Projet de recherches: Détermination du mécanisme catalytique d’une enzyme bi-fonctionnelle, l’aminopeptidase B Biogenèse d...
Plan  <ul><li>I. L’aminopeptidase B </li></ul><ul><li>II. Connaissances actuelles </li></ul><ul><li>III. Projet et objecti...
<ul><li>Maturation des messagers peptidiques </li></ul>- R – K  - Mécanisme classique Mécanisme avec l’aminopeptidase B - ...
I. L’aminopeptidase B Distribution tissulaire Localisation subcellulaire    Enzyme ubiquitaire Intestin grêle Epididyme T...
<ul><li>Propriétés Physico-chimiques </li></ul>Enzyme bifonctionnelle: présente  in vitro une  activité LTA 4  hydrolase r...
<ul><li>Aspects moléculaires </li></ul>Localisé sur chromosome 1 humain, bande q32.1/q32.2  <ul><li>Contexte phylogénétiqu...
Modélisation et dynamique moléculaire <ul><li>Modèle 3D de l’Ap-B </li></ul>(LTA 4 H, Thunnissen et al., 2001)
II. Connaissances   actuelles (Haeggström et al., 1993)
III. Projet et Objectifs But :   Identifier des résidus ayant un rôle dans la spécificité de reconnaissance du substrat et...
<ul><li>Cibles de mutagenèse dirigée </li></ul><ul><li>Nous effectuerons un certain nombre de mutants concernant : </li></...
<ul><li>Mutation des Asp 403, 405 et 406 de l’Ap-B en Asn et Val </li></ul>Ap-B :  D P DD TY LTA 4 H :  D I D P D V AY <ul...
<ul><li>Mutants tyrosines : Tyr 228, 408, 413 et 440 en Phe  </li></ul><ul><li>Les mutants </li></ul>
<ul><li>Les mutants </li></ul><ul><li>Mutant K600R, K602R, K600X </li></ul><ul><li>Double mutant F297Y et K600R </li></ul>
<ul><li>Caractérisation des Mutants </li></ul><ul><li>Activités </li></ul><ul><li>Paramètres cinétiques  (K M , k cat  et ...
IV. Perspectives Décrypter les mécanismes catalytiques  Informations sur les spécificités et mécanismes  enzymatiques des ...
<ul><li>Nouveau mécanisme catalytique proposé pour la LTA 4  hydrolase </li></ul>(Tholander et al.,  Chem. Biol.,  sept. 2...
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Projet de recherches1f

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  1. 1. Projet de recherches: Détermination du mécanisme catalytique d’une enzyme bi-fonctionnelle, l’aminopeptidase B Biogenèse des Signaux Peptidiques Université Pierre et Marie Curie - ER3 BIOSIPE Responsables de stage : Sandrine Cadel, Thierry Foulon Parcours « Molécules et Cibles Thérapeutiques » Année 2009-2010 Présenté par Patricia Masson
  2. 2. Plan <ul><li>I. L’aminopeptidase B </li></ul><ul><li>II. Connaissances actuelles </li></ul><ul><li>III. Projet et objectifs </li></ul><ul><li>IV. Perspectives </li></ul>
  3. 3. <ul><li>Maturation des messagers peptidiques </li></ul>- R – K - Mécanisme classique Mécanisme avec l’aminopeptidase B - R – K R – K - - R – K - COOH NH 2 + - R - + - K - + NH 2 COOH Prohormones convertases Carboxypeptidase B NH 2 COOH COOH NH 2 + - R - + - K - + Aminopeptidase B NRD convertase
  4. 4. I. L’aminopeptidase B Distribution tissulaire Localisation subcellulaire  Enzyme ubiquitaire Intestin grêle Epididyme Testicule Cerveau Muscle Cœur Poumon Foie 72kDa 72kDa Pancréas Rein Gros intestin Estomac Rate
  5. 5. <ul><li>Propriétés Physico-chimiques </li></ul>Enzyme bifonctionnelle: présente in vitro une activité LTA 4 hydrolase résiduelle <ul><li>Enzyme monomérique, Famille M1 </li></ul><ul><li>Zn 2+ -métallopeptidase </li></ul><ul><li>Hydrolyse séquentielle RK </li></ul><ul><li>Pas d’hydrolyse si proline au voisinage </li></ul><ul><li>Activation par les ions Cl - </li></ul><ul><li>Sensible aux agents réducteurs des ponts disulfures (DTT) </li></ul><ul><li>Active sur une large gamme de pH </li></ul>Acide arachidonique LTA 4 LTB 4 LTA 4 Hydrolase
  6. 6. <ul><li>Aspects moléculaires </li></ul>Localisé sur chromosome 1 humain, bande q32.1/q32.2 <ul><li>Contexte phylogénétique </li></ul> Comparaison de séquences: (33% d’identité; 48% de similarité) HEXXHX 18 E C C C C C C C C C C C rLTA 4 hydrolase 611 aa C C C C C C C C C C C C C C C rAp-B 650 aa
  7. 7. Modélisation et dynamique moléculaire <ul><li>Modèle 3D de l’Ap-B </li></ul>(LTA 4 H, Thunnissen et al., 2001)
  8. 8. II. Connaissances actuelles (Haeggström et al., 1993)
  9. 9. III. Projet et Objectifs But : Identifier des résidus ayant un rôle dans la spécificité de reconnaissance du substrat et le mécanisme enzymatique Mutagenèse dirigée Alignements de séquences Système d’expression Modèle moléculaire de l’Ap-B
  10. 10. <ul><li>Cibles de mutagenèse dirigée </li></ul><ul><li>Nous effectuerons un certain nombre de mutants concernant : </li></ul><ul><ul><li>Les aspartates de l’Ap-B impliqués dans la fixation du substrat </li></ul></ul><ul><ul><li>Les tyrosines impliquées dans le site catalytique </li></ul></ul><ul><ul><li>Les lysines impliquées dans la fixation du substrat à l’extrémité Cterminal </li></ul></ul>
  11. 11. <ul><li>Mutation des Asp 403, 405 et 406 de l’Ap-B en Asn et Val </li></ul>Ap-B : D P DD TY LTA 4 H : D I D P D V AY <ul><li>Les mutants </li></ul>LTA4H Ap-B Mutants Activité D403V - D403N D405V - D405N - D406V D406N +++ WT +++
  12. 12. <ul><li>Mutants tyrosines : Tyr 228, 408, 413 et 440 en Phe </li></ul><ul><li>Les mutants </li></ul>
  13. 13. <ul><li>Les mutants </li></ul><ul><li>Mutant K600R, K602R, K600X </li></ul><ul><li>Double mutant F297Y et K600R </li></ul>
  14. 14. <ul><li>Caractérisation des Mutants </li></ul><ul><li>Activités </li></ul><ul><li>Paramètres cinétiques (K M , k cat et k cat /K M ) </li></ul><ul><li>Effet du chlore </li></ul><ul><li>Spécificité de substrat </li></ul><ul><li>Profils d’inhibition vis à vis d’inhibiteurs d’aminopeptidase (bestatine, arphaménine) </li></ul>
  15. 15. IV. Perspectives Décrypter les mécanismes catalytiques Informations sur les spécificités et mécanismes enzymatiques des aminopeptidases de la famille M1 Concevoir des inhibiteurs spécifiques Expression de l’Ap-B dans différentes pathologies
  16. 16.
  17. 17. <ul><li>Nouveau mécanisme catalytique proposé pour la LTA 4 hydrolase </li></ul>(Tholander et al., Chem. Biol., sept. 2008) E325 E347 E300 Q170 G298 Y413

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