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S/A
La Réaction
Antigène -Anticorps
Par : S / Abdessemed
S/A
Généralités
 La connaissance des mécanismes immunologiques a permis le
développement de nombreuses techniques d'analyses aussi bien
quantitatives que qualitatives.
S/A
Techniques
 Les principales techniques sont les réactions de précipitation, les
réactions d'agglutination et les réactions de neutralisation.
 La plupart de ces techniques utilisent les propriétés des anticorps
monoclonaux.
 Leur affinité et leur spécificité de liaison à leur cible fait d'eux des outils
incontournables de détection.
 Ils permettent de déterminer la présence d'un épitope particulier dans un
échantillon, permettant ainsi dans les techniques comme le western blot
ou l'ELISA de détecter des protéines, ou des modifications particulières
de protéine (phosphorylation, acétylation, etc.).
S/A
Applications
 Le diagnostic de l'infection par le VIH se base sur des détections
d'anticorps circulants dans le sérum des patients, de même que le
diagnostic de l'infection par le virus de l'hépatite B.
 Le dosage de certaines hormones (hormones thyroïdiennes
notamment) dans le sérum est également fait par turbidimétrie ou
néphélométrie : les automates détectent l'opacification d'une
solution, liée à la précipitation des complexes antigène-anticorps.
S/A
Applications
La capacité de former des complexes immuns permet de
provoquer l'agglutination et la précipitation de la cible avec les
anticorps: c'est le principe de l'immunoprécipitation, utilisé en
recherche pour déceler des interactions entre deux protéines ou
pour purifier un composé dans une solution.
S/A
L'immunologie dans la pratique médicale
 L'utilisation de toutes sortes de vaccins a permis le triomphe de la
médecine contre de nombreuses maladies infectieuses. Ainsi, la
variole est éradiquée, et d'autres maladies sont des candidats à
l'éradication par la vaccination : la rougeole, l'hépatite B par
exemple.
 Ce sont des maladies causées par des virus dont l'être humain est
le seul réservoir. La vaccination d'une grande partie de la
population permettrait de les éradiquer. Ce sont des objectifs fixés
par l'organisation mondiale de la santé.
S/A
L'immunologie dans la pratique médicale
 Par ailleurs, il existe depuis 2006 un vaccins destiné à diminuer le
risque de cancers du col de l'utérus. Ce vaccin est dirigé contre un
virus responsable de la transformation des cellules épithéliales du
col en cellules tumorales.
 Vacciner les jeunes filles avant leurs premiers contacts sexuels
permettrait de diminuer de 80% les cas de cancer du col.
S/A
L'immunologie dans la pratique médicale
 L'immunologie et l'étude du système immunitaire est un outil
indispensable pour deux domaines particuliers : le rejet de greffe
et les maladies auto-immunes.
 Parallèlement, l'immunologie des tumeurs étudie comment le
système immunitaire interagit avec les cellules tumorales, dans le
but d'influencer médicalement la puissance potentielle d'une
réaction immunitaire dirigée contre une tumeur.
S/A
Activation du complément
 Les anticorps protègent également l'organisme en déclenchant la
cascade du complément.
 Il s'agit d'un ensemble de protéines du plasma dont l'activation
(par la voie classique dans le cas d'anticorps) permet de détruire
des bactéries par perforation et de faciliter la phagocytose,
l'élimination des complexes immuns et la libération de molécules
chimiotactiques. Ce qui nous amène a l'hémolyse du globule
rouge.
S/A
Activation de cellules immunocompétentes
 Après avoir reconnu un antigène grâce à sa partie variable, un
anticorps peut se lier à des cellules du système immunitaire par sa
partie constante.
 Ces interactions revêtent une grande importance dans le déroulement
de la réponse immunitaire.
 Ainsi, les anticorps fixés sur une bactérie peuvent se lier aux
macrophages et déclencher une phagocytose.
 Les lymphocytes NK (Natural Killer) peuvent exercer leur
cytotoxicité et lyser des bactéries opsonisées par des anticorps.
S/A
Sérologie
 La sérologie est la mise en évidence et éventuellement le
dosage d'anticorps spécifiques.
 Elle est donc liée à l'étude des immunoglobulines du sérum
sanguin ou d'autres liquides organiques.
 Elle est utilisée comme outil diagnostic, comme outil de
dépistage (SIDA, Hépatite,…) et comme outil épidémiologique.
S/A
Procédure
 La sérologie s’effectue sur un prélèvement sanguin veineux (en
général au pli du coude). Il n'est pas indispensable d'être à jeun.
 Pour établir un diagnostic, deux prélèvements espacés de deux à
quatre semaines sont souvent utiles pour montrer une ascension
marquant une infection récente.
 Les dépistages nécessitent en général un seul prélèvement.
S/A
Principe
 Généralement, la sérologie consiste à évaluer l'immunité à une
maladie en mesurant la quantité d'anticorps spécifiques de celle-ci.
 Elle peut être utilisée également pour s'assurer de l'efficacité
d'une vaccination (c'est le cas par exemple pour l'hépatite B).
 Elle peut enfin servir au diagnostic d'une maladie auto-immune.
S/A
Principe
 Les anticorps évoluent après un contact avec la maladie. Les premiers
anticorps produits, après le temps de latence, appartiennent à la classe
des IgM (immunoglobuline M). Celles-ci laissent progressivement
place à une autre classe, les IgG (immunoglobuline G) qui sont plus
longtemps produites.
 Dans le cas d’une réinfection avec le même agent pathogène, le taux
des IgG réaugmente brutalement par un phénomène mémoire du
pathogène.
 Les temps de latence et l’effet mémoire sont différents selon les
maladies.
S/A
 La sérologie n’est pas appliquée pour toutes les infections, une liste non
exhaustive est proposée ci-après
 Sérologies virales dans le cadre de situations particulières:
Accident d'exposition au sang
HIV
HBV
HCV
Bilan prétransfusionnel
HIV
HBV
HCV
HTLV
CMV
S/A
Sérologies virales dans le cadre de situations
particulières:
Bilan prégreffe :
HIV
HBV
HCV
CMV
Toxoplasmose et syphilis ne sont pas des virus mais sont
recherchés dans ce contexte
CMV
EBV : chez le donneur dans le don de moelle
HAV : chez le receveur dans le don de moelle
S/A
Bilan chez la femme enceinte
Rubéole : obligatoire
Toxoplasmose : obligatoire
VIH : à proposer systématiquement
Syphilis
HTLV : conseillé pour les femmes originaires de zones tropicales
qui souhaitent allaiter.
S/A
 Sérologie bactérienne:
Salmonelloses
Syphilis
Streptocoques : Anti StreptoLysines O et Anti streptodornase B
 Sérologie parasitaire:
Toxoplasmose
S/A
Techniques
 Il existe de nombreuses techniques de détection des anticorps:
 Précipitation en milieu liquide ou en milieu solide
 Agglutination passive
 Fixation du complément
 Inhibition de l'hémagglutination
 Neutralisation (d'une propriété de l'antigène)
 Immunofluorescence
 Immuno-enzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
o ELISA indirect
o ELISA sandwich
o ELSA compétition
 Western-blot
 Radio-immunologie (en particulier pour les dosages hormonaux)
S/A
Différents types de réactions sérologiques
S/A
Techniques
 La sensibilité et la spécificité varient d’une technique à une
autre, donc influent sur le choix de la technique retenue.
 Pour un dépistage on cherche à avoir très peu de faux négatifs,
c’est pourquoi une technique plus sensible sera valorisée.
 Inversement pour une confirmation, on cherche à avoir très peu
de faux positifs, ainsi une technique plus spécifique conviendra
mieux
S/A
Sérologie positive ou négative
 La réponse immunitaire à une infection fait parfois intervenir la
création d'anticorps.
 La présence d'anticorps spécifiques à une maladie indique que la
personne, à un moment donné dans le passé, a été infectée par la
maladie ou est simplement entrée en contact avec l'agent
pathogène. On dit que la personne a une sérologie positive, ou
bien est séropositive. Inversement, l'absence d'anticorps indique
habituellement que la personne n'a pas été contaminée, la
personne est dite séronégative.
S/A
Sérologie positive ou négative
 Il s'agit d'une méthode indirecte puisqu'elle ne cherche pas la
présence de l'agent pathogène mais la réponse du système
immunitaire contre cet agent pathogène.
 De même pour les maladies auto-immunes, la présence d'un
anticorps auto-immun sera indiquée par le terme de séropositivité
et son absence par le terme de séronégativité.
 Les polyarthrites rhumatoïdes sont ainsi dites séropositives
lorsque la recherche d'anticorps appelé facteur rhumatoïde est
présent.
S/A
Séroconversion
 La séroconversion est le passage d'une séronégativité à une
séropositivité.
 Ce terme est souvent utilisé en obstétrique ou en médecine
fœtale pour désigner la date de survenue d'une infection par
exemple la toxoplasmose.
 Ainsi les conséquences d'une séroconversion sur le fœtus
dépendent du terme de la grossesse ou de l'âge gestationnel du
fœtus.
S/A
La réaction de précipitation
 Est une réaction Ag-Ac d’agrégation où l’antigène est représenté
par les macromolécules en solution colloïdale.
 Les complexes Ag-Ac précipitent quand leurs éléments
participants ( l’antigène et l’anticorps spécifique) se trouvent
dans une proportion optimale.
S/A
La réaction de précipitation
La méthode Ramon: est une réaction de floculation qui
apparaît dans toute la masse du liquide sous la forme de
flocons et elle permet la mise en évidence du pouvoir d’une
toxine, ou d’un sérum antitoxique.
Le titrage de la toxine diphtérique :
S/A
La réaction de précipitation en gel
 Un élément (l’Ag ou l’Ac) ou les deux éléments ( l’Ag et l’Ac )
peuvent diffuser dans le gel d’agar ou d’agarose.
 La diffusion simple: où soit l’Ag ou soit l’Ac peut diffuser dans
le gel d’agar et l’autre élément est introduit en gel.
S/A
La réaction de précipitation en gel
 La méthode de la diffusion radiale de Mancini:
 Cette méthode consiste à incorporer un antisérum spécifique dans
la gélose et à déposer la solution d'Ag dans des puits. A l'équilibre il
se forme un anneau de précipitation dont le carré du diamètre est
proportionnel à la concentration de l'Ag.
S/A
 La méthode de double diffusion en gel d’Ouchterlony
 C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées
dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans
toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent
donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé.
 Cette zone de contact reste invisible s’il n’y a pas de réaction entre les
deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un
arc de précipitation visible à l’œil nu. Celui-ci est dû à l’interaction entre
de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la
formation de complexes immuns.
S/A
S/A
La diffusion en champ électrique
 L’immunoélectrophorèse : faire l’association entre le Principe
de l’électophorèse en gel d’agar et la diffusion en gel.
 On prépare une plaque en verre avec le gel d’agar. Après sa
solidification on fait une fosse centrale et deux godets
périphériques.
 Les antigènes sont mis dans les godets, on met en marche
l’élecrophorèse et les antigènes complexes se séparent
S/A
 Dans la 2-ème étape on met dans la fosse centrale le sérum qui
contient les anticorps et on laisse les réactants pour diffuser.
 La correspondance entre les antigènes et les anticorps fait
apparaître les arcs de précipitation
S/A
S/A
Les Réactions d’Agglutination
 Définition:
Les agglutinations mettent en jeu un antigène situé à la surface
d’une particule (ou antigène particulaire). C’est un phénomène
complexe au cours duquel les anticorps s’unissent aux antigènes
portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre les
particules et permettent leur réunion en amas.
S/A
Agglutination : Réaction entre un antigène particulaire et un
anticorps constituant un réseau se visualisant sous forme d’un
agglutinat
anticorps antigène particulaire
S/A
2. Les différents types d’agglutination:
1 Agglutination ACTIVE
Définition : agglutination résultant d’une union spécifique entre un anticorps et un
antigène particulaire appartenant naturellement à la particule.
2. Agglutination PASSIVE
Définition : agglutination réalisée entre un anticorps et un antigène normalement
soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un support.
Particules de latex
Antigènes X
S/A
3. Agglutination DIRECTE
Définition : agglutination réalisée entre un anticorps agglutinant et un
antigène généralement particulaire.
4. Agglutination INDIRECTE ou ARTIFICIELLE
Définition : agglutination réalisée entre un anticorps non agglutinant et un
antigène (généralement particulaire) avec utilisation d’un artifice.
Ac
agglutinant
Ag
particulaire
SAB
SAB
SAB SAB
Ac non agglutinant
SAB
Ag
particulaire
SAB
S/A
Les Réactions de neutralisation
 Ces réactions sont utilisées dans le cas où l’Antigène est doté d’une
activité biologique :
 enzyme : activité catalytique
toxine : activité toxique
 virus : activité virale
 La formation du complexe immun se traduit par une modification de
l’activité biologique de l’Antigène. Ceci peut être dû au masquage
du site actif de l’enzyme par l’Anticorps ou à une modification
conformationnelle de l’Antigène liée à la fixation de l’Anticorps.
 Ces réactions de neutralisation peuvent être utilisées pour la
recherche de l’Antigène ou de l’Anticorps.
S/A
S/A
La réaction de fixation du
complément ( RFC)
 La RFC est une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac) avec la
participation du Complément ( C ).
 Cette réaction peut être utilisée dans le diagnostic direct pour
l’identification d’un microorganisme et dans le diagnostic
sérologique pour la mise en évidence des anticorps spécifiques.
S/A
 Dans le RFC, on a:
1.) le système Ag-Ac à étudier où un élèment (l’Ag ou l’Ac) est
connu et l’autre n’est pas connu.
Donc, on peut utiliser: le sérum test ou standard qui contient des
anticorps connus dans le diagnostic direct, ou le sérum test ou
standard qui contient des antigènes connus pour le diagnostic
indirect.
S/A
2) – le système Complément : est obtenu du serum de plusieurs
cobayes
3) – le système hèmolytique (ou le système de référence) qui est
représenté par le mélange en partie égales de la suspension
d’hématies de mouton (les antigènes) et le sérum hémolytique (les
anticorps spécifiques ou l’hémolysine) obtenu par les inoculations
répétées des suspensions d’hématies de mouton, chez le lapin.
S/A
 La RFC est réalisée en deux étapes :
o - le contact : du sérum à étudié, l’antigène connu et le
Complément; on fait de dilution de sérum;
o - on ajoute le système hèmolytique.
 Dans le cas d’une réaction positive: il y a une correspondance
entre l’Ag et l’Ac, alors ils apparaissent des complexes Ag-Ac,
le “C” se fixe sur ce système (les hématies ne sont pas lysées,
elles se trouvent en suspension ou elles sont déposées en bouton
aux fonds des godets)
S/A
Dans les RFC quantitatives, on peut déterminer le titre de la
réaction qui est donné par la plus grande dilution du sérum où il
y a encore des hématies en suspension ( c’est-à-dire qu’il y a une
correspondance Ag-Ac).
Dans le cas d’une réaction négative, les complexes Ag-Ac ne se
réalisent pas et le « C » libre se fixe sur le système hémolytique,
en produisant l’hémolyse.
S/A
Réaction
S/A
Test ELISA
 La technique de dosage immuno-enzymatique ou test ELISA (
Enzyme-Linked Immuno Assay en anglais) est principalement
utilisée en immunologie
 L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un
antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un
outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques
d'anticorps (comme pour le test HIV ), que pour détecter la
présence d'un antigène.
S/A
 La technique utilise un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est
spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes
immuns (antigène-anticorps) et est couplé à un enzyme. Cet
anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut
aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène
S/A
Il existe plusieurs types de tests ELISA
o ELISA indirect
o ELISA sandwich
o ELSA compétition
S/A
S/A
L’immunofluorescence
 L’immunofluorescence est une technique d’immuno-
marquage qui utilise des anticorps ainsi que des fluorochromes.
 L'immunofluorescence permet de révéler une protéine
spécifique directement dans la cellule, par émission
de fluorescence.
 Elle permet donc de déterminer non seulement la présence, ou
l'absence d'une protéine, mais aussi sa localisation dans la
cellule, ou le tissu analysé.
S/A
L’immunofluorescence
* Les fluorochromes sont des substances qui, quand elles sont
soumises à un rayon lumineux, deviennent instables (passent à
un état excité). Pour revenir à l’état fondamental, les
fluorochromes émettent une longueur d’onde différente de la
longueur d’onde absorbée.
 =>La radiation émise est une lumière de fluorescence.
* Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son
spectre d'absorption (de la lumière incidente) et son spectre
d'émission de fluorescence.
 =>Le spectre d’émission des fluorochromes est dans le visible.
S/A
*Les fluorochromes les plus classiques:
-FITC : ( Fluorescéine Iso Thio Cyanite) dérivé de la
fluorescéine :
L’isothiocyanate de fluorescéine (ou FITC)
o absorbe à =490nm et émet à =517nm (vert).
-Dérivés de la rhodamine : L’isothiocyanate de rhodamine
o absorbe à =550nm et émet à =580nm (rouge, orangé).
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S/A
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Les Réactions Antigènes- Anticorps

  • 2. S/A Généralités  La connaissance des mécanismes immunologiques a permis le développement de nombreuses techniques d'analyses aussi bien quantitatives que qualitatives.
  • 3. S/A Techniques  Les principales techniques sont les réactions de précipitation, les réactions d'agglutination et les réactions de neutralisation.  La plupart de ces techniques utilisent les propriétés des anticorps monoclonaux.  Leur affinité et leur spécificité de liaison à leur cible fait d'eux des outils incontournables de détection.  Ils permettent de déterminer la présence d'un épitope particulier dans un échantillon, permettant ainsi dans les techniques comme le western blot ou l'ELISA de détecter des protéines, ou des modifications particulières de protéine (phosphorylation, acétylation, etc.).
  • 4. S/A Applications  Le diagnostic de l'infection par le VIH se base sur des détections d'anticorps circulants dans le sérum des patients, de même que le diagnostic de l'infection par le virus de l'hépatite B.  Le dosage de certaines hormones (hormones thyroïdiennes notamment) dans le sérum est également fait par turbidimétrie ou néphélométrie : les automates détectent l'opacification d'une solution, liée à la précipitation des complexes antigène-anticorps.
  • 5. S/A Applications La capacité de former des complexes immuns permet de provoquer l'agglutination et la précipitation de la cible avec les anticorps: c'est le principe de l'immunoprécipitation, utilisé en recherche pour déceler des interactions entre deux protéines ou pour purifier un composé dans une solution.
  • 6. S/A L'immunologie dans la pratique médicale  L'utilisation de toutes sortes de vaccins a permis le triomphe de la médecine contre de nombreuses maladies infectieuses. Ainsi, la variole est éradiquée, et d'autres maladies sont des candidats à l'éradication par la vaccination : la rougeole, l'hépatite B par exemple.  Ce sont des maladies causées par des virus dont l'être humain est le seul réservoir. La vaccination d'une grande partie de la population permettrait de les éradiquer. Ce sont des objectifs fixés par l'organisation mondiale de la santé.
  • 7. S/A L'immunologie dans la pratique médicale  Par ailleurs, il existe depuis 2006 un vaccins destiné à diminuer le risque de cancers du col de l'utérus. Ce vaccin est dirigé contre un virus responsable de la transformation des cellules épithéliales du col en cellules tumorales.  Vacciner les jeunes filles avant leurs premiers contacts sexuels permettrait de diminuer de 80% les cas de cancer du col.
  • 8. S/A L'immunologie dans la pratique médicale  L'immunologie et l'étude du système immunitaire est un outil indispensable pour deux domaines particuliers : le rejet de greffe et les maladies auto-immunes.  Parallèlement, l'immunologie des tumeurs étudie comment le système immunitaire interagit avec les cellules tumorales, dans le but d'influencer médicalement la puissance potentielle d'une réaction immunitaire dirigée contre une tumeur.
  • 9. S/A Activation du complément  Les anticorps protègent également l'organisme en déclenchant la cascade du complément.  Il s'agit d'un ensemble de protéines du plasma dont l'activation (par la voie classique dans le cas d'anticorps) permet de détruire des bactéries par perforation et de faciliter la phagocytose, l'élimination des complexes immuns et la libération de molécules chimiotactiques. Ce qui nous amène a l'hémolyse du globule rouge.
  • 10. S/A Activation de cellules immunocompétentes  Après avoir reconnu un antigène grâce à sa partie variable, un anticorps peut se lier à des cellules du système immunitaire par sa partie constante.  Ces interactions revêtent une grande importance dans le déroulement de la réponse immunitaire.  Ainsi, les anticorps fixés sur une bactérie peuvent se lier aux macrophages et déclencher une phagocytose.  Les lymphocytes NK (Natural Killer) peuvent exercer leur cytotoxicité et lyser des bactéries opsonisées par des anticorps.
  • 11. S/A Sérologie  La sérologie est la mise en évidence et éventuellement le dosage d'anticorps spécifiques.  Elle est donc liée à l'étude des immunoglobulines du sérum sanguin ou d'autres liquides organiques.  Elle est utilisée comme outil diagnostic, comme outil de dépistage (SIDA, Hépatite,…) et comme outil épidémiologique.
  • 12. S/A Procédure  La sérologie s’effectue sur un prélèvement sanguin veineux (en général au pli du coude). Il n'est pas indispensable d'être à jeun.  Pour établir un diagnostic, deux prélèvements espacés de deux à quatre semaines sont souvent utiles pour montrer une ascension marquant une infection récente.  Les dépistages nécessitent en général un seul prélèvement.
  • 13. S/A Principe  Généralement, la sérologie consiste à évaluer l'immunité à une maladie en mesurant la quantité d'anticorps spécifiques de celle-ci.  Elle peut être utilisée également pour s'assurer de l'efficacité d'une vaccination (c'est le cas par exemple pour l'hépatite B).  Elle peut enfin servir au diagnostic d'une maladie auto-immune.
  • 14. S/A Principe  Les anticorps évoluent après un contact avec la maladie. Les premiers anticorps produits, après le temps de latence, appartiennent à la classe des IgM (immunoglobuline M). Celles-ci laissent progressivement place à une autre classe, les IgG (immunoglobuline G) qui sont plus longtemps produites.  Dans le cas d’une réinfection avec le même agent pathogène, le taux des IgG réaugmente brutalement par un phénomène mémoire du pathogène.  Les temps de latence et l’effet mémoire sont différents selon les maladies.
  • 15. S/A  La sérologie n’est pas appliquée pour toutes les infections, une liste non exhaustive est proposée ci-après  Sérologies virales dans le cadre de situations particulières: Accident d'exposition au sang HIV HBV HCV Bilan prétransfusionnel HIV HBV HCV HTLV CMV
  • 16. S/A Sérologies virales dans le cadre de situations particulières: Bilan prégreffe : HIV HBV HCV CMV Toxoplasmose et syphilis ne sont pas des virus mais sont recherchés dans ce contexte CMV EBV : chez le donneur dans le don de moelle HAV : chez le receveur dans le don de moelle
  • 17. S/A Bilan chez la femme enceinte Rubéole : obligatoire Toxoplasmose : obligatoire VIH : à proposer systématiquement Syphilis HTLV : conseillé pour les femmes originaires de zones tropicales qui souhaitent allaiter.
  • 18. S/A  Sérologie bactérienne: Salmonelloses Syphilis Streptocoques : Anti StreptoLysines O et Anti streptodornase B  Sérologie parasitaire: Toxoplasmose
  • 19. S/A Techniques  Il existe de nombreuses techniques de détection des anticorps:  Précipitation en milieu liquide ou en milieu solide  Agglutination passive  Fixation du complément  Inhibition de l'hémagglutination  Neutralisation (d'une propriété de l'antigène)  Immunofluorescence  Immuno-enzymologie (ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay) o ELISA indirect o ELISA sandwich o ELSA compétition  Western-blot  Radio-immunologie (en particulier pour les dosages hormonaux)
  • 20. S/A Différents types de réactions sérologiques
  • 21. S/A Techniques  La sensibilité et la spécificité varient d’une technique à une autre, donc influent sur le choix de la technique retenue.  Pour un dépistage on cherche à avoir très peu de faux négatifs, c’est pourquoi une technique plus sensible sera valorisée.  Inversement pour une confirmation, on cherche à avoir très peu de faux positifs, ainsi une technique plus spécifique conviendra mieux
  • 22. S/A Sérologie positive ou négative  La réponse immunitaire à une infection fait parfois intervenir la création d'anticorps.  La présence d'anticorps spécifiques à une maladie indique que la personne, à un moment donné dans le passé, a été infectée par la maladie ou est simplement entrée en contact avec l'agent pathogène. On dit que la personne a une sérologie positive, ou bien est séropositive. Inversement, l'absence d'anticorps indique habituellement que la personne n'a pas été contaminée, la personne est dite séronégative.
  • 23. S/A Sérologie positive ou négative  Il s'agit d'une méthode indirecte puisqu'elle ne cherche pas la présence de l'agent pathogène mais la réponse du système immunitaire contre cet agent pathogène.  De même pour les maladies auto-immunes, la présence d'un anticorps auto-immun sera indiquée par le terme de séropositivité et son absence par le terme de séronégativité.  Les polyarthrites rhumatoïdes sont ainsi dites séropositives lorsque la recherche d'anticorps appelé facteur rhumatoïde est présent.
  • 24. S/A Séroconversion  La séroconversion est le passage d'une séronégativité à une séropositivité.  Ce terme est souvent utilisé en obstétrique ou en médecine fœtale pour désigner la date de survenue d'une infection par exemple la toxoplasmose.  Ainsi les conséquences d'une séroconversion sur le fœtus dépendent du terme de la grossesse ou de l'âge gestationnel du fœtus.
  • 25. S/A La réaction de précipitation  Est une réaction Ag-Ac d’agrégation où l’antigène est représenté par les macromolécules en solution colloïdale.  Les complexes Ag-Ac précipitent quand leurs éléments participants ( l’antigène et l’anticorps spécifique) se trouvent dans une proportion optimale.
  • 26. S/A La réaction de précipitation La méthode Ramon: est une réaction de floculation qui apparaît dans toute la masse du liquide sous la forme de flocons et elle permet la mise en évidence du pouvoir d’une toxine, ou d’un sérum antitoxique. Le titrage de la toxine diphtérique :
  • 27. S/A La réaction de précipitation en gel  Un élément (l’Ag ou l’Ac) ou les deux éléments ( l’Ag et l’Ac ) peuvent diffuser dans le gel d’agar ou d’agarose.  La diffusion simple: où soit l’Ag ou soit l’Ac peut diffuser dans le gel d’agar et l’autre élément est introduit en gel.
  • 28. S/A La réaction de précipitation en gel  La méthode de la diffusion radiale de Mancini:  Cette méthode consiste à incorporer un antisérum spécifique dans la gélose et à déposer la solution d'Ag dans des puits. A l'équilibre il se forme un anneau de précipitation dont le carré du diamètre est proportionnel à la concentration de l'Ag.
  • 29. S/A  La méthode de double diffusion en gel d’Ouchterlony  C’est une méthode d’immunodiffusion sur gel : les solutions déposées dans les puits creusés dans le gel diffusent de façon homogène dans toutes les directions autour du puits. Deux auréoles de diffusion peuvent donc entrer en contact lorsqu’elles ont suffisamment progressé.  Cette zone de contact reste invisible s’il n’y a pas de réaction entre les deux solutions. Quand il y a réaction entre les solutions, il se forme un arc de précipitation visible à l’œil nu. Celui-ci est dû à l’interaction entre de nombreux anticorps et les antigènes spécifiques, entraînant la formation de complexes immuns.
  • 30. S/A
  • 31. S/A La diffusion en champ électrique  L’immunoélectrophorèse : faire l’association entre le Principe de l’électophorèse en gel d’agar et la diffusion en gel.  On prépare une plaque en verre avec le gel d’agar. Après sa solidification on fait une fosse centrale et deux godets périphériques.  Les antigènes sont mis dans les godets, on met en marche l’élecrophorèse et les antigènes complexes se séparent
  • 32. S/A  Dans la 2-ème étape on met dans la fosse centrale le sérum qui contient les anticorps et on laisse les réactants pour diffuser.  La correspondance entre les antigènes et les anticorps fait apparaître les arcs de précipitation
  • 33. S/A
  • 34. S/A Les Réactions d’Agglutination  Définition: Les agglutinations mettent en jeu un antigène situé à la surface d’une particule (ou antigène particulaire). C’est un phénomène complexe au cours duquel les anticorps s’unissent aux antigènes portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre les particules et permettent leur réunion en amas.
  • 35. S/A Agglutination : Réaction entre un antigène particulaire et un anticorps constituant un réseau se visualisant sous forme d’un agglutinat anticorps antigène particulaire
  • 36. S/A 2. Les différents types d’agglutination: 1 Agglutination ACTIVE Définition : agglutination résultant d’une union spécifique entre un anticorps et un antigène particulaire appartenant naturellement à la particule. 2. Agglutination PASSIVE Définition : agglutination réalisée entre un anticorps et un antigène normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation sur un support. Particules de latex Antigènes X
  • 37. S/A 3. Agglutination DIRECTE Définition : agglutination réalisée entre un anticorps agglutinant et un antigène généralement particulaire. 4. Agglutination INDIRECTE ou ARTIFICIELLE Définition : agglutination réalisée entre un anticorps non agglutinant et un antigène (généralement particulaire) avec utilisation d’un artifice. Ac agglutinant Ag particulaire SAB SAB SAB SAB Ac non agglutinant SAB Ag particulaire SAB
  • 38. S/A Les Réactions de neutralisation  Ces réactions sont utilisées dans le cas où l’Antigène est doté d’une activité biologique :  enzyme : activité catalytique toxine : activité toxique  virus : activité virale  La formation du complexe immun se traduit par une modification de l’activité biologique de l’Antigène. Ceci peut être dû au masquage du site actif de l’enzyme par l’Anticorps ou à une modification conformationnelle de l’Antigène liée à la fixation de l’Anticorps.  Ces réactions de neutralisation peuvent être utilisées pour la recherche de l’Antigène ou de l’Anticorps.
  • 39. S/A
  • 40. S/A La réaction de fixation du complément ( RFC)  La RFC est une réaction antigène (Ag) – anticorps (Ac) avec la participation du Complément ( C ).  Cette réaction peut être utilisée dans le diagnostic direct pour l’identification d’un microorganisme et dans le diagnostic sérologique pour la mise en évidence des anticorps spécifiques.
  • 41. S/A  Dans le RFC, on a: 1.) le système Ag-Ac à étudier où un élèment (l’Ag ou l’Ac) est connu et l’autre n’est pas connu. Donc, on peut utiliser: le sérum test ou standard qui contient des anticorps connus dans le diagnostic direct, ou le sérum test ou standard qui contient des antigènes connus pour le diagnostic indirect.
  • 42. S/A 2) – le système Complément : est obtenu du serum de plusieurs cobayes 3) – le système hèmolytique (ou le système de référence) qui est représenté par le mélange en partie égales de la suspension d’hématies de mouton (les antigènes) et le sérum hémolytique (les anticorps spécifiques ou l’hémolysine) obtenu par les inoculations répétées des suspensions d’hématies de mouton, chez le lapin.
  • 43. S/A  La RFC est réalisée en deux étapes : o - le contact : du sérum à étudié, l’antigène connu et le Complément; on fait de dilution de sérum; o - on ajoute le système hèmolytique.  Dans le cas d’une réaction positive: il y a une correspondance entre l’Ag et l’Ac, alors ils apparaissent des complexes Ag-Ac, le “C” se fixe sur ce système (les hématies ne sont pas lysées, elles se trouvent en suspension ou elles sont déposées en bouton aux fonds des godets)
  • 44. S/A Dans les RFC quantitatives, on peut déterminer le titre de la réaction qui est donné par la plus grande dilution du sérum où il y a encore des hématies en suspension ( c’est-à-dire qu’il y a une correspondance Ag-Ac). Dans le cas d’une réaction négative, les complexes Ag-Ac ne se réalisent pas et le « C » libre se fixe sur le système hémolytique, en produisant l’hémolyse.
  • 46. S/A Test ELISA  La technique de dosage immuno-enzymatique ou test ELISA ( Enzyme-Linked Immuno Assay en anglais) est principalement utilisée en immunologie  L'ELISA pouvant être utilisé tant pour évaluer la présence d'un antigène que celle d'un anticorps dans un échantillon, c'est un outil efficace à la fois pour déterminer des concentrations sériques d'anticorps (comme pour le test HIV ), que pour détecter la présence d'un antigène.
  • 47. S/A  La technique utilise un ou deux anticorps. L'un de ceux-ci est spécifique de l'antigène, tandis que l'autre réagit aux complexes immuns (antigène-anticorps) et est couplé à un enzyme. Cet anticorps secondaire, responsable du nom de la technique, peut aussi causer l'émission d'un signal par un substrat chromogène
  • 48. S/A Il existe plusieurs types de tests ELISA o ELISA indirect o ELISA sandwich o ELSA compétition
  • 49. S/A
  • 50. S/A L’immunofluorescence  L’immunofluorescence est une technique d’immuno- marquage qui utilise des anticorps ainsi que des fluorochromes.  L'immunofluorescence permet de révéler une protéine spécifique directement dans la cellule, par émission de fluorescence.  Elle permet donc de déterminer non seulement la présence, ou l'absence d'une protéine, mais aussi sa localisation dans la cellule, ou le tissu analysé.
  • 51. S/A L’immunofluorescence * Les fluorochromes sont des substances qui, quand elles sont soumises à un rayon lumineux, deviennent instables (passent à un état excité). Pour revenir à l’état fondamental, les fluorochromes émettent une longueur d’onde différente de la longueur d’onde absorbée.  =>La radiation émise est une lumière de fluorescence. * Un fluorochrome est caractérisé par deux spectres : son spectre d'absorption (de la lumière incidente) et son spectre d'émission de fluorescence.  =>Le spectre d’émission des fluorochromes est dans le visible.
  • 52. S/A *Les fluorochromes les plus classiques: -FITC : ( Fluorescéine Iso Thio Cyanite) dérivé de la fluorescéine : L’isothiocyanate de fluorescéine (ou FITC) o absorbe à =490nm et émet à =517nm (vert). -Dérivés de la rhodamine : L’isothiocyanate de rhodamine o absorbe à =550nm et émet à =580nm (rouge, orangé). -La phycoérythrine est un autre fluorochrome.
  • 53. S/A
  • 54. S/A