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"Everything you always wanted to know about sex (but were afraid to ask)" in  Leishmania  after two decades of l...
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Echelle globale  <ul><li>Dynamique </li></ul><ul><li>Organisation </li></ul>Un domaine de recherche COMPLEXE Foyer de tran...
Mode de reproduction de l’agent infectieux Multiplication et transmission des gènes : propagation de la maladie. Structure...
Un modèle d’étude captivant : les leishmanies <ul><li>En 2002, l’OMS a estimé: </li></ul><ul><li>350 millions le nombre de...
Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigo...
Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigo...
Outils moléculaires peu adaptés Soit pas assez résolutifs (MLEE, RFLP), soit dominants (RAPD), soit multifactoriels (PFGE)...
Théoriquement, dans un modèle clonal strict Accumulation indépendante de mutations  Production d’excès en hétérozygotes Mo...
<ul><li>124 souches humaines de  L.  ( V. )  braziliensis  </li></ul><ul><li>Génotypage sur 12 locus microsatellites </li>...
Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2....
Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2....
Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2....
<ul><li>Tester l’existence d’un effet Wahlund : </li></ul>Se produit lorsque l’échantillon considéré est en réalité compos...
Forts déficits en hétérozygotes - Valeur moyenne  F IS   = 0,504 - Taux d’autofécondation estimé correspondant :  s  = 0,6...
Effet Wahlund Graphe n°3 : Déficit en hétérozygotes pour chaque population et et après clusterisation des populations (BAP...
Forts  F IS  = faible hétérozygotie, DL significatifs Effet Wahlund Diminution des valeurs de  F IS Sous-structuration géo...
Les valeurs de  F IS  restent importantes… Mode de reproduction mixte Alternance de différents modes de reproduction :  Hy...
Encore plus de sexe chez certaines espèces de leishmanies. Régime de reproduction mixte Alternance de différents modes de ...
Clonalité Clonalité Alternance de différents modes de reproduction : cycle de vie Endogamie Allogamie <ul><li>Exemples :  ...
Confirmation de l’hypothèse d’endogamie Mise en évidence de phénomènes de recombinaison génétique entre individus issus  d...
2/ Valider expérimentalement l’existence d’endogamie 1/ Mener le même type d’étude de génétique des populations sur d’autr...
BUTS :  Etudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote. Suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. ...
Quelles sont les prochaines étapes? 3/ Le vecteur = unité de reproduction ? Isoler les parasites Etudes de génétique des p...
REMERCIEMENTS  <ul><li>Projets : </li></ul><ul><li>European Community SD3 project (n8TS3*-CT92-0129) </li></ul><ul><li>- F...
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Virginie Rougeron - Sexuality and clonality in Leishmania

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Virginie Rougeron - Sexuality and clonality in Leishmania

  1. 1. &quot;Everything you always wanted to know about sex (but were afraid to ask)&quot; in Leishmania after two decades of laboratory and field analyses. Rougeron V., De Meeûs T., Kako Ouraga S., Hide M., Bañuls A-L. Laboratoire d’accueil Institut de Recherche pour le Développement Génétique et Evolution des Maladies Infectieuses (UMR CNRS/IRD 2724)‏
  2. 2. Contexte des maladies infectieuses et parasitaires - 2 ème cause de mortalité dans le monde - OMS : ¼ des décès dus aux maladies infectieuses et parasitaires
  3. 3. Echelle globale <ul><li>Dynamique </li></ul><ul><li>Organisation </li></ul>Un domaine de recherche COMPLEXE Foyer de transmission Pathogènes circulants Hôtes réservoirs Vecteurs Agents infectieux Processus biologiques Structure des populations Transmission de la maladie Challenge : mieux comprendre et appréhender l’épidémiologie et les cycles de transmission des pathogènes
  4. 4. Mode de reproduction de l’agent infectieux Multiplication et transmission des gènes : propagation de la maladie. Structure génétique des populations et des stratégies de reproduction : - compréhension des patterns et des cycles de transmission, <ul><li>le diagnostic, les enquêtes épidémiologiques ou le développement de vaccins ou de médicaments. </li></ul>BUT : Progrès faits dans la connaissance du système de reproduction du modèle Leishmania Observations expérimentales du mode de reproduction difficiles, voire impossibles …
  5. 5. Un modèle d’étude captivant : les leishmanies <ul><li>En 2002, l’OMS a estimé: </li></ul><ul><li>350 millions le nombre de personnes à risque, </li></ul><ul><li>2.357.000 le nombre de nouveaux cas / an, </li></ul><ul><li>Réactivation de nombreux foyers, </li></ul><ul><li>Emergence de nouveaux foyers, </li></ul><ul><li>Sous-estimation de la gravité et de la sévérité de ces parasitoses, et de leur impact socio-économique. </li></ul><ul><li>Importance des co-infections VIH/leishmaniose, </li></ul>Important problème de santé publique
  6. 6. Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigote métacyclique : forme indivisible Un cycle biologique complexe (Schéma du cycle biologique des Leishmania , modifié d’après http://dpd.cdc.gov/dpdx)
  7. 7. Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigote métacyclique : forme indivisible Formes cliniques majeures Leishmaniose cutanée Leishmaniose mucocutanée Leishmaniose viscérale PKDL Post-Kala-Azar Dermal Leishmaniasis
  8. 8. Outils moléculaires peu adaptés Soit pas assez résolutifs (MLEE, RFLP), soit dominants (RAPD), soit multifactoriels (PFGE). Echantillons mal adaptés Petite taille, répartitions géographique et temporelle larges Déséquilibre de liaison Estimation précise de la proportion de reproduction sexuée ou de clonalité mal aisée (De Meeûs et Balloux 2004) Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité Deux hypothèses s’opposent : - Majoritairement clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels. - Reproduction sexuée, de type automictique (fusion de gamètes descendants d’un même germe cellulaire). (Tibayrenc et al., 1990) (Bastien et al., 1992) MAIS…
  9. 9. Théoriquement, dans un modèle clonal strict Accumulation indépendante de mutations Production d’excès en hétérozygotes Modèle clonal, associé à des évènements de recombinaison occasionnels. Postulat : les descendants sont génétiquement identiques à leurs parents Faibles taux de locus hétérozygotes et une structure génétique non strictement subdivisée en lignées individualisées. Résultats en contradiction Cependant… (Balloux et al. 2003; De Meeûs et al. 2006) Théorie clonale : (Tibayrenc et al., 2000) (Judson and Normak, 1996; Welch et al. 2000) (Bañuls A-L., 1998) Mode de reproduction des leishmanies: un débat d’actualité
  10. 10. <ul><li>124 souches humaines de L. ( V. ) braziliensis </li></ul><ul><li>Génotypage sur 12 locus microsatellites </li></ul><ul><li>Caractéristiques des sites d’étude : départements, forêt amazonienne, grande diversité en termes de faune et de flore </li></ul>-Bolivie, 1994 -Bolivie, 1998 -Pérou, 1993 -Pérou, 1994 <ul><li>Leishmanioses cutanées et muco-cutanées </li></ul><ul><li>4 sous-échantillons </li></ul>Plus de sexe chez les Leishmanies? (Rougeron et al., Molecular Ecology ressources, 2008)
  11. 11. Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2. </li></ul>Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes produits par l’association aléatoire des gamètes. <ul><li>F IS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1), </li></ul>F IS F IS F IS F IS
  12. 12. Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2. </li></ul>Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes produits par l’association aléatoire des gamètes. <ul><li>F IS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1), </li></ul>-1 +1 0 Panmixie Clonalité Autofécondation
  13. 13. Méthodes d’analyse Génétique des populations <ul><li>Différents paramètres de génétique des populations: FSTAT v. 2.3.9.2. </li></ul>Hypothèse Nulle = le mode de reproduction est panmictique = zygotes produits par l’association aléatoire des gamètes. <ul><li>F IS mesure du déficit en hétérozygotes à l’intérieur des sous-échantillons, reflétant l’écart à la panmixie (variant de -1 à +1), </li></ul><ul><li>s : taux d’autofécondation extrapolé, </li></ul><ul><li>F IS = s / (2- s ) s = (2* F IS ) / (1+ F IS ) </li></ul>- DL : association non aléatoire des allèles à différents locus. F IS F IS F IS F IS
  14. 14. <ul><li>Tester l’existence d’un effet Wahlund : </li></ul>Se produit lorsque l’échantillon considéré est en réalité composé de plusieurs sous-populations. BAPS v. 4.1 = Bayesian Analysis of Population Structure - Inférer la structure génétique d’une population - Déterminer l’existence de clusters intra-population sur la base des génotypes multilocus <ul><li>Vérification de la cohérence des hypothèses proposées : EASYPOP v. 2.0.1. </li></ul>FSTAT v. 2.3.9.2 = déficit en hétérozygotes, F IS , calculé à nouveau.
  15. 15. Forts déficits en hétérozygotes - Valeur moyenne F IS = 0,504 - Taux d’autofécondation estimé correspondant : s = 0,67 Graphe n°1 : Déficit en hétérozygotes dans chacune des populations Graphe n°2 : Déficit en hétérozygotes pour chacun des 12 locus étudiés Résultats : (Rougeron et al., PNAS, 2009)
  16. 16. Effet Wahlund Graphe n°3 : Déficit en hétérozygotes pour chaque population et et après clusterisation des populations (BAPS) - Nombre de clusters : 13 à 15 / population - Forte diminution des F IS au sein des 4 populations étudiées MAIS , les valeurs de F IS restent importantes : F IS = 0,307 Taux d’autofécondation s = 0,47. Déséquilibres de liaison significatifs DL significatifs pour 13 des 66 paires de locus étudiées Résultats : (Rougeron et al., PNAS, 2009)
  17. 17. Forts F IS = faible hétérozygotie, DL significatifs Effet Wahlund Diminution des valeurs de F IS Sous-structuration géographique Barrières géographiques Biologie des réservoirs mammifères et des vecteurs Présence d’un effet Wahlund, MAIS… Clonal = faible F IS = forte hétérozygotie, DL significatifs (Rougeron et al., PNAS, 2009)
  18. 18. Les valeurs de F IS restent importantes… Mode de reproduction mixte Alternance de différents modes de reproduction : Hypothèse testée sous EASYPOP <ul><li>Clonalité, </li></ul><ul><ul><li>Recombinaison sexuée entre individus apparentés, </li></ul></ul><ul><ul><li>Evènements de recombinaison sexuée entre individus non apparentés </li></ul></ul>s ~ 47% c ~ 50% r ~ 3% L . ( V .) braziliensis : (Rougeron et al., PNAS, 2009) <ul><li>Echantillon structuré en petites sous-populations </li></ul><ul><li>Echantillon caractérisé par un mode de reproduction mixte </li></ul>
  19. 19. Encore plus de sexe chez certaines espèces de leishmanies. Régime de reproduction mixte Alternance de différents modes de reproduction : Clonalité <ul><ul><li>Evènements de recombinaison entre individus non apparentés </li></ul></ul><ul><ul><li>Reproduction sexuée, de type allogamique </li></ul></ul><ul><ul><li>Evènements de recombinaison entre individus apparentés </li></ul></ul><ul><ul><li>Reproduction sexuée, de type endogamique </li></ul></ul>(Rougeron et al., PNAS, 2009)
  20. 20. Clonalité Clonalité Alternance de différents modes de reproduction : cycle de vie Endogamie Allogamie <ul><li>Exemples : </li></ul><ul><li>P. falciparum </li></ul><ul><li>Trypanosoma brucei brucei </li></ul>Chez le vertébré Chez le phlébotome Repas sanguin Promastigote de multiplication Amastigotes dans un macrophage Promastigote métacyclique : forme indivisible (Rougeron et al., PNAS, 2009) Rougeron et al., PLoS Pathogens, 2010
  21. 21. Confirmation de l’hypothèse d’endogamie Mise en évidence de phénomènes de recombinaison génétique entre individus issus de deux souches différentes de L. major . Résistante à la drogue A Résistante à la drogue B Hybrides résistants aux deux drogues Première étude à mettre en évidence expérimentalement l’existence de reproduction sexuée chez les leishmanies.
  22. 22. 2/ Valider expérimentalement l’existence d’endogamie 1/ Mener le même type d’étude de génétique des populations sur d’autres espèces de leishmanies Quelles sont les prochaines étapes? Résultats en désaccord avec la théorie clonale pour certaines espèces du genre Leishmania Mode de reproduction mixte Alternance de différents modes de reproduction
  23. 23. BUTS : Etudier la composition génotypique d’une souche hétérozygote. Suivre au cours du temps l’évolution des génotypes. HYPOTHESE : L’attendu d’un mode de reproduction endogamique est une diminution de l’hétérozygotie au cours du temps. Une souche = une population de génotypes ≠ un seul génotype Jusqu’à présent les études de génétique des populations considéraient une souche comme un seul individu. Etude préliminaire : Kako et al. (Session Poster) Quelles sont les prochaines étapes?
  24. 24. Quelles sont les prochaines étapes? 3/ Le vecteur = unité de reproduction ? Isoler les parasites Etudes de génétique des populations Développer une technique de biologie moléculaire Exemple : P. falciparum
  25. 25. REMERCIEMENTS <ul><li>Projets : </li></ul><ul><li>European Community SD3 project (n8TS3*-CT92-0129) </li></ul><ul><li>- French National Project ANR 06-SEST-20 IAEL </li></ul><ul><li>Laboratoires : </li></ul><ul><li>Unit of Molecular Parasitology from the Institut voor Tropische Geneeskunde, Belgium </li></ul><ul><li>Institudo de Medicina Tropical ‘Alexander von Humboldt’, Peru </li></ul><ul><li>Laboratoire de Parasitologie et de Mycology de Montpellier </li></ul>

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