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Amélioration des plantes par les
Biotechnologies
Principales
Principales
techniques et
applications
Introduction
Les biotechnologies végétales sont des
techniques de laboratoire qui permettent
l’optimisation et la diversification des
végétaux ou de leur composants.
végétaux ou de leur composants.
Ces techniques reposent sur de la biologie
cellulaire, de la biologie moléculaire et la
culture in vitro. L’exemple le plus connu est
les OGM.
Introduction
De nombreux chercheurs considèrent la
biotechnologie végétale comme :
le perfectionnement des techniques
le perfectionnement des techniques
d'amélioration génétique
qui ont commencé il y a des millions d'années
avec la culture de plantes sauvages pour la
consommation humaine.
Introduction
Pour améliorer un caractère :
Il faut connaître les gènes, on parle de
génomique.
Il faut introduire le caractère d’intérêt dans
Il faut introduire le caractère d’intérêt dans
la plante, la régénérer et la multiplier,
c’est la culture in vitro.
Cette régénération est basée sur la teneur
en hormones du milieu et sur la
totipotence.
Introduction
En effet, à partir d’un morceau de la plante, on peut
régénérer une plante entière.
Les cellules vont redevenir des cellules indifférenciées
et c’est la composition du milieu qui va orienter les
et c’est la composition du milieu qui va orienter les
cellules vers la formation de tiges ou de racines.
L’organogenèse est la re-fabrication d’organes
On peut aussi réorienter les cellules vers la formation
d’un embryon somatique (issu d’une cellule).
Introduction
Le plus simple pour la culture in vitro est la graine.
Avec les morceaux de tissus on obtient des plantes
diploïdes et avec des grains de pollen ou l’ovaire
on obtient des plantes haploïdes.
on obtient des plantes haploïdes.
La cellule la plus simple et la plus petite utilisée est le
protoplaste. C’est une cellule sans paroi contenant
les chloroplastes.
N’ayant pas de paroi la pénétration de l’ADN est
facilitée.
Culture de méristèmes
Assainissement de
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Obtention de lignées saines
 Principe : les méristèmes sont
indemnes de virus (travaux de P.
Limasset)
Sauvetage d’embryons
Limasset)
 Culture de méristèmes
 Quelques 1/10 mm
 Régénération de plantes saines
Attention : les lignées sont toujours
sensibles à des infections ultérieures !!!
Applications
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 pomme de terre, bananier, artichaut,
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Sauvetage d’embryons
 Normes sanitaires internationales
Premiers succès dans les années 50
Service proposé par la plupart des
sociétés de biotechnologies végétales
Micropropagation
Micropropagation
Micropropagation
 Apex de tige ou bourgeons latéraux,
 Procédure en trois étapes (Murashige, 1974)
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propagules avant transfert en serres
 Clonage très fidèle et très efficace
– 200 000 rosiers à partir d’un bourgeon
Culture simple de nœuds : le bouturage in vitro
Micropropagation
Prolifération de pousses axillaires
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d’éthylène)
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industrielles depuis près de 20 ans
Applications
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Micropropagation
 Orchidées
 Pomme de Terre
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 Orchidées
L’industrie de la micropropagation
 Gain de place
 Affranchissement des saisons
 Rapidité
Micropropagation
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 Pour certaines espèces : pas d’autres
solutions
Millions de plants par an issus de la micropropagation
1980 1988 2001
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Micropropagation
France 2,7 40,5
Belgique 50
Facteur limitant : main d’œuvre
Délocalisations
Exemples
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Embryogenèse somatique
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25°C 3 semaines, photopériode 16h.
Masses de cal (origine cambium vasculaire) renfermant des
cellules initiales d’embryons somatiques (origine épidermique)
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somatique
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transférée sur milieu solide
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de maturation
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somatique
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déshydratation
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Embryogenèse
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d’un stress pour les rendre
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Solution pour la conservation d’espèces tropicales dont
Applications
Embryogenèse
somatique
Solution pour la conservation d’espèces tropicales dont
les semences sont dites « récalcitrantes » à la
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sont pas toujours des clones parfaits:
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J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169
trisomique
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J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169
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(mise au point)
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Exemple de triticale (Triticum x Secale)
Exemple de triticale (Triticum x Secale)
De même que le blé s’est constitué par
l’association naturelle de plusieurs espèces
de graminées sauvages, les hommes ont
de graminées sauvages, les hommes ont
tenté d’associer les qualités du blé et la
rusticité du seigle en croisant ces deux
espèces cultivées, à la fin du 19e siècle.
Exemple de triticale (Triticum x Secale)
D’abord plante de laboratoire, le triticale intéressa
petit à petit les sélectionneurs puis les agriculteurs.
Les efforts des uns et des autres, à travers le
monde, en ont fait aujourd’hui une espèce cultivée
Exemple de triticale (Triticum x Secale)
monde, en ont fait aujourd’hui une espèce cultivée
un peu partout, de plus en plus connue et
appréciée.
Le triticale est essentiellement utilisé pour
l’alimentation animale (alimentation du bétail) mais
aussi alimentation humaine (pain, biscuits, malt) et
utilisation non alimentaire (bioénergie).
Protoplastes
Cellule de plante, de bactérie ou de champignon
débarrassée de sa paroi
Protoplastes
Isolement de protoplastes
Milieu
hyperosmotique
Rupture
mécanique des
parois
Milieu isotonique
Protoplastes
Vieille école :
parois
Faible rendement
Isolement de protoplastes
Milieu
hyperosmotique
Digestion
enzymatique:
Milieu isotonique
Protoplastes
hyperosmotique enzymatique:
Cellulase
Pectinase
Paroi primaire :
20-30% cellulose
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Isolement de protoplastes
Protoplastes
Il faut les préparer et les conserver dans un milieu
hypertonique qui plasmolyse les cellules et leur permet
hypertonique qui plasmolyse les cellules et leur permet
de ne pas éclater par entrée d'eau en l'absence de
paroi.
Purification de protoplastes
 Filtration
 Tamis successifs 100 à 30 µm
 Rinçages
 Flottement sur coussin de saccharose
 Flottement sur coussin de saccharose
 Saccharose 20%, 100g
 Contrôles
 Absence de paroi : Calcofluor White
 Viabilité : Florescein Diacetate (FDA)
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Culture de protoplastes
 Couche mince, milieu liquide
 Composition des milieux
 Milieux MS (Murshige et Skoog), B5 (Gamborg)…
 Maintenir un potentiel osmotique bas
 Maintenir un potentiel osmotique bas
 Glucose 0,35 M
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 Deux auxine fortes (2,4-D + ANA) + cytokinine
 Densité élevée de protoplastes (50 000 –
500 000/ ml)
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l’oxydation
Intérêt des protoplastes
Protoplastes
Comme elles n'ont plus de paroi, ces cellules se prêtent à
divers types d'expérimentation (introduction de
matériel génétique étranger, fusion inter-spécifique,
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Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes
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Origine des gDNA et cpDNA
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Protoplastes
CAPS pattern
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S. melongena S. sysimbrifolia Hybride
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Haplo-diploïdisation
La maîtrise de cette technique a fait de
grands progrès, que ce soit par
croisements interspécifiques (chez le
croisements interspécifiques (chez le
blé, croisement blé x orge bulbeuse, blé x
maïs), par des génotypes inducteurs
(chez le maïs) ou par la culture in vitro
de microspores, d’anthères ou d’ovules.
Des haploïdes : pourquoi faire ?
Cette technique a l'avantage de:
créer une nouvelle variabilité,
faciliter les opérations d'évaluation,
Haplodiploïdisation
mais surtout de raccourcir la phase de
consanguinisation à une seule
génération.
Elle est donc utile lorsque le but de l'amélioration
est la production de lignées pures.
Des haploïdes : pourquoi faire ?
 Recherche de mutations récessives
 Haplodiploïdisation : homozygotie
100%
Haplodiploïdisation
Des homozygotes : pourquoi faire ?
Outil de sélection :
Espèces autogames, Espèces allogames
Obtention de plants haploïdes
 Haploïdisation spontanée
 Parthénogenèse (cellules sac
embryonnaire)
 Haploïdisation induite
Haplodiploïdisation
 Haploïdisation induite
 Androgenèse in vitro
 Gynogenèse in vitro
 Parthénogenèse in situ
Androgenèse
 Développement sporophytique
(haploïde) par culture des
gamétophytes mâles
Haplodiploïdisation
Limite : albinisme dans
certains cas
 Cultures d’anthères ou de microspores isolées
Source : CNRC-IBP-Canada
Gynogenèse
 Développement sporophytique de
gamétophytes femelles  obtention
de plants haploïdes
Haplo/diploïdisation
 Culture in vitro d’ovaires ou d’ovules
 Pollinisation croisée
 Utilisation de pollen irradié
Parthénogenèse in situ
Doublement des chromosomes
 Utilisation d’agents mitoclasiques
 Blocage de la polymérisation des
microtubules
 Colchicine
Haplo/diploïdisation
 Colchicine
 Oryzaline
 Contrôle de la ploïdie
 Cytométrie en flux
Le pommier : un matériel génétique difficile à étudier:
•Cycle reproductif lent (période juvénile 5-7 ans)
•Autostérilité
Obtention d’haploïdes de pommier
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
Impossible d’obtenir des lignées 100%
homozygotes par la sélection classique
Obtention de lignées haploïdes
Doublement chromosomique
Obtention des haploïdes
 Fécondation avec du pollen irradié
 Récolte des graines et semis
 Première étape : sélection des haploïdes
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
Micropropagation des haploïdes
 Mise en culture d’apex
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
 Multiplication (repiquage toutes les 5 semaines)
Doublement de chromosomes
Recouvrir avec du
milieu contenant de
l’oryzaline 15-50 µM
Incuber 2 heures à
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
Incuber 2 heures à
2°C
Cultiver 1
mois
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/
Contrôle de la ploïdie
Haplo/diploïdisation
Comptage des
chromosomes
Cytométrie en flux
Microgreffage et sortie d’in vitro
Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
Humidité relative 80%
Autres utilisation du doublement de chromosomes
 Obtention de lignées tétraploïdes
 Robustesse
 Stérilité  exemple du schéma de
production de graines de pastèques
triploïdes
triploïdes
F0 2N
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  • 1. Amélioration des plantes par les Biotechnologies Principales Principales techniques et applications
  • 2. Introduction Les biotechnologies végétales sont des techniques de laboratoire qui permettent l’optimisation et la diversification des végétaux ou de leur composants. végétaux ou de leur composants. Ces techniques reposent sur de la biologie cellulaire, de la biologie moléculaire et la culture in vitro. L’exemple le plus connu est les OGM.
  • 3. Introduction De nombreux chercheurs considèrent la biotechnologie végétale comme : le perfectionnement des techniques le perfectionnement des techniques d'amélioration génétique qui ont commencé il y a des millions d'années avec la culture de plantes sauvages pour la consommation humaine.
  • 4. Introduction Pour améliorer un caractère : Il faut connaître les gènes, on parle de génomique. Il faut introduire le caractère d’intérêt dans Il faut introduire le caractère d’intérêt dans la plante, la régénérer et la multiplier, c’est la culture in vitro. Cette régénération est basée sur la teneur en hormones du milieu et sur la totipotence.
  • 5. Introduction En effet, à partir d’un morceau de la plante, on peut régénérer une plante entière. Les cellules vont redevenir des cellules indifférenciées et c’est la composition du milieu qui va orienter les et c’est la composition du milieu qui va orienter les cellules vers la formation de tiges ou de racines. L’organogenèse est la re-fabrication d’organes On peut aussi réorienter les cellules vers la formation d’un embryon somatique (issu d’une cellule).
  • 6. Introduction Le plus simple pour la culture in vitro est la graine. Avec les morceaux de tissus on obtient des plantes diploïdes et avec des grains de pollen ou l’ovaire on obtient des plantes haploïdes. on obtient des plantes haploïdes. La cellule la plus simple et la plus petite utilisée est le protoplaste. C’est une cellule sans paroi contenant les chloroplastes. N’ayant pas de paroi la pénétration de l’ADN est facilitée.
  • 8. Obtention de lignées saines Principe : les méristèmes sont indemnes de virus (travaux de P. Limasset) Sauvetage d’embryons Limasset) Culture de méristèmes Quelques 1/10 mm Régénération de plantes saines Attention : les lignées sont toujours sensibles à des infections ultérieures !!!
  • 9. Applications Espèces à reproduction végétative pomme de terre, bananier, artichaut, fraisier… Sauvetage d’embryons Normes sanitaires internationales Premiers succès dans les années 50 Service proposé par la plupart des sociétés de biotechnologies végétales
  • 11. Micropropagation Micropropagation Apex de tige ou bourgeons latéraux, Procédure en trois étapes (Murashige, 1974) – I : établissement du tissu en conditions d’asepsie – II: multiplication de tiges feuillées – III: formation de racines et conditionnement de propagules avant transfert en serres Clonage très fidèle et très efficace – 200 000 rosiers à partir d’un bourgeon
  • 12. Culture simple de nœuds : le bouturage in vitro Micropropagation Prolifération de pousses axillaires Problèmes : Vitrification (liée à la production d’éthylène)
  • 13. Exemple de la pomme de terre : applications industrielles depuis près de 20 ans
  • 14. Applications Horticulture, Sylviculture, Agronomie Les « grands succès » économiques Banane Orchidées Micropropagation Orchidées Pomme de Terre Conservation de la biodiversité plantes carnivores Orchidées
  • 15. L’industrie de la micropropagation Gain de place Affranchissement des saisons Rapidité Micropropagation Qualité sanitaire et homogénéité Pour certaines espèces : pas d’autres solutions
  • 16. Millions de plants par an issus de la micropropagation 1980 1988 2001 Pays-Bas 7,4 61,5 Micropropagation France 2,7 40,5 Belgique 50 Facteur limitant : main d’œuvre Délocalisations
  • 18. 20 hottes à flux laminaire Vivai Battisitini (Italie) Micropropagation Exemples 60 000m2 de serres 3 chambres de culture 4 000 000 plants vendus chaque année Technivit (Bourges) Multiplication Assainissement Création variétale
  • 20. Embryogenèse somatique Génération d’un embryon à partir d’un méristème, d’un cal ou de suspensions Embryogenèse somatique suspensions
  • 21. L’embryogenèse zygotique Embryogenèse somatique Source : http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch07/fig7_5.jpg
  • 22. Pétioles de luzerne Mise en culture 2,4-D + kinétine 25°C 3 semaines, photopériode 16h. Masses de cal (origine cambium vasculaire) renfermant des cellules initiales d’embryons somatiques (origine épidermique) Dispersion en milieu liquide B5 (2,4-D + kinétine) 7 jours Tamisage : fraction 200-500 mm Exemple : la luzerne Embryogenèse somatique Développement des embryons : 5-7 jours Tamisage : fraction 200-500 mm transférée sur milieu solide http://www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/synseeds.htm
  • 23. Premier milieu de maturation (sucrose) Second milieu de maturation (ABA, 3 jours) Embryogenèse somatique Rinçage, déshydratation (15% H2O) Conservation : 1 an Source : Crop Science, University of Guelph
  • 24. Choix des explants, éventuellement application d’un stress pour les rendre Embryogenèse somatique SELECTION IN VITRO d’un stress pour les rendre compétents
  • 25. Obtention de semences pour des variétés stériles (ex: pommes de terre polyploïdes, bananier…) Semences « d’élite » pour des espèces allogames Solution pour la conservation d’espèces tropicales dont Applications Embryogenèse somatique Solution pour la conservation d’espèces tropicales dont les semences sont dites « récalcitrantes » à la déshydratation Obtention rapide de semences « d’élite » pour des espèces ligneuses Possibilité de cultures en réacteurs : production de semences artificielles à grande échelle (gymnospermes)
  • 30. La vitrovariation Les plantes régénérées à partir de cals, de protoplastes ou de feuilles ne sont pas toujours des clones parfaits: sont pas toujours des clones parfaits: instabilité chromosomique, aneuploïdies différences morphologiques
  • 31. Clone V Clone C Clone A Clone B diploide Clone B chimère trisomique J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169 trisomique Clone C diploïde Clone C trisomique
  • 32. J.-L. Fourré et al. Theor Appl Genet (1997) 94: 159–169
  • 33. Utilisation de la vitrovariation Mise à profit de la variation somaclonale dans le cadre de programmes de sélection Sélection de cals tolérants à des stress Sélection de cals tolérants à des stress Augmentation artificielle de la variabilité Traitements chimiques Radiations
  • 35. Amélioration d’une plante ornementale : le Caryopteris Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Grand Bleu® Caryopteris x clandonensis 'Inoveris' Heavenly Blue Peu de variabilité dans les populations Micropropagation et mutagenèse par irradiation
  • 36. Vitropropagation (mise au point) Irradiation de bourgeons : rayons γ (avec la dose adéquate) Régénération des plantules Acclimatation, obtention de graines INRA/SAPHINOV. Diffusion SAPHO Sélection des mutants Acclimatation, croissance Perte des caractères (????) Stabilité des caractères plantules Semis et sélection sur la nouvelle génération Commercialisation
  • 37. Micropropagation et mutagenèse par irradiation © INRA, A. Cadic Amélioration du Weigela 'Courtadur' GRENADINE ® 'Bristol Ruby' Culture de plantules in vitro Doublement chromosomique à la colchicine Variété tétraploïde Variété diploïde Variété triploïde (stérile) Allègement des soins d’entretien
  • 38. Variétés polyploïdes, stériles, fortement hétérozygotes Multiplication végétative Apport des biotechnologies dans l’amélioration du Bananier L’amélioration génétique par croisement est impossible Multiplication végétative impossible Presque toutes les variétés de bananes et de plantain découlent de mutations spontanées
  • 39. Mutagenèse par irradiation de vitroplants de bananiers Sélection de mutants de petite taille, à fructification précoce Apport des biotechnologies dans l’amélioration du Bananier fructification précoce Possibilité de 4 récoltes tous les 2 ans (au lieu de 3) Impact sur la vie économique locale. Forte demande de plants issus de vitroculture
  • 40. Problème de l’irradiation de tissus méristématiques : obtentions de chimères Solution (chez le bananier): γ Embryogenèse à partir de suspensions cellulaires Démonstration que les embryons somatiques sont issus de cellules uniques Irradiation de suspensions de cellules embryogéniques γ
  • 42. Incompatibilité du porte graine Les semences hybrides sont viables mais le développement ne peut se faire sur le pied mère Sauvetage d’embryons Régénération de la plante par culture in vitro de l’embryon Exemple de triticale (Triticum x Secale)
  • 43. Exemple de triticale (Triticum x Secale) De même que le blé s’est constitué par l’association naturelle de plusieurs espèces de graminées sauvages, les hommes ont de graminées sauvages, les hommes ont tenté d’associer les qualités du blé et la rusticité du seigle en croisant ces deux espèces cultivées, à la fin du 19e siècle.
  • 44. Exemple de triticale (Triticum x Secale)
  • 45. D’abord plante de laboratoire, le triticale intéressa petit à petit les sélectionneurs puis les agriculteurs. Les efforts des uns et des autres, à travers le monde, en ont fait aujourd’hui une espèce cultivée Exemple de triticale (Triticum x Secale) monde, en ont fait aujourd’hui une espèce cultivée un peu partout, de plus en plus connue et appréciée. Le triticale est essentiellement utilisé pour l’alimentation animale (alimentation du bétail) mais aussi alimentation humaine (pain, biscuits, malt) et utilisation non alimentaire (bioénergie).
  • 46. Protoplastes Cellule de plante, de bactérie ou de champignon débarrassée de sa paroi Protoplastes
  • 47. Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Rupture mécanique des parois Milieu isotonique Protoplastes Vieille école : parois Faible rendement
  • 48. Isolement de protoplastes Milieu hyperosmotique Digestion enzymatique: Milieu isotonique Protoplastes hyperosmotique enzymatique: Cellulase Pectinase Paroi primaire : 20-30% cellulose 70-80 % hémicellulose et pectine
  • 49. Isolement de protoplastes Protoplastes Il faut les préparer et les conserver dans un milieu hypertonique qui plasmolyse les cellules et leur permet hypertonique qui plasmolyse les cellules et leur permet de ne pas éclater par entrée d'eau en l'absence de paroi.
  • 50. Purification de protoplastes Filtration Tamis successifs 100 à 30 µm Rinçages Flottement sur coussin de saccharose Flottement sur coussin de saccharose Saccharose 20%, 100g Contrôles Absence de paroi : Calcofluor White Viabilité : Florescein Diacetate (FDA) Théoriquement 80 % viabilité
  • 51. Culture de protoplastes Couche mince, milieu liquide Composition des milieux Milieux MS (Murshige et Skoog), B5 (Gamborg)… Maintenir un potentiel osmotique bas Maintenir un potentiel osmotique bas Glucose 0,35 M Glucose + mannitol Doses élevées d’hormones Deux auxine fortes (2,4-D + ANA) + cytokinine Densité élevée de protoplastes (50 000 – 500 000/ ml) Premiers temps à l’obscurité : éviter l’oxydation
  • 52. Intérêt des protoplastes Protoplastes Comme elles n'ont plus de paroi, ces cellules se prêtent à divers types d'expérimentation (introduction de matériel génétique étranger, fusion inter-spécifique, étude électro-physiologique de la membrane plasmique, etc.)
  • 53. Intérêt des protoplastes Régénération de plantes à partir de cultures de protoplastes Fusion de protoplastes Protoplastes Fusion de protoplastes Etudes d’échanges de métabolites Transformation génétique Culture moléculaire
  • 54. Fusion de protoplastes •Fusion spontanée (soja, maïs) • Ca2+ pH basique Protoplastes •PEG •Choc électrique
  • 55. Exemple : fusion entre un protoplaste de poireau et un protoplaste de choux rouge Protoplastes Comment trier les hybrides ? http://www.snv.jussieu.fr/vie/
  • 56. Comment se répartit le matériel génétique ? Protoplastes noyaux mitochondries chloroplastes Cybrides (cytoplasmes hybrides) hybrides somatiques (addition des noyaux)
  • 57. Solanum melongena Ralstonia solanacearum Verticillium dahliae sensibilité Application agronomique Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes Solanum sysimbrifolium Bonne tolérance Problème: fécondation croisée inefficace
  • 58. Confection de protoplastes à partir de 500 mg de feuilles de chaque espèce Ajustement de la densité à 3.5 105 / ml dans 0.5M mannitol + 0.5mM CaCl2 Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes Mélanger les deux préparations dans une boite de Pétri Alignement : courant alternatif 15s, 230, V.cm-1, 1 MHz Fusion : courant continu 2*45s 1200 V.cm-1
  • 59. Après le choc électrique : milieu de culture + 0.4 M de glucose + PEG 250 mg/l + hormones : 2,4-D, zeatine, NAA 7 jours à l’obscurité Milieu neuf : Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes 7 jours à l’obscurité 15 jours à la lumière Milieu neuf : 2,4-D + BAP Cal Milieu de régénération de tiges : zéatine et IAA Milieu de multiplication sans hormones Sélection des hybrides (400) 22 plants régénérés
  • 60. Comment être sûr qu’il s’agit Protoplastes Comment être sûr qu’il s’agit d’hybrides ?
  • 61. Morphologie des hybrides Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes
  • 62. Dénombrement des chromosomes respectifs Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes GISH : Genomic In Situ Hybridization sonde : ADN de S. sysimbrifolium « coloré » à la fluoresceine Contre coloration : iodure de propidium 24 chromosomes de chaque
  • 63. Origine des gDNA et cpDNA RAPD pattern Les ADN génomiques sont tous les deux présents Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes CAPS pattern Les chloroplastes sont de S sysimbrifolium !! tous les deux présents
  • 64. Tolérance au flétrissement bactérien causé par Ralstonia Collonier et al. 2003 Plant Science Protoplastes S. melongena S. sysimbrifolia Hybride Collonier et al. 2003 Plant Science
  • 65. Haplo-diploïdisation La maîtrise de cette technique a fait de grands progrès, que ce soit par croisements interspécifiques (chez le croisements interspécifiques (chez le blé, croisement blé x orge bulbeuse, blé x maïs), par des génotypes inducteurs (chez le maïs) ou par la culture in vitro de microspores, d’anthères ou d’ovules.
  • 66. Des haploïdes : pourquoi faire ? Cette technique a l'avantage de: créer une nouvelle variabilité, faciliter les opérations d'évaluation, Haplodiploïdisation mais surtout de raccourcir la phase de consanguinisation à une seule génération. Elle est donc utile lorsque le but de l'amélioration est la production de lignées pures.
  • 67. Des haploïdes : pourquoi faire ? Recherche de mutations récessives Haplodiploïdisation : homozygotie 100% Haplodiploïdisation Des homozygotes : pourquoi faire ? Outil de sélection : Espèces autogames, Espèces allogames
  • 68. Obtention de plants haploïdes Haploïdisation spontanée Parthénogenèse (cellules sac embryonnaire) Haploïdisation induite Haplodiploïdisation Haploïdisation induite Androgenèse in vitro Gynogenèse in vitro Parthénogenèse in situ
  • 69. Androgenèse Développement sporophytique (haploïde) par culture des gamétophytes mâles Haplodiploïdisation Limite : albinisme dans certains cas Cultures d’anthères ou de microspores isolées Source : CNRC-IBP-Canada
  • 70. Gynogenèse Développement sporophytique de gamétophytes femelles obtention de plants haploïdes Haplo/diploïdisation Culture in vitro d’ovaires ou d’ovules Pollinisation croisée Utilisation de pollen irradié Parthénogenèse in situ
  • 71. Doublement des chromosomes Utilisation d’agents mitoclasiques Blocage de la polymérisation des microtubules Colchicine Haplo/diploïdisation Colchicine Oryzaline Contrôle de la ploïdie Cytométrie en flux
  • 72. Le pommier : un matériel génétique difficile à étudier: •Cycle reproductif lent (période juvénile 5-7 ans) •Autostérilité Obtention d’haploïdes de pommier Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation Impossible d’obtenir des lignées 100% homozygotes par la sélection classique Obtention de lignées haploïdes Doublement chromosomique
  • 73. Obtention des haploïdes Fécondation avec du pollen irradié Récolte des graines et semis Première étape : sélection des haploïdes Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation
  • 74. Micropropagation des haploïdes Mise en culture d’apex Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation Multiplication (repiquage toutes les 5 semaines)
  • 75. Doublement de chromosomes Recouvrir avec du milieu contenant de l’oryzaline 15-50 µM Incuber 2 heures à Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation Incuber 2 heures à 2°C Cultiver 1 mois
  • 76. Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Contrôle de la ploïdie Haplo/diploïdisation Comptage des chromosomes Cytométrie en flux
  • 77. Microgreffage et sortie d’in vitro Source : http://www.angers.inra.fr/dossiers/haploidie/ Haplo/diploïdisation Humidité relative 80%
  • 78. Autres utilisation du doublement de chromosomes Obtention de lignées tétraploïdes Robustesse Stérilité exemple du schéma de production de graines de pastèques triploïdes triploïdes F0 2N F-1 2N F0 4N colchicine F1 3N ♀ ♂ ♀ ♂ Pollinisateur 2N Fruits sans pépins