O documento discute as principais variações cromossômicas no genoma humano (SNPs e SVs) e as novas metodologias de sequenciamento de próxima geração que permitem a identificação de inversões e translocações. Aplicações incluem a detecção de mutações e a análise filogenética. As novas tecnologias como o sequenciamento Illumina e Applied Biosystems ampliam o conhecimento sobre o genoma.

1. Sequenciamento de última geração na identificação de inversões e translocações Ana Barbara Moura Cristiana Fuchs Jessyca Souza Kellyanne Rangel Patrícia Alves Universidade Católica de Brasília Citogenética Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira Pró-Reitoria de Graduação

2. Principais variações cromossômicas (SNPs e SVs) O genoma humano possui um diversificado leque de variações genômicas SNPs - Polimorfismos de um único nucleotídeo 1998 - Um único par de bases do DNA. Um nucleotídeo é trocado por outro qualquer. Modificações em Éxons ou Íntrons SNPs silenciosos – substituições sinônimas de códons Não alteram a composição de aminoácidos da proteína resultante Marcadores moleculares de predisposição do indivíduo a certos tipos de doenças dentre elas o câncer, ou ainda como alvos terapêuticos no desenvolvimento de novas drogas SVs - variações estruturais como inserções e deleções, rearranjos que podem ser inversões e translocações Mediadores de doenças e suscetibilidade a doenças que podem ser sistematicamente comparadas

3. O banco de dados de variantes genômicas (DGV) Ferramentas de suporte para auxiliar técnicas moleculares e geneticistas, assim com diagnósticos Armazena as sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos com suas anotações e algoritmos para posterior análise desses dados 60.000 CNVs, 850 e 30 000 inversões identificado em indivíduos saudáveis. Estudos de associação da doença genômica do câncer e estudos evolutivos. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html

4. Metodologias de sequenciamento Pirosequenciamento – Método rápido O nucleotídeo adicionado a fita crescente de DNA é detectado diretamente pela liberação e transformação de uma pirofosfato. Quimiluminescência detectada Roche diagnostic, Genome Sequencer 20 System Cascata com a polimerização do DNA – liberação do ppi taq polimerase ppi é convertido em ATP ATP sulfurilase ATP fornece energia Luciferase Oxida Luciferina que emite luz

5. Próxima geração de sequenciamento (NGS) Tecnologias de sequenciamento de nova geração Sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida. Plataforma 454 FLX da Roche - combinação de reações enzimáticas com liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadeia 250pb Câmera CCD (charge-coupled device) acoplada ao sistema Solexa da Illumina - síntese usando DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos. Clonagem in vitro dos fragmentos em uma plataforma sólida de vidro (PCR) Applied Biosystems (SOLiD Syste) - catalisada por uma DNA ligase. fragmentado em um sonicador em fragmentos de 60- 90pb, para as bibliotecas de tags únicas. Alta eficiência e sensibilidade da plataforma analisa 320 amostras

6. Pirosequenciamento – Método rápido

7. Solexa da Illumina

8. Applied Biosystems (SOLiD Syste)

9. Como surgiu a próxima geração de sequenciamento (NGS) Possibilidade a descoberta de variações estruturais na população humana Expandir a base de dados destas variações para ajudar a compreender os fatores genéticos atrás das várias doenças. Fornece novas tecnologias de sequenciamento de alta cobertura, utilizando uma resolução muito maior. Ampliação clonal é realizada por métodos baseados em PCR, em vez de transformação bacteriana.