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Des bio-puces pour la mesure des
contaminations microbiennes
Delphine Guillebault
13 novembre 2013
L’eau est le vecteur de nombreux microorganismes
ayant un impact sociétal et économique fort
Des dinoflagellés

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Des bactéries

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données, des technologies de pointes
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• Révision des standards microbiologiques CE en 2015
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indésirables pour l’homme

• Les questions:
 Quelle qualité des eaux de consommation, d’élevage et
récréatives?

 Les réservoirs naturels?
 Le recyclage de l’eau?
 La réutilisation des eaux industrielles?
Le principe des bio-puces

Un
individu

Une
identité

Des gènes

Des
séquences
Le principe des bio-puces

Qui est là et combien sont-ils?
Une population
= un assemblage
d’individus

!"

!"

!"

Un assemblage
d’individuUn gène
= un assemblage
d’identité

30
4)

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!"

!"
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Reconnaissance des
séquences par une sonde
Aujour’hui en catalogue:
spécifique

Zig, Puce, Jules, Jim etc….

Une séquence
Développement et/ou adaptation de sondes
ciblant des micro-organismes d’intérêt
Choix d’un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques:
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espèces et moins conservée
• Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants
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Ensemble de séquences
uniques

Sondes hiérachiques:
 Groupe
 phylum
 Classe
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de présence de la
cible
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fluorescent

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Le projet européen MicroAQUA
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Objectifs:
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Clostridium perfringens
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Pseudomonas pp.
Staphylococcus aureus
Vibrio spp.
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Microcystis aeruginosa
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Nodularia spumigena
Anabaena spp.
Aphanizomenon flos-aquae
Cylindrospermopsis

Cyanobacteria

2 step detection rRNA
Standard probe on
Standard probe on
and toxin gene on
microtiter plate assay microarray glass slide
micro-array glass clide

Standard probe to
designed and
validated

√
√
√
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√
√
√
√
√
√
√
√
√
√
x
x
x
x
x
x
La finalité du projet

Set de sondes spécifiques de
chaque cibles
Sondes hiérarchiques:
Groupe
phylum
Classe
Genre
Espèces

Impression des sondes sur
un support

Une bio-puce dédiée à la
détection et la
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nombreuses cibles
microbiennes

Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue 2015-2016
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Super-grille
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• Acide okadaïque
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Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes. Outils de mesure des contaminants des milieux lagunaires et marins.

  • 1. Des bio-puces pour la mesure des contaminations microbiennes Delphine Guillebault 13 novembre 2013
  • 2. L’eau est le vecteur de nombreux microorganismes ayant un impact sociétal et économique fort Des dinoflagellés Des diatomées Des bactéries Des efflorescences d’algues toxiques Des contaminations bactériennes La diversité microbienne, les empreintes génétiques et chimiques La biologie moléculaire, des bases de données, des technologies de pointes
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  • 5. Des enjeux environnementaux… • Révision des standards microbiologiques CE en 2015 • Augmentation de la population mondiale, réchauffement climatique avec (ré-) émergence de microorganismes indésirables pour l’homme • Les questions:  Quelle qualité des eaux de consommation, d’élevage et récréatives?  Les réservoirs naturels?  Le recyclage de l’eau?  La réutilisation des eaux industrielles?
  • 6. Le principe des bio-puces Un individu Une identité Des gènes Des séquences
  • 7. Le principe des bio-puces Qui est là et combien sont-ils? Une population = un assemblage d’individus !" !" !" Un assemblage d’individuUn gène = un assemblage d’identité 30 4) !" .0 ) 1 .- ', /) !" ( % , $- ) )*+ !" !" 2- ", ) Reconnaissance des séquences par une sonde Aujour’hui en catalogue: spécifique Zig, Puce, Jules, Jim etc…. Une séquence
  • 8. Développement et/ou adaptation de sondes ciblant des micro-organismes d’intérêt Choix d’un gène reconnu pour ses propriétés phylogénétiques: • molécule possédant des régions très conservée entre les différentes espèces et moins conservée • Ubiquiste: présent chez tous les organismes vivants • Peu de transfert horizontal • Très abondante • Bases de données très riches et bien alimentées Ensemble de séquences uniques Sondes hiérachiques:  Groupe  phylum  Classe  Genre  Espèces Contrôle interne de présence de la cible
  • 9. En pratique…. L’identification d’espèces à l’aide de sondes Échantillon environnemental ou issu de culture Isolation des messagers RNA Marquage Fluorescent des RNA Hybridation sur la bio-puce Indicateur d’activité Plus le signal fluorescent est fort plus la cible est présente en grande quantité
  • 10. En pratique… Schéma d’une expérience d’hybridation de bio-puce ARN marqué fluorescent Sondes immobilisées (Oligonucleotides, PCR-Fragments, cDNA) Lame dotée d‘un revêtement spécifique
  • 12. Le projet européen MicroAQUA 7th Framework Programme Theme: Innovative aquatic biosensors Objectifs: Designer des sondes spécifiques ciblant des cyanobactéries et des diatomées toxiques, des bactéries, virus et protozoaires pathogènes => participer aux efforts européens de surveillance des eaux côtières en matière de pathogènes véhiculés par l’eau douce à travers l’évaluation de la qualité microbiologiques de l’eau
  • 13. Les micro-organismes ciblés dans ce projet: Group Pathogen Bacteria Campylobacter E. coli O157:H7 Legionella Mycobacterium Salmonella Shigella Aereomonas spp. Bacillus cereus 1 Clostridium botulinum Clostridium perfringens Listeria monocytogenes Pseudomonas pp. Staphylococcus aureus Vibrio spp. Yersinia enterocolitica Microcystis aeruginosa Planktonthrix Nodularia spumigena Anabaena spp. Aphanizomenon flos-aquae Cylindrospermopsis Cyanobacteria 2 step detection rRNA Standard probe on Standard probe on and toxin gene on microtiter plate assay microarray glass slide micro-array glass clide Standard probe to designed and validated √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ √ x x x x x x
  • 14. La finalité du projet Set de sondes spécifiques de chaque cibles Sondes hiérarchiques: Groupe phylum Classe Genre Espèces Impression des sondes sur un support Une bio-puce dédiée à la détection et la quantification de nombreuses cibles microbiennes Commercialisation de la bio-puce AQUA prévue 2015-2016
  • 15. L’organisation d’une bio-puce Grille Impression des sondes sur un support Super-grille Cluster de Super-grille Plusieurs millions de spots (NimbleGen Systems, Affymetrix, Agilent Technologie) Dupliqua Du cluster de Super-grille
  • 16. Un autre type de puce: les puces ciblant les toxines Toxine + Anticorps = SPR CHIP SURFACE Plus le signal est faible, plus il y a de toxines dans l’échantillon
  • 17. Les toxines détectées à l’aide de puces • Acide okadaïque • Acide domoique • Neosaxitoxine • Saxitoxine • Microcystine • Anatoxines • Cylindrospermopsines • Nodularines
  • 18. Les avantages des bio-puces sur les autres méthodes • Pyroséquençage 454: délai de plusieurs semaines • Spectrométrie de masse: réponse en plusieurs jours et coût élevé • Microscopie (LM & SEM): temps et expertise taxonomique, faible nombre d’échantillons • Hybridation FISH: une espèce à la fois parfois deux • qPCR limitée à 8 espèces maximum (multiplexe), inhibitions fréquentes des réactions d’amplification Bio-puces • Nombre illimité d’espèces déposées sur la bio-puce avec possibilité d’étudier facilement les nouvelles espèces • Coût raisonnable 40 € par échantillon avec 2 réplicas et un nombre d’espèces très important
  • 19. L’accès à ces technologies? Une jeune société créée en Avril 2013 co-fondée par les Drs Carmem-Lara Manes et Delphine Guillebault (Présidente): Microbia Environnement
  • 20. R&D Bio-puce diagnostic algues toxiques, microorganismes pathogènes Développement de biopuce et biocapteurs diagnostic et aide au transfert de technologies similaires Commercialisation produits Prestation de services Diagnostic biologique et caractérisation phylogénétique d’un environnement naturel ou industriel à façon
  • 21.  Prestations de services: diagnostic, identification, surveillance, valorisation, projets à façon  Développement technologique d’outils moléculaires de détection  Commercialisation de bio-puces de diagnostic Vente de la bio-puce MIDTAL ou de la prestation MIDTAL pour la surveillance des algues toxiques contact@microbiaenvironnement.com
  • 22. Merci de votre attention