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Projet de recherches1f
- 1. Projet de recherches: Détermination du mécanisme catalytique d’une enzyme bi-fonctionnelle, l’aminopeptidase B Biogenèse des Signaux Peptidiques Université Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques » Année 2009-2010 Présenté par Patricia Masson
- 4. I. L’aminopeptidase B Distribution tissulaire Localisation subcellulaire Enzyme ubiquitaire Intestin grêle Epididyme Testicule Cerveau Muscle Cœur Poumon Foie 72kDa 72kDa Pancréas Rein Gros intestin Estomac Rate
- 8. II. Connaissances actuelles (Haeggström et al., 1993)
- 9. III. Projet et Objectifs But : Identifier des résidus ayant un rôle dans la spécificité de reconnaissance du substrat et le mécanisme enzymatique Mutagenèse dirigée Alignements de séquences Système d’expression Modèle moléculaire de l’Ap-B
- 15. IV. Perspectives Décrypter les mécanismes catalytiques Informations sur les spécificités et mécanismes enzymatiques des aminopeptidases de la famille M1 Concevoir des inhibiteurs spécifiques Expression de l’Ap-B dans différentes pathologies
Notes de l'éditeur
- Les précurseurs d’hormones et de neuropeptides subissent une maturation pour aboutir à la formation des messagers peptidiques. Lors de cette maturation, on a hydrolyse de ces précurseurs au niveau d'acides aminés basiques (lysine, arginine)qui se présente en doublets et ceci fait intervenir une endoprotéase puis une exopeptidase. Le mécanisme classique de maturation des hormones et neuropeptides implique des endoprotéases tel que les prohormones convertases, qui clivent spécifiquement sur le versant carboxylique de doublets basiques, puis dans un second temps, une carboxypeptidase de type B (basique) vient retirer spécifiquement ces acides aminés en COOH-terminal. ( Pour revue, Beinfeld, 1998 ) un second mécanisme de maturation a pu être mis en évidence en étudiant la maturation in vitro de la somatostatine 28 (hormone pléiotrope) en somatostatine 14 où une NRD convertase clivé sur le coté NH2 ter du doublet basique K-R puis une aminopeptidase retire séquentiellement les AA basiques présents en NHter du peptide, libérant ainsi le peptide actif. Vu aussi pour le Glucagon (effet local hypoglycémiant; Fontes et al., 2005).
- Comme on peu le voir sur la figure de western blot faite chez le rat, l’Ap-b présente une distribution tissulaire variée. C’est donc une enzyme ubiquitaire de 72 kDa. En ce qui concerne sa localisation cellulaire, elle est présente dans l’appareil de Golgi, dans le milieu extracellulaire, associé à la membrane externe et pourrait être présente dans le noyau et les mitochondries.
- L’Ap-B est une enzyme monomérique appartenant à la famille M1 des Zn-Métallopeptidases qui clive spécifiquement et séquentiellement les résidus basiques arginine (R) et lysine (K) de l’extrémité NH2-terminale d’un peptide. Cette activité est inhibée lorsqu’un résidu proline est au voisinage du site de coupure. sensible aux agents réducteurs des groupements thiols. Elle est active sur une large gamme de pH ce qui indique qu’elle peu être fonctionnelle dans des compartiments cellulaires distincts. Elle est activée, pour des substrats chromogéniques de type L-Arg ß-naphtylamides (L-aa ß-NA). Enfin, l'Ap-B possède, in vitro , une seconde activité de type leucotriène A4 (LTA4) hydrolase (LTA4H), c'est-à-dire qu'elle à la capacité d'hydrolyser la liaison époxyde du LTA4 pour le transformer en un médiateur lipidique de l'inflammation, le leucotriène B4. Cette seconde activité est faible par rapport à son activité exopeptidase. L'Ap-B est donc considérée comme une enzyme bi-fonctionnelle, au même titre que la LTA4H qui est également une Zn-métallopeptidase de la famille M1, mais dont la spécificité n’est pas restreinte aux seuls résidus basiques puisqu'elle clive également d'autres résidus comme l'alanine et la leucine.
- Le gène humain de l’Ap-B ( RNPEP ) se trouve sur le chromosome 1 humain. Il est constitué de 11 exons et a une taille d’environ 24 kb Il est encadré en 5’ par le gène TIM17a et en 3’ par le gène ELF3, il est donc présent dans une zone présentant une forte activité transcriptionnelle. (2 gènes qui encadre on un localisation nucléaire après expression donc étaye l’hypothèse que Ap-b serait dans le noyau) Grâce à une recherche dans une banque de donnée d’une séquence étant la plus proche de l’Ap-b du rat, il à été trouvé que c’était la LTA4H qui semblait être la plus proche étant donné que leurs structures primaires sont identiques à 33% et similaires à 48% et cette similitude de séquence atteint les 80% sur 70 résidus incluant la région du site de fixation du cation Zn2+. Cette proximité phylogénétique conforte la bi-fonctionnalité de l’Ap-B et de la LTA’=4H.
- Par des études cristallographique de la LTA4 hydrolase, un modèle moléculaire de l’Ap-B à pu être établis. Ceci pourra nous permettre d’étayer certaines hypothèses quant à l’effet des mutations sur la structure de l’Ap-B.
- Un mécanisme de la LTA4H a été décrit par Haeggström et ses collaborateurs en 2002. Ce modèle nous dis que : Les résidus bleu interagissent avec l’atome de zinc dans le site actif. Le glutamate 300 et l’asparagine 301 Orange (motif GXMEN) interagissent avec la fonction NH 2 libre de l’AA en Nter du substrat. De plus, l’asparagine 301 établit une liaison hydrogène avec le groupement carboxylique du résidu en P1. La charge négative portée par la chaîne latérale du glutamate 325 rouge polarise une molécule d’eau coordonnée au zinc et permet l’attaque nucléophile sur le carbonyle de la liaison peptidique. L’intermédiaire est stabilisé par des interactions électrostatiques avec le cation zinc et des liaisons hydrogènes avec les résidus glutamate 325, tyrosine 413 noir et glutamate 300. Enfin, le transfert de proton à partir du glutamate 325 à l’atome d’azote engagé dans la liaison peptidique en P1’ aboutit à rompre cette liaison libérant le résidu situé en P1. (D’après Haeggström et al., 2002) Plus récemement Thollender et ses collaborateurs ont proposé un nouveau mécanisme catalytique de la LTA4H en septembre 2008 qui se différencie de celui-ci par le fait qu’après l’attaque nucléophile de la liaison peptidique, il y aurai un lèger déplacement du substrat dans la poche catalytique et donc un échange des groupements qui chélatent l’atome de zinc. De plus la tyrosine n’intervient plus comme donneur de proton, mais sert seulement à stabiliser l’intermédaire qui s’en suit après attaque nucléophile. Concernant la spécificité de substrat, la glycine 298 de l’Ap-B joue un rôle important dans le positionnenment du résidu P1 du substrat dans le site actif de l’enzyme. Sa mutation en Pro change la spécificité de l’enzyme et lui permet d’hydrolyser des substrats tels que les L-Ala- et L-Pro β-NA, en plus des L-Arg- et L-Lys β-NA ( Pham et al., soumis à publication ). Des mutations de tout ces résidus ont montrés qu’ils sont essentiels à l’activité catalytique de l’enzyme. schéma du site catalytique de l’Ap-B (d’après le modèle moléculaire ; Pham et al., 2007) montrant la grande proximité entre le cation Zn 2+ (sphère grise) et ses 3 ligands, d’une part (His 324 , orange; His 329 , jaune; Glu 348 , vert) et le donneur de proton dans la réaction catalytique (Tyr 414 , vert clair). La partie restante de la structure est représentée en transparence. La figure a été créée en utilisant le logiciel graphique moléculaire Visual Molecular Dynamics (VMD 1.8.2 http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ ). De plus, il a été montré, par une autre équipe, que le résidu Alanine précédant ce site GXMEN joue un rôle important également dans la spécificité d’une autre aminopeptidase, l’aminopeptidase régulée par l’insuline, l’IRAP (Ye et al., 2007).
- Le but de ce projet de stage est d’identifier des résidus importants pour la spécificité de reconnaissance du substrat et impliqués dans le mécanisme enzymatique. Des alignements de séquence on permis l’identification de résidus potentiels impliqués dans le mécanisme catalytique de l’Ap-B ou la reconnaissance du substrat. Ces résidus sont des cibles intéressantes donc pour la mutagenèse dirigée. Nous utiliserons, pour ce faire, un certain nombre d’outils mis au point au laboratoire: - un système d’expression chez E. coli pour les mutants(Pham et al., 2007); - un modèle moléculaire de la structure 3D de l’Ap-B, comme vu précédement(Pham et al., 2007).
- Concernant les aspartates impliquées dans la reconnaissance du substrat, comme on peut le voir sur cette image, l’Ap-B et la LTA4H présente une boucle (en jaune), recouvrant la poche catalytique qui est constitué de résidus acides. La distribution des ces résidus est différente entre les 2 enzymes, pour la LTA 4 H, ils sont répartis de manière régulière, tandis que pour l’Ap-B, les résidus se trouvent rassemblés à l’extrémité de la boucle. Ce qui expliquerait la différence de reconnaissance de substrat. le cation Zn 2+ est représenté par une sphère verte. Il serait donc intéressant de muter les aspartates en résidus Asparagine et valine pour chacun. Comme on peu le voir dans ce tableau, une partie de ses mutations à été commencer et caractériser en terme d’activité, il reste a compléter ce travail pour les deux mutants en bleu, et d’effectuer une caractérisation enzymatique complète de chaque mutants. La mutagenèse dirigée de l’aspartate 405 de l’Ap-B a montré également que ce résidu joue un rôle dans la fixation du résidu arginine du substrat et s’avère nécessaire à la spécificité de l’enzyme (Fukasawa et al., 2006). Quant au résidu correspondant D 375 de la LTA 4 H, il joue un rôle essentiel dans l’activité hydrolase de l’époxide du LTA 4 en polarisant une molécule d’eau ce qui permet l’attaque nucléophile (Rudberg et al., 2002; Figure 10). )
- En ce qui concerne les tyrosines impliquées dans le site catalytique, Les tyr 229, 414 et 441 seront muté étant donné qu’elles apparaissent conservées à 100% dans les séquences des aminopeptidases de la famille M1 . Nous savons déjà que Tyr 414 est importante dans le mécanisme catalytique comme donneur de proton. Ces 4 tyrosines seront mutées en Phe. Une autre mutation où il s’agira de muter une phenylalanine en tyrosine (F 297 Y) sera également faite pour voir les effets sur l’activité aminopeptidase et LTA 4 H de l’Ap-B sachant que ce résidu est une phenylalanine pour l’Ap-B et une tyrosine pour la LTA4H et qu’il jouxte la glycine du motif GXMEN. Nous déterminerons s’il est impliqué notamment dans la poche de reconnaissance du résidu P1 au sein du site catalytique.
- Enfin, en ce qui concerne les lysines impliquées la fixation de l’extrémité COOH-terminale du peptide, un mutant de la lys 600 en Arg a été obtenu au laboratoire. ce résidus lysine est en faite une arginine dans la séquence de la LTA4H est joue une rôle dans la fixation de extrémité Cter. Il sera intéressant de muter également la lysine K 602 en arginine et d’analyser les effets de cette mutation. La mutation de ces deux lysines en résidus autres que basique est envisageable. En quel autre résidu??? Un double mutant F 297 Y et K 600 R sera construit dans le but d’étudier l’activité aminopeptidase et surtout LTA 4 H de l’Ap-B. En effet, ces mutations correspondent aux seuls résidus qui apparaissent non conservés dans la poche catalytique de l’Ap-B au regard du cristal obtenu de la LTA 4 H avec un tripeptide.
- Après obtention des mutants, une caractérisation de chaque mutant sera faites, cad que nous évaluerons l’effet de la mutation sur l’activité de l’enzyme. Et si l’activité est présente nous déterminerons les paramètre cinétiques tel que km caractérisant l’affinité de l’enzyme avec son subtrat, le kcat caractérisant le nombre de molécule produite par unité de temps par l’enzyme, le kcat/km. Nous étudierons également l’effet du chlore sur l’activité (étant donné que clore est un activateur : De plus, elle est activée, pour des substrats chromogéniques de type L-Arg ß-naphtylamides (L-aa ß-NA), par les ions chlore à une concentration physiologique de 0,1 - 0,2 M, ce qui étaye les hypothèses de son implication dans les processus de maturation et d’inflammation.) Enfin nous déterminerons le profils d’inhibition vis-à-vis des inhibiteurs d’aminopeptidases tel que l’arphaménine et la bestatine.
- Nous analyserons l’effet de la mutation de plusieurs tyrosines conservées présentes ou non dans le site actif de l’AP-B. Il a été reporté au préalable pour la LTA 4 H qu’une tyrosine (Y 383 ) est essentielle pour le transfert de proton et le mécanisme catalytique (Andberg et al., 1997). Nous aimerions démontrer qu’il s’agit d’un mécanisme plus complexe et que plusieurs tyrosines sont impliquées dans le transport de protons et dans le mécanisme catalytique. Il sera nécessaire d’étudier dans un avenir proche l’importance, d’une part, des résidus tyrosines non conservés du site actif de l’Ap-B, et d’autre part, celle des tyrosines éloignées du site actif. Ces résidus pourraient avoir un effet sur l’activité catalytique en transportant des molécules d’eau. Ces expériences permettront de vérifier si la conservation des tyrosines est importante et notamment d’identifier le rôle de tyrosines non conservées. Inversement, une Phe (F 297 ) importante du site actif sera mutée en Tyr et nous étudierons les effets de cette mutation sur la spécificité de substrat. D’autre part, nous analyserons si les trois aspartates (404, 405, 407) d’une boucle présente à la surface de l’enzyme jouent un rôle dans la reconnaissance du résidu basique Arg ou Lys du substrat et si leur mutation en Asn et Ala change cette spécificité. Enfin, un résidu lysine (K 600 ) du site actif, probablement impliqué dans la fixation du carboxylate présent à l’extrémité terminale du substrat sera muté en arginine et en d’autres résidus pour étudier l’effet sur les paramètres catalytiques de l’enzyme. Puis nous restaurerons un site actif dans l’Ap-B similaire à celui de la LTA 4 H en construisant une double mutation (F 297 Y et K 600 R) qui nous l’espérons nous permettra de mimer les activités de la LTA 4 H chez l’Ap-B. Comme précédemment mentionné, nos résultats permettront, à terme, de décrypter le mécanisme catalytique de l’Ap-B et de concevoir des inhibiteurs spécifiques pour découvrir l’ensemble des hormones cibles de cette enzyme, ses différents rôles et les pathologies qu’elle peut entraîner en cas de dysfonctionnement.
- Modèle du mécanisme catalytique de la LTA 4 H vis-à-vis du peptide RAR. A , le substrat (en gris) déplace la molécule d’eau associée au zinc et chélate le cation divalent par son extrémité Nter et l’oxygène du carbonyle du résidu P1. Carbonyle établit également une liaison hydrogène forte avec l’hydroxyle de Tyr 383 . =413 Cet arrangement polarise la liaison carbonyle et augmente le caractère électropositif du carbone du carbonyle. B , le carbone du carbonyle polarisé subit une attaque nucléophile par une molécule d’eau déprotonée par une base activatrice qui est Glu 296 . = 325 C , Après formation d’un intermédiaire tétraédrique, ll y a un léger déplacement du subtrat et ainsi un échange entre les groupements qui chélatent le cation Zn 2+ ce qui renforcent les liaisons H. Le NH 2 -terminal libre se lie à Glu 271 = 300 ( motif GAMEN) et à l’oxygène anionique formant deux liaisons avec le cation Zn 2+ et l’hydrogène de Tyr 383 . Du fait de la déprotonation de la molécule d’eau en B, Glu 296 =325 a désormais son carboxylate protoné. Ce proton est alors directement transféré sur l’amine du résidu P’1. D , une fois protonée, cette amine constitue un bon groupe partant et le petit déplacement associé avec la formation de l’intermédiaire réactionnel est exercé par une force provenant des résidus Glu 271 et Asp 375 . (Tholander et al., 2008)