du surnageant, Filtration, Traitement à la DNase et Traitement à 100°C Quantification des phages stx Profil de croissance des souches O26:H11 À T15, T30, T1, T2, T4 et T8h : 1ml pour Centrifugation, récupération du culot, Extraction des ARN totaux, Traitement à la DNase, Reverse Transcription Profil d’expression des gènes stx 1 et eae
  8. 8. Cinétique de croissance Exemple de la souche 51.2 (stx1 + ) Exemple de la souche 329 S 89 (stx1 + ) Exemple de la souche 6061/96 (stx2 + ) Profil 1 Profil 2 Profil 3 9 / 26 dont : 6 alimentaires 2 humaines 1 bovine 10 / 26 dont : 2 alimentaires 8 humaines 7 / 26 dont : 4 alimentaires 2 humaines 1 bovine
  9. 9. Quantification des phages par qPCR : Optimisation <ul><li>Traitement à la DNase I: </li></ul><ul><ul><ul><li>DNase I : Sigma, kit TURBO DNA- free™ ( Ambion) , DNase I recombinant (Roche) </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Quantité de DNase  2U/µl </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Incubation dans un tampon  OUI </li></ul></ul></ul><ul><li>Traitement efficace </li></ul><ul><li>Mais pas de dégradation à 100% </li></ul><ul><li> Soustraction de l’ADN bactérien (O26) à l’ADN phagique (stx) </li></ul>
  10. 10. Quantification des phages par qPCR <ul><li>Production de phages pour toutes les souches (sauf VTH7 et 90.0105) </li></ul><ul><li>Nb de phages en condition B > Nb de phages en condition A  Induction par la mitomycine C </li></ul><ul><li>Quantité Phages stx2 > stx1 </li></ul><ul><li>Pour stx1, différence souches alimentaires/humaines : la quantité de phages en condition B est supérieur à 2log/µl pour : </li></ul><ul><li>- 9/13 des souches alimentaires </li></ul><ul><li>- 2/9 des souches humaines </li></ul><ul><li>Pas de corrélation entre ∆DO et la quantité de phages libérés : </li></ul><ul><li>- 129.2 et L23A : ∆DO faible et stx élevé </li></ul><ul><li>93-624 et 96-723 : ∆DO élevé et stx faible </li></ul>
  11. 11. Expression des gènes stx1 et eae : Optimisation Choix du kit d’extraction : RNeasy ® Mini kit (Qiagen) , Pure Link™ RNA Mini Kit (Ambion) et High Pure RNA Isolation kit (Roche) Traitement à la DNase  dans la colonne selon kit et post-colonne avec Kit TURBO™ DNA- free Programme qPCR  Passage de 20 sec à 10min lors de l’étape de dénaturation pour l’activation de l’enzyme Echantillon ng/µl A260/A280 A260/A230 RN 170.2 A1 426,3 2,06 2,18 RN 170.2 A2 331,3 2,09 1,57 HP 170.2 A1 430 2,06 1,99 HP 170.2 A2 397,5 2,09 2,33 PL 170.2 A1 254,2 2,11 2,13 PL 170.2 A2 358,1 2,09 2,11 RN 170.2 A1 489,2 1,99 1,82 RN 170.2 A2 492 1,98 1,4 HP 170.2 A1 374,5 1,95 1,65 HP 170.2 A2 459,9 2 1,95 PL 170.2 A1 239,5 2,01 1,69 PL 170.2 A2 325,9 2 1,68 23 S (2,9kb) 16S (1.5kb) M RN PL HP M
  12. 12. Profil d’expression des gènes stx1 et eae Profil 1 Profil 2 Profil 3 Profil 1 Profil 2 Profil 3  Augmentation de l’expression de stx1 d’un facteur 7 à 10 en présence de mitomycine  Augmentation de l’expression de eae jusqu’à un facteur 5 en présence de mitomycine
  13. 13. Conclusions <ul><li>Sensibilité différente des souches à la mitomycine  Profil 1, 2 et 3 </li></ul><ul><li>Souches alimentaires  Profil 1 Souches humaines  Profil 3 </li></ul><ul><li>Pas de corrélation entre ∆DO et la quantité de phages synthétisés : Intervention d’autres facteurs? - Présence d’autres phages </li></ul><ul><li>- Taux de croissance de la bactérie </li></ul><ul><li> Patrimoine génétique de la bactérie </li></ul><ul><li>Libération de phages : - Toutes les souches ne produisent pas la même quantité de phages (conditions spontanée et induite) </li></ul><ul><li> - induite > spontanée  Mitomycine C </li></ul><ul><li> - stx2 > stx1 </li></ul><ul><li>RT-PCR : ↑ de l’expression stx1 et eae en présence de mitomycine </li></ul>
  14. 14. Perspectives <ul><li>Etudier l’impact des phages stx sur la cinétique de croissance (mécanisme de lyse) </li></ul><ul><li> Réalisation de dénombrements (en complément de la lecture de DO) </li></ul><ul><li>incluant un dénombrement des colonies stx- (hybridation sur colonies) </li></ul><ul><li> Cinétique de croissance de souches dépourvues de leur phage stx </li></ul><ul><li>Améliorer la méthode de quantification des phages </li></ul><ul><li> purification des phages par ultracentrifugation </li></ul><ul><li> conforter la quantification des ADN bactériens par un autre gène  fliC H11 </li></ul><ul><li>Dosage des toxines Stx </li></ul><ul><li> Test ELISA </li></ul><ul><li>Comparaison de l’expression des gènes stx et eae pour l’ensemble des souches </li></ul>
  15. 15. Merci de votre attention
  16. 16.
  17. 17. Perte de phage Testé sur la souche 277.2 (stx1/stx2) à T24h après dénombrement : Sur 30 colonies en condition A :  Toutes sont stx1/stx2 Sur 30 colonies en condition B :  29 sont stx1/stx2  1 est uniquement stx1 Testé sur les souches stx1 F15-313 et 238.2 à T24h après dénombrement : Sur 24 colonies de chaque souche:  Aucune stx- <ul><li>Dans la littérature : </li></ul><ul><li>Perte de phage: Fréquence de la perte spontanée des phages stx (sans mitomycine C) au sein d’une culture pure de STEC O26:H11 => 10 à 14% des cellules sont stx -négatives </li></ul><ul><li>- Perte des phages stx chez les animaux : 23 % souches O157:H7 stx -négatives (Wetzel and Lejeune 2007) </li></ul><ul><li>- Perte des phages stx chez les patients : isolement d’E.coli stx- chez 5.5% des patients (Bielaszewska et al . 2007) </li></ul>
  18. 18. Dénombrement de la souche 277.2 En condition B, les dénombrement effectués à T8h et T24h ne sont pas corréler aux DO  Filamentation ? T8h T24h A B A B DO600nm 2 1,54 2 0,62 Dénombrement (UFC/ml) 1,13E+09 2,69E+08 3,75E+09 2,63E+08 1,12E+09 4,50E+07 1,33E+09 1,21E+08
  19. 19. Epidémie en Allemagne <ul><li> Source : graines </li></ul><ul><li> germées </li></ul><ul><li>Sérotype : O104:H4 </li></ul><ul><li>Séropathotype : C </li></ul><ul><li>Jamais impliqués dans épidémie, seulement des cas sporadiques en Allemagne en 2001 et Corée en 2005 </li></ul><ul><li>93 % du génome de ces souches est identique à celui de bactéries E. coli enteroaggrégatif (EAggAC)  ont gènes permettant de se maintenir dans intestin de façon plus stable </li></ul><ul><li>Variant : stx2 </li></ul><ul><li>Transfert horizontale du phage stx2 des STEC vers EAggAC? </li></ul>
  20. 20. Epidémie en France Source : Steak haché Sérogroupe : O157 Séropathotype : A
  21. 21. Bilan des connaissances <ul><li>Induction/acquisition de phages stx: in vitro </li></ul><ul><li>Production de phage </li></ul><ul><li>=> entre 18 % et 89% STEC produisent des phages en présence de mitomycine C </li></ul><ul><li>Garcia-Aljaro et al . 2009 (79 STEC, eaux usées, 35 sérotypes) </li></ul><ul><li>Muniesa et al . 2004 (168 STEC, bovins, 71 sérotypes) </li></ul><ul><li>Bielaszewska et al . 2007 </li></ul>

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