Tests de dépistage et de confirmation...

1. S/A
Le dépistage de
l’antigène HBs
(Par méthode ELISA)
LL
S / Abdessemed

2. S/A
Intérêt diagnostique :
Une hépatite virale de type B est le plus
souvent accompagnée de l’apparition de
l’antigène de surface du virus de l’hépatite
B dans le sérum. En règle générale, l’AgHBs
peut être mis en évidence dans le sérum dès
2 à 3 semaines avant le début de la maladie,
et atteint son point culminant au moment de
l’apparition des symptômes caractéristique
(ictère, modification de la concentration
des enzymes spécifiques du foie).

3. S/A
On observe ensuite généralement une
lente élimination de l’antigène. Chez un
certain nombre de sujets, et chez un
pourcentage inconnu de personnes ayant
été infectées par le virus de l’hépatite B
de façon subclinique, l’antigène peut
rester mesurable dans le sérum pendant
des années, voire à vie.

4. S/A
Dans la mesure où une transfusion de sang
contenant de l’AgHBs a entraîné une
hépatite B dans de nombreux cas, le
principal intérêt de la mise en évidences de
l’AgHBs réside dans le dépistage des dons
de sang, afin de réduire la fréquence des
hépatites B post-transfusionnelles. La
détection de l’AgHBs est également
utilisée pour le diagnostic des hépatites B
aigues ou chroniques.

5. S/A

6. S/A

7. stade Ag HBS Ag HBe Ac anti HBS Ac anti HBC Ac anti HBe
Hépatite : Début
S/A
Etat
Guérison
++
+/-
-
+
+
-
-
-
+/-
-
++
+
-
-
+
Hépatite
chronique
+ + - + -
Porteur sain + +/- - + -/+
Vaccination - - + - -

8. S/A
1. Principe :
Enzygnost ®HBs Ag est un test
immunoenzymatique basé sur une réaction
en deux étapes : l’Ag HBs contenu dans
l’échantillon à tester réagit tout d’abord
simultanément d’une part avec les anticorps
anti-HBs polyclonaux fixés à la surface des
cupules de plaque de microtitration, et
d’autre part avec le conjugué 1 (anti-
HBs/Biotine, coloré en bleu). Après
élimination des éléments non liés, le
conjugué 2 (streptavidine/POD, coloré en
jaune) réagit ensuite avec le conjugué 1.

9. S/A
Après élimination des éléments non liés,
l’activité enzymatique du conjugué 2 liée
est mesurée (réaction colorée en bleu).
La transformation enzymatique du
chromogène est ensuite interrompue par
l’addition de la solution d’arrêt POD
(réaction colorée en jaune). L’intensité
de la coloration est directement
proportionnelle à la concentration
antigénique de l’échantillon.

10. S/A

11. S/A
2. Réactifs :
Plaque Enzygnost® HBs Ag 5.0 : plaque de
microtitration recouverte d’AC de mouton anti-
AgHBs.
Conjugué 1 (anti-HBs/Biotine) : anti-HBs
monoclonal (de souris). Conjugué à la biotine,
coloré en bleu. Agent de conservation (phénol :
max. 1 g/l)
Conjugué 2 (streptavidine/POD) : streptavidine
conjugué à la peroxydase (POD). Coloré en jaune.
Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)

12. S/A
Sérum de contrôle HBs Ag négatif : sérum
humain, valeur de D.O. indicative : ≤ 0,150.
Agent de conservation (phénol : max. 1 g/l)
Sérum de contrôle HBs Ag positif : sérum
humain stabilisé.0, 4 ± 0,2 (standard du
PEI {Paul-Ehrlich-Institut})), valeur de
D.O. indicative : ≥ 0,7. Agent de
conservation (phénol : max. 1 g/l).

13. S/A

14. S/A
Préparation des réactifs :
 Porter tous les réactifs et échantillons à +15/+25°C
avant le début du test, sans sortir la plaque de son
emballage.
 Sortir du cadre les barrettes non utilisées dans le
test, et les conserver pour un usage ultérieur.
 Pour une plaque, diluer 20mL de solution de lavage
POD avec l’eau distillée ou désionisée en complétant
à 400 mL.
 Pour une plaque, diluer 1 mL de chromogène TMB
avec 10 mL de tampon/substrat TMB dans le flacon
plastique vide inclus dans le coffret (solution
d’emploi du chromogène) et la conserver dans le
flacon fermé à l’abri de la lumière.

15. S/A
Matériel nécessaire :
Incubateur : bain marie couvert (+37±1°
C) ou méthode d’incubation équivalente.
Pipettes : pipettes
à embout de 25,
100 et 1000μL.

16. S/A
Laveur
Lecteur de plaques "Elisa"
Incubateur

17. S/A
3. Echantillons à tester :
Utiliser des échantillons (sérum humains
ou plasmas citrates, héparines ou
prélevés sur EDTA) obtenus selon les
techniques standard des laboratoires.
Les échantillons peuvent être conservés
3 jours maximum à +2/+8°C.
Pour une conservation plus longue, les
congeler.

18. S/A
4. Réalisation du test
Distribution des contrôles et échantillons :
distribuer dans 3 cupules (A1 à C1) 100 μL
de sérum de contrôle négatif, dans 1 cupule
(D1) 100μL de sérum de contrôle positif,
dans les cupules suivantes 100μL de chacun
des échantillons non dilués, puis en fin de
série ou en fin de plaque de nouveau 100μL
de sérum de contrôle positif.
Les pipetages doivent être enchaînés, et ne
pas durer plus de 30min par plaque.

19. S/A
Enchaîner la distribution du conjugué 1
immédiatement après celle des
échantillons.
Distribution de conjugué 1 : distribuer
dans chaque cupule 25 μL de conjugué 1
(anti-HBs/Biotine). Couvrir ensuite d’une
feuille adhésive et placer la plaque dans
l’incubateur immédiatement après la
distribution du conjugué.

20. S/A
Incubation : laisser incuber 60 ± 2min à
37 ± 1° C, et enchaîner immédiatement
le processus de lavage.

21. S/A
Lavage : retirer la feuille adhésive,
aspirer le contenu de toutes les cupules,
et distribuer dans chacune d’elles
environ. 0,3 ml de solution de lavage.
Répéter 4 fois l’opération, en
respectant un temps de contact de
10sec. Dès la fin de processus de lavage,
distribuer immédiatement le conjugué 2
afin d’éviter tout desséchement.

22. S/A
Distribution du conjugué 2 : ajouter dans
chaque cupule 100μL du conjugué 2
(streptavidine/POD), couvrir d’une
nouvelle feuille adhésive, et placer
immédiatement la plaque dans
l’incubateur.
Incubation : laisser incuber 30 ± 2min
à37 ± 1°C, et enchaîner immédiatement le
processus de lavage.

23. S/A
Lavage : retirer la feuille adhésive,Répéter
4 fois l’opération. Dès la fin de processus
de lavage, distribuer immédiatement le
substrat.
Distribution du substrat : distribuer dans
chaque cupule 75μL de solution d’emploi du
chromogène, puis couvrir la plaque d’une
nouvelle feuille adhésive.
Incubation du substrat : laisser incuber 30
± 2min à +15/+25° C, à l’abri de la lumière.

24. S/A
Arrêt de la réaction : retirer la feuille
adhésive et ajouter dans chaque cupule
75μL de solution d’arrêt POD en
respectant le même rythme

25. S/A
Mesure : faire une mesure
photométrique dans l’heure qui suit à
450nm. La longueur d’onde de référence
doit être de 650 nm (éventuellement
comprise entre 615 et 690 nm).

26. S/A
5. Validation du test :
Calculer les valeurs moyennes des
sérums de contrôle à partir des
différentes valeurs mesurées si :
0,010 ≤ DO.neg ≤ 0,150
DO .POS ≥ 0 ,700
Sur les 3 valeurs mesurées du sérum
de contrôle négatif, une valeur sortant du
domaine indiqué peut être négligée.

27. S/A
Pour le sérum de contrôle positif, les
deux valeurs obtenues doivent se
trouver dans le domaine indiqué.
Si ces critères ne sont pas remplis, le
test doit être recommencé.

28. S/A
Calculer la valeur moyenne des DO du
sérum de contrôle négatif.
A cette valeur moyenne, ajouter 0,050
pour obtenir la valeur-seuil :
 Moyenne D.Oneg + 0,050 = valeur-seuil
(cut off)

29. S/A
6. Résultats du test
D.O échantillon < cut off = négatif
D.O échantillon ≥ cut off = positif
Les échantillons dont la valeur est
trouvée ≥ à la V.S doivent être retestés
en double.

30. S/A
Si les deux valeurs de densités
obtenues dans le deuxième test sont
trouvées inferieures à la V.S,
l’échantillon doit être considéré comme
négatif.

31. S/A
Si au moins une des deux valeurs
obtenues dans le deuxième test est
trouvée à nouveau ≥ à la V.S, l’échantillon
doit être considéré comme
provisoirement positif et doit être
confirmé par un test de confirmation.

32. S/A
Antigène HBS « test de
confirmation »

33. S/A
1. Principe :
L’échantillon à analyser est incubé avec
des antiHBS (humain) « R1 », pour la
comparaison on reprend le même
échantillon avec du sérum contrôle
négatif (exempt d’anticorps
antiHBS) « R2 ».
Les anticorps en excès saturent tous les
déterminants antigéniques de l’antigène
HBS présent dans l’échantillon.

34. S/A
Un test de dépistage réalisé ensuite
indique qu’il n y a plus d’antigène HBS,
l’échantillon mélangé avec le sérum de
contrôle « R2 » est positif.
Lorsque la réaction est non spécifique,
on obtient même après addition d’anti
HBS « R1 » une réaction positive.

35. S/A
2. Réactifs :
o antiHBS humain stabilisé « R1 »
o sérum de contrôle humain exempt
d’anticorps antiHBS « R 2 »
tous les réactifs utilisés dans le test de
dépistage

36. S/A
Remarque : les échantillons qui ont
présenté lors du test de dépistage des
D.O ≥ au sérum de contrôle positif
doivent êtres dilués au préalable au 1/10
ou au 1/100 avec une solution saline
isotonique.

37. S/A
3. Mode opératoire :
Dans deux tubes, mélanger respectivement :
Tube 1 Tube 2
échantillon 200 μl 200 μl
Réactif « 1 » 50μl -----
Réactif « 2 » ------ 50μl
Traiter le contrôle positif comme échantillon.
-- Incuber 1 heure entre 37et 40 ° C.
-- Utiliser les échantillons ainsi traités dans un test de
dépistage en incluant les témoins positifs et témoins négatifs.

38. S/A
4. Analyse des résultats :
Analyse visuelle : placer le portoir sur
fond blanc.
Le témoin positif non traité orange-jaune.
Le témoin négatif incolore.
Le témoin positif traité par le « R1 » doit
avoir une coloration nettement plus faible
que le témoin positif mélangé au « R2 »
sinon refaire le test.

39. S/A