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APPLICATION DE LA TECHNOLOGIE NUCLEOFECTIONTM POUR L’IDENTIFICATION DES PROTEINES SALIVAIRES DE PHLEBOTOMUS PAPATASI, CANDIDATS VACCINS CONTRE LA LEISHMANIOSE CUTANEE CHEZ L’HOMME

  • 1. Application de la Technologie NucleofectionTM pour l’identification des protéines salivaires de phlebotomus papatasi, candidats vaccins contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme Tlili Aymen 1, Soumaya Marzouki 1, Emna Chabaane1 Maha Abdeladhim2, Wafa Kammoun-Rebai 3, Nabil Belhadj-Hmida1, Shaden Kamhawi 2, Hechmi Louzir1-4 , Jesus G Valenzuela2, Melika Ben Ahmed1-4 1 Laboratoire de Transmission, Contrôle et Immunobiologie des Infections 2 Vector Molecular Biology Section, Laboratory of Malaria and Vector Research, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH 3 Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies et Biomolécules 4 Faculté de Médecine de Tunis, Université Tunis El Manar
  • 2. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Maladie chronique généralisée Contamination par des parasites protozoaires flagellés: Leishmania Mammifères
  • 3. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 •Le centre et le sud (Kairouan, Sidi Bouzid , Gafsa ) Localisation •Lésions ulcéreuses crouteuses multiples •Taille variable •Les régions découvertes du corps Clinique •L. majorAgent pathogène •Phlebotomus papatasiVecteur LCS LCZ LCA LCZ
  • 4. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Problème sanitaire d’urgence Un taux de létalité Moyens diagnostiques et de médicaments Prévention par une vaccination
  • 5. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 vaccin agent pathogène Elaboration du vaccin anti-parasite complexe La biologie complexe du parasite La variabilité antigénique La faible immunogénicité des antigènes
  • 6. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Efficacité de l’immunisation contre la salive du vecteur BALB/c Souris Naïve Souris pré- exposée Résistance à l’infection
  • 7. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Chez la souris Extrait salivaire total type T CD4+ IFN-ɤ et IL12 Th1 Réponse immune protectrice
  • 8. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Tc2 cells SGE IL-10+++ CD8 Absence de protection ? Th1 cells SGE IFN- CD4 PROTECTION Candidat vaccin? Chez l’Homme
  • 9. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Résultats préliminaires CD4 CD8 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Unstimulated SGE >30KDa <30KDa indexofproliferation CD4 CD8 0 10 20 30 Unstimulated SGE >30KDa <30KDa RatioofIFN-
  • 10. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Identifier les protéines salivaires de Phlebotomus papatasi cibles de la réponse immune cellulaire spécifique chez des patients vivants en zone d’endémie de LCZ en Tunisie, et plus particulièrement d’identifier celle(s) qui activent la réponse immune de type Th1 représentant des candidats vaccins potentiels contre l’infection leishmanienne.
  • 11. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Choix des protéines salivaires FAMILLES DE PROTEINES SALIVAIRES P. argentipes, P. ariasi, P. perniciosus, L. Longipalpis P. papatasi Immunodominante induit Th2 Biomarqueur
  • 12. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Impulsions électriques NUCLEOFECTION Plasmide recombinant Séquence de protéine salivaire
  • 13. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Prélever du sang total d’individus atteint de la leishmaniose Séparation des PBMC avec le Ficoll - Hypaque Transfecter les PBMC avec des plasmides recombinants par Nucleofection Production des protéines dans les PBMC humaines Etude de la réponse cellulaire
  • 14. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 PBMC de 10 donneurs immunisés contre la salive de P. papatasi et transfectés par les plasmides recombinants Elisa sandwich anti IFN- Incorporation de thymidine tritiée Cytokines secrété Index de prolifération cellulaire Activation ou non d’une réponse immune cellulaire Th1 Cytokines Multiplex TH1/TH2/TH17
  • 15. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Étude de la prolifération cellulaire des PBMC transfectées Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP44 1 2 3 4 indexofproliferation PpSP36 , PpSP42 et PpSP44 : Résultats significatifs
  • 16. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Dosage de l’IFN- dans les surnageants de PBMC transfectées Unstimulated SP15 SP28 SP34 SP36 SP42 SP44 0 50 100 150 200 250 300 350 400 IFN-concentration(pg/ml) PpSP36, PpSP42 et PpSP44 : induction significative d’IFN- Chez 7 donneurs
  • 17. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Monitoring de cytokines Th1/Th2/Th17 IFN- IL-10
  • 18. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 L’ensemble des données obtenus chez les donneurs immuns Yellow related proteins PpSP42 et PpSP44 Apyrase ou PpSP36 Réponse immune cellulaire de type Th1 Candidats vaccins potentiels
  • 19. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 PpSP44 PpSP42 PpSP36 Production de la forme recombinante Stimulant directe des PBMC fraiches de 10 donneurs immunisés contre la salive sans transfection Taux d’IFN-ɤ secrété Prolifération cellulaire Etude de la réponse immune
  • 20. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Étude de la prolifération cellulaire des PBMC stimulées par la rPpSP44 1 2 3 4 *** 0.0002p Controls Immune donors indexofproliferation
  • 21. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Dosage de l’IFN- sur les PBMC stimulées par la rPpSP44 0 100 200 300 400 *** < 0.0001p Controls Immune donors IFN-concentration(pg/ml)
  • 22. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 PpSP36 PpSP42 PpSP44 La PpSP15 n’est pas un candidat vaccin ≠ souris LJM11 LJM17 Protection P. papatasi L. longipaplpis Modèles murins
  • 23. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Conclusion La transfection cellulaire par Nucleofection semble une technique prometteuse permettant l’étude de la réponse immune dirigée contre les protéines salivaires des vecteurs de la leishmaniose. Son utilisation a permis de mettre en évidence la capacité de trois protéines salivaires PpSP44, PpSP42 et PpSP36 à induire une réponse cellulaire potentiellement protectrice. La protéine PpSP44 a montré les meilleures résultats de prolifération cellulaire et de sécrétion d’IFN- constituant ainsi le meilleur candidat vaccin contre la LCZ.
  • 24. Colloque Jeunes Chercheurs de l’Institut Pasteur de Tunis 8-9 Décembre 2016 Merci pour votre attention

Notes de l'éditeur

  1. Les leishmanioses sont des maladies chroniques généralisées dues à la contamination par des protozoaires flagellés du genre Leishmania - transmises par la piqure infectante d’un insecte diptère hématophage - le phlébotome
  2. En Tunisie leishmania major est l’agent responsable des leishmanioses cutanées dans des foyer de phlebotmus papatasi au centre du pays
  3. Il s’agit d’un réel problème de santé publique avec un taux de létalité élevé peu de moyens diagnostiques et thérapeutiques. La thérapeutique reste basée sur des drogues anciennes et toxiques d’où la nécessité d’une prévention par vaccination
  4. Cependant le problème majeur des vaccins qui ciblent l’agent pathogène reste la biologie complexe du parasite, la variabilité antigénique et la faible immunogénicité des antigènes.
  5. Une autre alternative est l’immunisation contre la salive du vecteur. En effet, il a été démontré que la pré-exposition de souris à la salive du phlébotome confère une résistance à l’infection ultérieure par le parasite leishmania
  6. Chez la souris l’extrait total de glande salivaire active une population T CD4+ protectrice de phénotype Th1 sécrétrice d’IFN-g et d’IL12.
  7. Les études réalisées dans notre laboratoire ont montré que l’extrait de glande salivaire de phlebotomus papatasi active chez l’Homme une population T CD8 de phénotype Tc2 sécrétrice d’Il10 et responsable de l’exacerbation de la maladie. De façon intéressante, lorsqu’on bloque l’Il-10 l’extrait de glande salivaire active une population CD4 de phénotype Th1 productrice d’IFN-g et associée à la protection et c’est la caractérisation des protéines salivaires responsables de l’activation de cette population qui semble intéressante pour l’identification des candidats vaccins potentiels.
  8. Pour cela nous nous sommes proposés de fractionner les glandes salivaires selon leur poids moléculaires et d’étudier leur effet sur la prolifération et la production d’IFN-g par les lymphocytes T CD4 et CD8 séparés à partir du sang de donneurs immunisés contre la salive de phlebotomus papatasi. Nous avons montré que les protéines appartenant à la fraction salivaire de + que 30 KDa induisent la prolifération des L ymphocytes T CD4 avec forte production d’IFN-g
  9. Nous nous sommes fixés comme objectif d’identifier les protéines salivaires de phlebotomus papatasi qui activent une réponse immune de type Th1 et représentant ainsi des candidats vaccins potentiels contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme.
  10. Nous avons ciblé les protéines salivaires de + que 30KDa à savoir la SP28 qui appartient à la famille des D7 protéines, 2 yellow protéines SP42 et SP44 et une apyrase Sp36. Nous avons inclus la protéine Sp15 associée à la protection dans les modèle murins. Par contre nous avons exclu de notre étude la SP32 qui est la protéine immunodominante induisant une réponse Th2 et nous avons inclus la protéine non immunogène SP34 comme contrôle négatif.
  11. Vu la disponibilité des plasmides recombinants pour les différentes protéines salivaires de papatasi, nous avons opté pour la technique Nucleofection qui repose sur l’application d’impulsions électriques qui provoquent l’ouverture transitoire des pores membranaires permettant le passage des plasmides vers les noyaux des cellules et l’expression des protéines d’intérêt.
  12. Notre stratégie consiste ainsi à prélever du sang total d’individus exposés à la salive des phlébotomes, de séparer les PBMC sur gradient de densité et les transfecter par des plasmides recombinants contenant les séquences codant pour les protéines salivaires d’intérêt qui vont être produites dans les PBMC humaines. Puis nous étudions la réponse immune activée en vérifiant la prolifération cellulaire et l’induction d’IFN-g.
  13. Dans le présent travail, les PBMC de 10 vivant dans la région d’endémie de sidi bouzid et immunisés contre la salive de phlebotomus papatasi ont été transfectés par des plasmides. La réponse immune activée des PBMC transfectés a été évalué en étudiant la prolifération cellulaire par l’incorporation de la thymidine tritiée et les cytokines sécrétées dans les surnageants de culture cellulaire par Elisa sandwich anti-IFN-g et cytokine multiplex th1 th2 et th17 . Le taux de transfection évalué par la transfection de plasmides contenant la GFP était autour de 20%.
  14. L’étude de la réponse proliférative des PBMC transfectés a montré des résultatas significatifs avec les protéines PpSP36 PpSP42 et surtout PpSP44
  15. Ceci est en corrélation avec les résultats de l’ELISA qui a montré une induction significative de l’IFN-g par les protéines PpSP36 PpSP42 et PpSP44 chez 7 donneurs. Les taux d’IFN-g les plus élevés ont été obtenus avec la yellow protéine PpSP44 avec une mediane de 320 pg/ml
  16. L’étude des cytokines par une technique multiplex a confirmé la production l’IFN-g avec ces 3 protéines surtout la PpSP44 et a aussi confirmé le phénotype Th1 de la réponse vu l’absence de production de cytokines Th2. de façon surprenante nous avons démontré que la PPSP15 induit des cytokines Th2 comme l’IL4 et l’IL6 et surtout l’IL10 sur les PBMC
  17. L’ensemble des données obtenus suggèrent que les 2 yellow protein PpSP42 et PpSP44 ainsi que l’apyrase PpSP36 induisent une réponse immune cellulaire de type Th1 et semblent constituer des candidats vaccins potentiels contre la leishmaniose cutanée chez l’Homme.
  18. Parmi ces protéine, la PpSP44 a montré les meilleurs niveaux de prolifération cellulaire et d’induction d’IFN-g. pour cela nous nous sommes proposés de produire la forme recombinante de cette protéine pour l’utiliser comme stimulant directe des PBMC de donneurs immunisés afin de tester son effet sur la réponse immune activée.
  19. Nos résultats montrent que la PpSP44 recombinante induit une prolifération significative des PBMC de tous les donneurs immuns.
  20. Et que ces résultats corrèlent avec celles de l’ELISA qui montre une forte induction de l’IFN-g chez tous les donneurs confirmant ainsi la possibilité d’utiliser cette protéine comme candidat vaccin
  21. Nos résultats sont en accord avec les données de littérature qui montrent que les yellow protein LJM11 et LJM17 présentes dans la salive de Lutzomya longipalpis et qui sont homologues aux yellow protein de phlebotomus papatasi, induisent la protection contre la leishmaniose cutanée dans les modèles murins. Cependant, ils ne confirment pas le statut de la PpSP15 comme candidat vaccin comme cela a été démontré chez la souris
  22. En conclusion la transfection……………… cette technique nous a permis de mettre en évidence ………………… de façon très intéressante la PpSP44………………