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Hépatite C
Virus & Marqueurs
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil
Découverte du Virus de l’Hépatite C
From New England Journal of Medicine, 1975
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Identification du Virus de l’Hépatite C
From Science 21 April 1989
Hépatite C : Virus et Marqueurs
The Global Burden of HCV Infection
• Approximately 130-170 million people are
chronically infected with HCV
• HCV is responsible for >350,000 deaths per year
worldwide
• Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of
their status
• Less than 10% of the HCV-infected population has
received treatment in the US
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Hépatite C : Virus et Marqueurs
RateofSVR(%)
0
20
40
60
80
100
IFNα + RBV
48 weeks
IFNα
48 weeks
10%
Peg-IFNα
+ RBV + PI
24-48 weeks
Peg-IFNα
+RBV
48 weeks
All-oral
IFN-free
12 weeks
30%
45%
70%
Peg-IFNα
+ RBV + NA
12 weeks
89%
95%
Pawlotsky et al., J Hepatol 2015; 62:S87-S99.
Rates of SVR according to Treatment
Regimens (G1)
Plan
Hépatite C : Virus et Marqueurs
I. TAXONOMIE
Virus de l’Hépatite C
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
Phylogénie de la région codant la protéine NS5B
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Phylogénie bayésienne de
la région codant la
protéine NS5B
Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438.
• Famille : Flaviviridae
• Genre : Hepacivirus
• Hôte naturel : Homme
• Tropisme : Foie
Virus de l’Hépatite C
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13.
Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a)
CHV: canine hepacivirus
RHV: rodent hepacivirus
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Identification d’Homologues du VHC chez
les Non Primates
Equine hepacivirus in Blue
Rodent hepacivirus in Red
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438.
Phylogénie de la région
NS3 (3192-4889 HCV g1a)
II. MODÈLES EXPERIMENTAUX
Les Différents Modèles d’Etude in vitro
• cDNA développés en 1997
• Réplicons subgénomiques (1999)
• Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003)
• Système de culture permettant le production
de particules virales infectieuses (HCVcc)
(2005)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Les Modèles Animaux
Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
III. ORGANISATIONS
STRUCTURALE & GENOMIQUE
Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
Densité des Particules Circulantes
Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
The “Lipidome“ of HCVcc Particles
Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32.
LPC: lysophosphotidylserine
CE: cholestery ester
Chol: cholesterol
PI: phosphatidylinositol
PS: phosphatidylserine
PE: phosphatidylethanolamine
SM: shingomyelin
PC: phospahtidylcholine
PG: phosphatidylglycerol
Total lipid profile Phospholipid profile
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Organisation Structurale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
• Infection chronique VHC généralement
associée à une hypocholestérolémie et
hypo ou hyper TG
– 700 VHC-pos (75% de patients ARN détectable)
inclus parmi plus de 11 000 individus
– 74 patients VHC-pos inclus parmi les 130
patients ayant une hépatopathie
Serum Lipid Profile in Patients with HCV
Infection
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Dai et al., J Hepatol 2008;49(1):9-16; Van Thiel et al., Dig Dis Sci 2014;59(4):881-5.
Organisation Génomique des
Flaviviridae
Hépatite C : Virus et Marqueurs
0 1800 3600 5400 7200 9000 10800
C
4A
p7
NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E1
5’UTR 3’UTR
Hepatitis C virus
Npro
C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B
4A
p7
5’UTR 3’UTR
Pestivirus
C
prM
E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap
5’UTR 3’UTR
Yellow fever virus
Organisation Génomique
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Li et al., Nat Rev Microbiol 2015;13(9):544-58.
Structure de l’IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
“Pseudoknot domain“
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
Crystal Structure of the Full HCV IRES
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
MicroRNA (miR)-122 et Infection VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Expression abondante et spécifique du
foie
• Interaction avec la région 5’NC du génome
viral
– 2 sites au niveau du domaine I
• Favorise la stabilité de l’ARNm viral
miR-122 : Cible Thérapeutique ?
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.
Efficacité Antivirale du Miravirsen
Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Pros & Cons des Antagonistes de miR-122
• Activité pangénotypique
• Barrière à la résistance élevée (HTA)
• Administration parentérale
• Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a
été associé au développement d’HCC
Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122
• Bonne tolérance après administration sous-cutanée
de doses allant de 0,5 mg/kg à 8 mg/kg chez 40
volontaires sains
• Absence d’interactions avec les DAAs (simeprevir)
• Activité antivirale in vivo (n=32 G1,3 et 4 non-
cirrhotiques)
– 1 injection (2 doses : 2 et 4 mg/kg)
– Diminution moyenne de l’ARN VHC à S4 : -4,4 Log UI/mL
– 7 patients avec ARN <LLOQ après 20 semaines de FU
van der Ree et al., EASL 2015.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Activité antivirale in vivo
– 6 patients conservaient un ARN indétectable à S28 (1 G1, 2
G3, 3 G4)
van der Ree et al., AASLD 2015, Abstract 208.
RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122
Hépatite C : Virus et Marqueurs
IV. LES DIFFÉRENTES
PROTÉINES VIRALES
Protéines du VHC
Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496.
Assembly module Replication module
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine de Capside
• Forme mature formée de ~177 amino
acides (21-kDa)
• Capacité de lier les lipides et l’ARN
• Structure tridimensionnelle non résolue
– Conformation en hélices alpha (~ 50%)
– Constituée de 2 domaines (D1 & D2)
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine de Capside
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365.
Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction
avec LD
Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27.
VHC G1b
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“
Structure de E2
Purple and red: Ig ß sandwich
Blue: CD81 receptor binding loop
Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Glycoprotéine E2
Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4.
• Protéine de fusion classe II
– Hétérodimères avec E1
• Interaction avec récepteurs membranaires
– CD81
– SRB-I
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Étape Précoce : Entrée du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.
E2 : Trois Domaines Variables
• E2 contient 3 domaines très variables
– HVR1
– VR2
– VR3
• Délétion HVR1 est non létale mais
augmente la sensibilité du virus aux
anticorps neutralisants
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Variabilité du VHC
Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Transmission du VHC
Hépatite C : Virus et Marqueurs
6a_33
2b_JFH1
Patient 1 (7/04)
5a_SA13
1b_HVR3812
S5 (7/05)
Patient 3 (7/05)
Patient 3 (9/05)
Patient 2 (7/04)
Patient 2 (9/04)
Patient 3 (7/04)
S4 (6/05)
S3 (6/05)
S2 (6/05)
Patient 3 (01/05)
S1 (6/05)
1a_HCT27X5
2a_Q2B
3a_CB
1a_HCT18X5
Patient 6
1b_AWV2C33
Patient 8
Patient 4
Patient 7
4a_ED43
0.2
100
Surfaces inertes
Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633.
Patients VHC chroniques
Séroconversion VHC
Analyse Phylogénique
Région HVR1 (81 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine p7
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• Viroporine dont la
structure 3D a été
récemment déterminée
par ME
• Rôle(s) in vivo ?
• Cible thérapeutique
potentielle
Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.
Activité Antivirale du BIT225
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV
• Activité synergique
Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.
Activité Antivirale in vivo
• Phase II
- Patients VHC (G1a, G1b, G3)
- Patients VIH (inhibiteur de Vpu)
- Patients coinfectés
• Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de
traitement
- 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4
semaines suivi de la bithérapie pendant 44
semaines
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Taux de Réponses Virologiques
• Futurs développements
– Génotypes 1 & 3
– 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV
– Evaluation de l’efficacité en association à d’autres
DAA
Treatment EVR (%) SVR % (n/N)
200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88
400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7)
pegIFN/RBV 63 75 (6/8)
Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine NS2
Hépatite C : Virus et Marqueurs
• NS2 (région N-ter)
– Rôle dans
l’organisation de la
formation des
nucléocapsides
• NS2pro
(région C-ter)
Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.
Protéine NS3-4A
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
Inhibition de la Production d’IFN par NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.
Cibles des Antiprotéases
Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Saalau-Bethell et al. Nat Chem Biol 2012;8(11):920-5.
Mécanisme d’Action des Antiprotéases
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Raney et al., J Biol Chem 2010; 285(30): 22725-731.
Interaction du Telaprevir avec NS3
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Antiprotéases (anti-NS3/4A)
1ère
génération
1ère
vague
1ère
génération
2ème
vague
2ème
génération
Telaprevir Simeprevir Grazoprevir (MK-5172)
Boceprevir Paritaprevir/r ACH-2684
Asunaprevir
Vedroprevir
Vaniprevir
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype (sauf G3)
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype (~)
Forte barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Protéine NS5A
RNA binding
groove
Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
NS5A est une Phosphoprotéine
• Existence de 2 formes
– p56
– p58 (forme hyperphosphorylée)
• Phosphorylations assurées par CKI-α*
au niveau de résidus sérine et thréonine
– PI4KIIIα régule le niveau de phosphorylation
*Casein Kinase I-α
Masaki et al., J Virol 2014;88(13):7541-55; Reiss et al., PLoS Pathog 2013;9(5):e1003359.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
NS5A is “a Scaffold“ for other Viral
Proteins
Janardhan and Reau., Hepat Med 2015;7:11-20.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
NS5A dans le Cycle Viral
• Nombreuses interactions protéiques
– Core, NS4B et NS5B du VHC
– Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et
PI4KIIIα*
*phosphatidylinositol-4 kinase III alpha
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Recrutement et Activation d’une
Phosphatidylinositol Kinase (PI4KIIIα)
Reiss et al., Cell Host Microbe 2011;9(1):32-45.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
NS5A dans le Cycle Viral
• Nombreuses interactions protéiques
– Core, NS4B et NS5B
– Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et
PI4KIIIα
• Essentielle pour la réplication et
l’assemblage des nouvelles particules
virales
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Réplication versus Assemblage
p56 p58
CKI-α, PI4KIIIα
Chatterji et al., Antimicrob Agents Chemother 2015;59(5):2496-507.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Cibles des anti-NS5A
Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Activité Antivirale du Daclatasvir
Assay EC50
HCV replicon genotype 1a, H77 50±13 pM
HCV replicon genotype 1b, Con1 9±4 pM
HCV replicon genotype 2a, JFH1 71±17 pM
HCV replicon genotype 3a 146±34 pM
HCV replicon genotype 4a 12±4 pM
HCV replicon genotype 5a 33±10 pM
Infectious HCV, genotype 2a, JFH1 28±24 pM
Cytotoxicity Huh7 cells 17±1 µM
Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Efficacité Antivirale du BMS-790052 après
Administration d’une Seule Dose per os
Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100.
-1.8 Log
-3.2 Log
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Interaction NS5A/anti-NS5A
Nettles et al., J Med Chem 2014;57(23):10031-43.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Inhibiteurs anti-NS5A
1ère
génération 2ème
génération
Daclatasvir Elbasvir ABT-530
Ledipasvir Velpatasvir ACH-3102
Ombitasvir
Activité G1 & G4
Autres génotypes variables
Faible barrière à la résistance
Activité pangénotype
Plus forte barrière à la
résistance (/1ère
))
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Modes d’Action des anti-NS5A
Eyre NS and Beard MR., Gastroenterology 2014;147(5):959-62.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Les anti-NS5A Bloquent la Formation de
novo des “Membranous Web“
Berger et al., Gastroenterology 2014;147(5):1094-105.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Les anti-NS5A Bloquent le Recrutement
de la PI4KIIIα
Reghellin et al., Antimicrob Agents Chemother 2014;58(12):7128-40.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999,
7: 1417-1426.
Protéine NS5B : RdRp
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Réplication
– Modèle du poliovirus
. Virus à ARN
monocaténaire de
polarité positive
De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18.
Réplication Virale
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Variabilité Génétique
• Erreurs au cours de la réplication
– Fréquentes
. 10
-4
-10
-5
mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC
– Spontanées
– Au hasard
• Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’
("proofreading")
– Accumulation de mutations
• A l’origine de :
– La diversification des types et des sous-types
– La distribution en quasi-espèces
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Diversification des Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
4
1
5a
3
2
6
7a
Distribution des Génotypes
Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610.
Hépatite C : Virus et Structure
Répartition des Génotypes en France
61%
9%
19%
9%
2%
Génotype 1 (n=961)
Génotype 5 (n=29)
Génotype 4 (n=144)
Génotype 2 (n=137)
Génotype 3 (n=293)
Génotypes6 (n=10)
0,6%
Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390).
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Distribution en Quasi-espèce
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.
Cibles des anti-NS5B
Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA
Site A (Thumb/fingertips)
Site B (Thumb)
Site C (Palm)
Site Actif
Site D (Palm)
AA
BB
CC
DD
EE
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Inhibiteurs Nucléos(t)idiques de la RdRp
Site actif
AA
BB
CC
DD
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Nucleotide Analogues Act as a Chain
Terminator
SOF
3’
AG C
C GA CGGG
C
5’
Template strand
Primer strand
U
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Blocage de l’élongation
de la chaîne d’ARN
C
Inhibiteurs Nucleos(t)idiques de la RdRp
Analogues
nucléotidiques
Sofosbuvir
MK-3682
ACH-3422
AL-335
Activité pangénotype
Forte barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Efficacité Antivirale du SOF
D8: -4.65 Log HCV RNA (median)
5/8 (63%) : RNA <15 IU/mL Lawitz et al., J Viral Hepat 2013;20(10):699-707.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Inhibiteurs non-Nucléosiques de la RdRp
Site A (Thumb I)
Site B (Thumb II)
Site C (Palm I)
Site D (Palm II)
AA
BB
CC
DD
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Inhibiteurs non-Nucléosidiques de la RdRp
Site A Site B Site C
Beclabuvir GS-9669 Dasabuvir
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Spectre étroit (G1)
Faible barrière à la résistance
Hépatite C : Virus et Marqueurs
V. CYCLE VIRAL
Cycle Viral
deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
HCV Entry
Réplication du VHC
• Mécanismes moléculaires encore mal
connus
• Localisation cytoplasmique au sein de
complexes de réplication (membranous
web)
– NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp)
– Association étroite avec des facteurs cellulaires
Hépatite C : Virus et Marqueurs
"Membranous Web"
Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Modèle de Réplication du VHC
• Selon modèle des virus à ARN ss polarité
positive (exemple du PV)
Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Assemblage & Sécrétion du VHC
Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700.
Hépatite C : Virus et Marqueurs
Hépatite C
Stratégie Diagnostique & Suivi
Virologique
Stéphane Chevaliez
Centre National de Référence
des Hépatites Virales B, C et delta
Laboratoire de Virologie & INSERM U955
Hôpital Henri Mondor
Université Paris-Est
Créteil
Marqueurs indirects
Anticorps anti-VHC totaux
Marqueurs directs
Ag de capside (AgC)
ARN VHC
Génotype VHC
Profil de résistance
Marqueurs Virologiques
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Sérologiques
• Détection des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème
génération
• Tests “Combo”
– Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC
• TROD (test rapide d’orientation diagnostique)
• Détection et quantification de l’antigène de capside
(AgC)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection des Anticorps anti-VHC
• The first-line diagnostic test for HCV
infection
• Large number of commercially available
assays
– Specificity: ≥99.5%
– Sensitivity: ~100%
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection des Anticorps anti-VHC
• Trousses commerciales
• Faciles à utiliser, automatisées
• A l’aide d’un test de 3ème
génération
­ ADVIA Centaur (Siemens)
­ VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic)
­ AXSYM HCV 3.0 (Abbott)
­ Cobas Elecsys Modular HCV (Roche)
­ INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics)
­ Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détection des Anticorps anti-VHC
• The first-line diagnostic test for HCV
infection
• Large number of commercially available
assays
– Specificity: ≥99.5%
– Sensitivity: ~100%
– Low predictive values in populations with a low
HCV prevalence (<10%)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Importance of the Signal-to-Cutoff Ratios
for EIA Assays
Screening Test Manufacturer Signal-to-cutoff ratio predictive of
a true positive ≥95%
Ortho HCV 3.0 ELISA test Ortho ≥3.8
Abbott HCV EIA 2.0 Abbott ≥3.8
VITROS anti-HCV Ortho ≥8.0
AxSYM anti-HCV Abbott ≥10.0
Architect anti-HCV Abbott ≥5.0
Advia Centaur HCV Bayer ≥11.0
Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting, CDC; http://www.cdc.gov/hepatitis/hcv/labtesting.htm
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC)
• Diagnostic de l’infection par le VHC
– Trousses commerciales (2 trousses disponibles)
– Faciles à utiliser
– Non automatisées
– Diminution de la fenêtre sérologique d’environ
20-30 jours
– Moins sensibles que les tests de 3ème
génération
pour la détection des anticorps anti-VHC
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD
ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC
Oraquick
®
HCV
Toyo®
HCV
Labmen®
HCV
Multisure
HCV
Signal
HCV v2.0
HCV
TriDot 4th
Manufacturer Orasure Turklab Turklab
MP
Diagnostics
Span
Diagnostics
J Mitra & Co
Specimen
type
oral fluid,
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
whole
blood,
serum,
plasma
serum,
plasma
serum,
plasma
Volume
required (µL)
40 (oral
fluid)
20
30 10 25 100
One drop
(35 µL)
Time to read
(min)
20 15 15 15 10 3
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“
pour la Détection des Ab anti-VHC
Assure®
HCV
First Response®
HCV
Manufacturer MP Diagnostics
Premier Medical
Corporation Ltd
Specimen type
whole blood,
serum, plasma
whole blood,
serum, plasma
Volume required
(µL)
50 One drop (35 µL)
Time to read (min) 15 20
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Performance of RDT
Capillary Whole Blood
Tests Specificity Sensitivity
OraQuick®
HCV Rapid Ab Test 100% 99.4%
TOYO®
anti-HCV test 98.8% 95.8%
Labmen®
HCV test 100% 63.1%
Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press.
• 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients
with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative
subjects
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Specificity Sensitivity
OraQuick®
HCV Rapid Ab Test 100% 97.6%
• 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients
with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative
subjects
Performance of RDT
Crevicular Fluid
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press.
Performance of RDT
Meta-analysis
• More than 13,000 individuals included in 18 studies
between 1994 and 2011
– Stratification according to matrix specimens
. Whole blood (venous and capillary): 4,259 specimens
. Saliva: 3,994 specimens
Specimen Specificity Sensitivity
Whole blood 99.5% 98.9%
Saliva 98.2% 97.1%
Shivkumar et al., Ann Intern Med 2012;157(8):558-66.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside : un Marqueur
de la Réplication
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.89;p<0.0001
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL)
HCVcoreAglevel(Logfmol/L)
r=0.88;p<0.0001
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Antigène de Capside en Fonction des
Génotypes
Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Interests of HCV Core Ag Quantification
• A surrogate marker of HCV replication
• New tool for the monitoring of virologic
response during IFN-free DAA regimens
• Many advantages over the molecular
methods
– Cheaper (30-50% less expensive than molecular
method)
– Stability of marker at RT for 96 hours
– Short time to result
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests Moléculaires
Détermination
du Génotype
Quel est le génotype du VHC ?
Détection de la résistanceDétection de la résistance
Quel type de VHC est présent ?
Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ?
Tests Qualitatifs-Quantitatifs
Stratégie diagnostique & suivi virologique
- Identify active viral replication
- Make appropriate decisions
. Shorten or extend treatment duration
. Stop treatment due to futility
­ Identify treatment failure and the emergence
of resistance
. Virological failure is associated with selection of viral
variants with reduced susceptibility to DAAs
Clinical Utility of HCV RNA Assays
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Requirements for HCV RNA Assays
• Real-time-based assays with
– A low lower limit of detection
– A broader range of linear quantification
– Identical lower limits of detection (LLOD) and
quantification (LLOQ)
• Satisfactory analytical performance, regardless
of the HCV genotype
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Range of Linear Quantification
Stratégie diagnostique & suivi virologique
10 102
103
104
107
108
Cobas Amplicor
HCV Monitor v2.0
SuperQuant
LCx HCV RNA
Assay
Versant HCV RNA
3.0 (bDNA)
CTM HCV test v2.0CTM HCV test v2.0
(Roche)(Roche)
RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV
(Abbott)(Abbott)
Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ
(Qiagen)(Qiagen)
CAP/CTM HCV test,CAP/CTM HCV test,
v2.0 (Roche)v2.0 (Roche)
105
106
Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.
Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0)
Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31.
HCVRNAlevelinCAP/CTMv1.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.15
+0.48
+1.11
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=27)
Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30)
Genotype 6 (n=2)
Genotype 5 (n=9)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Impact de Substitutions Nucléotidiques
sur la Quantification de l’ARN du VHC
Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681.
WT G4 or WT G1
A165T or G145A
G145A+A165T
HCVRNAlevels(Log10IU/mL)
5.7
6.1
6.4
4.0
6.0
6.7
4.3
5.9
6.3
<1.2
6.0
6.6
0
2
4
6
8
CTM v1.0 m2000RT bDNA
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Quantification de l’ARN VHC G4
(CAP/CTM v2.0)
HCVRNAlevelinCAP/CTMv2.0(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543 876543
Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and
bDNA (Log10IU/mL)
Differencebetween
CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
+0.08
+0.35
+0.62
Genotype 4 (n=122)
Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32.
HCV RNA Quantification
(m2000, Abbott)
Genotype 3 (n=29)
Genotype 2 (n=21)
Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24)
Genotype 6 (n=3)
Genotype 5 (n=9)
876543
Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA
(Log10IU/mL)
Differencebetween
m2000andbDNA(Log10IUI/mL)
+1.5
+1.0
+0.5
0.0
-0.5
-1.5
-1.0
-0.06
+0.26
+0.58
HCVRNAlevelinm2000(Log10IU/mL)
HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA
(Log10 IU/mL)
8
7
6
5
4
3
876543
Stratégie diagnostique & suivi virologique
HCV RNA Quantification
(GenXpert)
0 2 4 6 8
0
2
4
6
8
HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL)
HCVRNAlevelXpert(LogIU/mL)
Genotypes1 to4 (n=46)
r=0.99;p<0.0001
0
-1.5
-0.5
0.5
1.5
Meanof HC
DifferencebetweenXperytHCVandm2000
(Log₁₀IU/mL)
Unpublished data.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA
• HCV RNA quantification should be regularly assessed
before, during and after treatment
• HCV RNA quantification should be based on a real-
time PCR (or TMA) assay
– With results expressed in IU/mL
– With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL
• In a given patient, HCV RNA level monitoring must
be performed with the same real-time assay
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Europe or FDA Approval for HCV RNA
Quantification Tests
• 2 tests are approved by the FDA and in Europe
for HCV RNA quantification in clinical practice
– m2000 since May 2011
– New version of CAP/CTM since March 2013
• 1 test is approved only in Europe for HCV RNA
quantification in clinical practice
- Xpert HCV viral load since May 2015
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Génotypes
Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27.
4
1
5a
3
2
6
7a
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin
Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15.
• Méthodes moléculaires (genotyping)
– Analyse de la séquence après séquençage direct
– Hybridation inverse des produits d’amplification sur des
supports solides comportant des sondes génotype
spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV,
Innogenetics)
– PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes
génotype spécifique
• Méthodes sérologiques (“serotyping”)
– ELISA compétitif
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Détermination du Génotype
Analyse Phylogénique après Séquençage
Direct
Région NS5B(286 nt)
CLUSTALX
DNADist (PHYLIP 3.5)
Matrice de distance: Kimura 2-
parameter (Ts/Tv=2)
Neighbor-Joining
Bootstraping : 1000 replicates
NJPlot
5aSA13
2aHCJ6
Patient 49
6aEUHK2 3aNLZ1
Patient 62
4aED43
1hFrSSD98
1h98CM1357
1h98CM1521
1cHCG9
1cSR031
1cKhaja1
1aHCV1
1aHCVH
1aHCJ1
1jQC2
1jQC89
1kQC68
1kQC82
1eM4541N
1eCAM1078
1eQC172
1g1382
1g2152
1gEG024
1lM5186N
1l98CM1427
1l98CM1457
1fFR2
Patient 59
Patient 46
Patient 54
Patient 2
Patient 28
Patient 64
Patient 16
Patient 36
Patient 18
Patient 17
Patient 8
Patient 7
1bHCJ4
1bHCVBK
1bHCP01
Patient 40
1iFR16
1iQC77
1iQC181
Patient 48
Patient 60
Patient 52
Patient 26
1dFR17
1dHC1N16
1dBA107
1mGUI17
1mGUI11
1mGUI24
0.05
59
99
96
34
100
72
100
98
43
Génotype 2
Génotype 4
Génotype 3
Génotype 1
Génotype 6
Génotype 2
Génotype 5
Génotype 1, sous-type b
Génotype 3, sous-type a
Génotype 1, sous-type i
Génotype 1, sous-type ?
100
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Versant®
HCV Genotype 2.0 Assay
(INNO-LiPA)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Résumé
• Détermination du génotype (sous-type)
VHC
– La détermination du génotype sur la seule
région 5’NC doit être proscrite
– La 2nde
génération de Line Probe Assay qui utilise
des sondes dirigées contre la région core en
plus de la région 5’NC est la meilleure méthode
permettant de distinguer les sous-types 1a et
1b
EASL CPG., J Hepatol 2015; 63:199-236.
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Aucune trousse commerciale disponible
• Uniquement des techniques de séquençage direct
“maison“ de la protease NS3, du domaine I de la
NS5A et de la NS5B
• Méthodes de séquençage ultra-sensible en
développement (NGS)
–Sentosa SQ HCV Genotyping Assay (VELA Diagnostics)
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Méthodes commerciales disponibles pour les trois
régions ciblées par les DAA
– ARN du VHC ≥2000 UI/mL requis
– Basée sur technique NGS (cut-off 10%)
– G1a or 1b
Stratégie diagnostique & suivi virologique
Tests de Résistance Disponibles en Europe
• Test de résistance systématique en pré-traitement
chez des patients naïfs ou en échec de bithérapie ?
­ Taux de RVS élevés
– Impact des RAV NS5A sur la réponse au traitement
chez les patients cirrhotiques en échec
• Test de résistance en cas d’échec du traitement ?
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• Test de résistance pour le retraitement ?
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Chevaliez marqueurs hcv du16

  • 1. Hépatite C Virus & Marqueurs Stéphane Chevaliez Centre National de Référence des Hépatites Virales B, C et delta Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Hôpital Henri Mondor Université Paris-Est Créteil
  • 2. Découverte du Virus de l’Hépatite C From New England Journal of Medicine, 1975 Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 3. Identification du Virus de l’Hépatite C From Science 21 April 1989 Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 4. The Global Burden of HCV Infection • Approximately 130-170 million people are chronically infected with HCV • HCV is responsible for >350,000 deaths per year worldwide • Up to 85% of HCV-infected patients are unaware of their status • Less than 10% of the HCV-infected population has received treatment in the US Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 5. Hépatite C : Virus et Marqueurs RateofSVR(%) 0 20 40 60 80 100 IFNα + RBV 48 weeks IFNα 48 weeks 10% Peg-IFNα + RBV + PI 24-48 weeks Peg-IFNα +RBV 48 weeks All-oral IFN-free 12 weeks 30% 45% 70% Peg-IFNα + RBV + NA 12 weeks 89% 95% Pawlotsky et al., J Hepatol 2015; 62:S87-S99. Rates of SVR according to Treatment Regimens (G1)
  • 6. Plan Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 8. Virus de l’Hépatite C • Famille : Flaviviridae • Genre : Hepacivirus Phylogénie de la région codant la protéine NS5B Hépatite C : Virus et Marqueurs Phylogénie bayésienne de la région codant la protéine NS5B Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438.
  • 9. • Famille : Flaviviridae • Genre : Hepacivirus • Hôte naturel : Homme • Tropisme : Foie Virus de l’Hépatite C Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 10. Identification d’Homologues du VHC chez les Non Primates Kapoor et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2011;108(28):11608-13; Kapoor et al., Mbio 2013;4(2):e00216-13. Phylogénie de la région codant RdRp (7711-8550 HCV g1a) CHV: canine hepacivirus RHV: rodent hepacivirus Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 11. Identification d’Homologues du VHC chez les Non Primates Equine hepacivirus in Blue Rodent hepacivirus in Red Hépatite C : Virus et Marqueurs Drexler et al., PLoS Pathog. 2013;9(6):e1003438. Phylogénie de la région NS3 (3192-4889 HCV g1a)
  • 13. Les Différents Modèles d’Etude in vitro • cDNA développés en 1997 • Réplicons subgénomiques (1999) • Pseudoparticules rétrovirales (HCVpp) (2003) • Système de culture permettant le production de particules virales infectieuses (HCVcc) (2005) Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 14. Les Modèles Animaux Tawar et al., Cell Res. 2014;24(10):1153-4. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 16. Organisation Structurale Hépatite C : Virus et Marqueurs Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
  • 17. Densité des Particules Circulantes Lindenbach BD. Curr Top Microbiol Immunol 2013;369:199-218. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 18. The “Lipidome“ of HCVcc Particles Merz et al., J Biol Chem 2011;286(4):3018-32. LPC: lysophosphotidylserine CE: cholestery ester Chol: cholesterol PI: phosphatidylinositol PS: phosphatidylserine PE: phosphatidylethanolamine SM: shingomyelin PC: phospahtidylcholine PG: phosphatidylglycerol Total lipid profile Phospholipid profile Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 19. Organisation Structurale Hépatite C : Virus et Marqueurs Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700; Catanese et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013;110(23):9505-10.
  • 20. • Infection chronique VHC généralement associée à une hypocholestérolémie et hypo ou hyper TG – 700 VHC-pos (75% de patients ARN détectable) inclus parmi plus de 11 000 individus – 74 patients VHC-pos inclus parmi les 130 patients ayant une hépatopathie Serum Lipid Profile in Patients with HCV Infection Hépatite C : Virus et Marqueurs Dai et al., J Hepatol 2008;49(1):9-16; Van Thiel et al., Dig Dis Sci 2014;59(4):881-5.
  • 21. Organisation Génomique des Flaviviridae Hépatite C : Virus et Marqueurs 0 1800 3600 5400 7200 9000 10800 C 4A p7 NS5BNS5ANS4BNS3NS2E2E1 5’UTR 3’UTR Hepatitis C virus Npro C E1 E2E0 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 4A p7 5’UTR 3’UTR Pestivirus C prM E NS1 2A 2B NS3 NS5NS4A 4BCap 5’UTR 3’UTR Yellow fever virus
  • 22. Organisation Génomique Hépatite C : Virus et Marqueurs Li et al., Nat Rev Microbiol 2015;13(9):544-58.
  • 23. Structure de l’IRES Hépatite C : Virus et Marqueurs “Pseudoknot domain“ Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
  • 24. Crystal Structure of the Full HCV IRES Hépatite C : Virus et Marqueurs Berry et al., Structure 2011;19(10):1456-66.
  • 25. MicroRNA (miR)-122 et Infection VHC Hépatite C : Virus et Marqueurs • Expression abondante et spécifique du foie • Interaction avec la région 5’NC du génome viral – 2 sites au niveau du domaine I • Favorise la stabilité de l’ARNm viral
  • 26. miR-122 : Cible Thérapeutique ? Hépatite C : Virus et Marqueurs Janssen et al., N Engl J Med. 2013;368(18):1685-94.
  • 27. Efficacité Antivirale du Miravirsen Janssen et al., N Engl J Med 2013;368(18):1685-94. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 28. Pros & Cons des Antagonistes de miR-122 • Activité pangénotypique • Barrière à la résistance élevée (HTA) • Administration parentérale • Faible taux de miR-122 dans les hépatocytes a été associé au développement d’HCC Tsai et al., J Clin Invest 2012;122(8):2884-97; Wilson et al., Curr Opin Virol 2014;7C:11-18. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 29. RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122 • Bonne tolérance après administration sous-cutanée de doses allant de 0,5 mg/kg à 8 mg/kg chez 40 volontaires sains • Absence d’interactions avec les DAAs (simeprevir) • Activité antivirale in vivo (n=32 G1,3 et 4 non- cirrhotiques) – 1 injection (2 doses : 2 et 4 mg/kg) – Diminution moyenne de l’ARN VHC à S4 : -4,4 Log UI/mL – 7 patients avec ARN <LLOQ après 20 semaines de FU van der Ree et al., EASL 2015. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 30. • Activité antivirale in vivo – 6 patients conservaient un ARN indétectable à S28 (1 G1, 2 G3, 3 G4) van der Ree et al., AASLD 2015, Abstract 208. RG-101 : Oligonucléotide anti-miR-122 Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 32. Protéines du VHC Bartenschlager et al., Nature Reviews Microbiology 2013; 11, 482–496. Assembly module Replication module Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 33. Protéine de Capside • Forme mature formée de ~177 amino acides (21-kDa) • Capacité de lier les lipides et l’ARN • Structure tridimensionnelle non résolue – Conformation en hélices alpha (~ 50%) – Constituée de 2 domaines (D1 & D2) Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 34. Protéine de Capside Hépatite C : Virus et Marqueurs Boulant et al, J Virol 2005, 79(17): 11353-11365. Domaine d’interaction avec l’ARN viral Domaine d’interaction avec LD
  • 35. Piodi et al., Hepatology 2008, 48(1): 16-27. VHC G1b
  • 36. Glycoprotéine E2 Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4. • Protéine de fusion classe II – Hétérodimères avec E1 Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 37. Kong et al,Science. 2013 Nov 29;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4. Hépatite C : Virus et Marqueurs Topologie de la Protéine E2 : Domaine “Ig-like“
  • 38. Structure de E2 Purple and red: Ig ß sandwich Blue: CD81 receptor binding loop Kong et al,Science 2013;342(6162):1090-4; Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 39. Glycoprotéine E2 Khan et al., Nature 2014;509(7500):381-4. • Protéine de fusion classe II – Hétérodimères avec E1 • Interaction avec récepteurs membranaires – CD81 – SRB-I Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 40. Étape Précoce : Entrée du VHC Hépatite C : Virus et Marqueurs Lindenbach BD, Rice CM. Nat Rev Microbiol 2013;11:688-700.
  • 41. E2 : Trois Domaines Variables • E2 contient 3 domaines très variables – HVR1 – VR2 – VR3 • Délétion HVR1 est non létale mais augmente la sensibilité du virus aux anticorps neutralisants Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 42. Variabilité du VHC Magiorkinis et al., PLoS Med. 2009;6(12):e1000198. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 43. Transmission du VHC Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 44. 6a_33 2b_JFH1 Patient 1 (7/04) 5a_SA13 1b_HVR3812 S5 (7/05) Patient 3 (7/05) Patient 3 (9/05) Patient 2 (7/04) Patient 2 (9/04) Patient 3 (7/04) S4 (6/05) S3 (6/05) S2 (6/05) Patient 3 (01/05) S1 (6/05) 1a_HCT27X5 2a_Q2B 3a_CB 1a_HCT18X5 Patient 6 1b_AWV2C33 Patient 8 Patient 4 Patient 7 4a_ED43 0.2 100 Surfaces inertes Girou et al., Clin Infect Disease 2008, 47(5): 627-633. Patients VHC chroniques Séroconversion VHC Analyse Phylogénique Région HVR1 (81 nt) CLUSTALX DNADist (PHYLIP 3.5) Matrice de distance: Kimura 2-parameter (Ts/Tv=2) Neighbor-Joining Bootstraping : 1000 replicates NJPlot Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 45. Protéine p7 Hépatite C : Virus et Marqueurs • Viroporine dont la structure 3D a été récemment déterminée par ME • Rôle(s) in vivo ? • Cible thérapeutique potentielle Luik et al., Proc Natl Acad Sci 2009, 4;106(31): 12712-6; Griffin S, Proc Natl Acad Sci 2009, 106(31): 12567-68.
  • 46. Activité Antivirale du BIT225 Hépatite C : Virus et Marqueurs • IC50 de 314 nM dans le modèle du BVDV • Activité synergique Luscombe et al., Antiviral Res 2010;86(2):144-53.
  • 47. Activité Antivirale in vivo • Phase II - Patients VHC (G1a, G1b, G3) - Patients VIH (inhibiteur de Vpu) - Patients coinfectés • Activité antivirale chez les patients G1 naïfs de traitement - 200 à 400 mg en combinaison avec SOC pendant 4 semaines suivi de la bithérapie pendant 44 semaines Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 48. Taux de Réponses Virologiques • Futurs développements – Génotypes 1 & 3 – 3 mois de traitement en association à pegIFN/RBV – Evaluation de l’efficacité en association à d’autres DAA Treatment EVR (%) SVR % (n/N) 200 mg BIT225+ pegIFN/RBV 88 88 400 mg BIT225+ pegIFN/RBV 86 100 (7/7) pegIFN/RBV 63 75 (6/8) Tanwandee et al., AASLD 2012 LB abstract. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 49. Protéine NS2 Hépatite C : Virus et Marqueurs • NS2 (région N-ter) – Rôle dans l’organisation de la formation des nucléocapsides • NS2pro (région C-ter) Jirasko et al., PLoS pathog 2010;6(12): e1001233; Ivo et al., Nature 2006, 442: 831-835.
  • 50. Protéine NS3-4A Hépatite C : Virus et Marqueurs Raney et al., J Biol Chem 2010, 285(30): 22725-731.
  • 51. Inhibition de la Production d’IFN par NS3 Hépatite C : Virus et Marqueurs Rehermann B., J Clin Invest 2009;119(7):1745-54.
  • 52. Cibles des Antiprotéases Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 53. Saalau-Bethell et al. Nat Chem Biol 2012;8(11):920-5. Mécanisme d’Action des Antiprotéases Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 54. Raney et al., J Biol Chem 2010; 285(30): 22725-731. Interaction du Telaprevir avec NS3 Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 55. Antiprotéases (anti-NS3/4A) 1ère génération 1ère vague 1ère génération 2ème vague 2ème génération Telaprevir Simeprevir Grazoprevir (MK-5172) Boceprevir Paritaprevir/r ACH-2684 Asunaprevir Vedroprevir Vaniprevir Spectre étroit (G1) Faible barrière à la résistance Activité pangénotype (sauf G3) Faible barrière à la résistance Activité pangénotype (~) Forte barrière à la résistance Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 56. Protéine NS5A RNA binding groove Tellinghuisen et al., Nature 2005;435(7040):374-9. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 57. NS5A est une Phosphoprotéine • Existence de 2 formes – p56 – p58 (forme hyperphosphorylée) • Phosphorylations assurées par CKI-α* au niveau de résidus sérine et thréonine – PI4KIIIα régule le niveau de phosphorylation *Casein Kinase I-α Masaki et al., J Virol 2014;88(13):7541-55; Reiss et al., PLoS Pathog 2013;9(5):e1003359. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 58. NS5A is “a Scaffold“ for other Viral Proteins Janardhan and Reau., Hepat Med 2015;7:11-20. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 59. NS5A dans le Cycle Viral • Nombreuses interactions protéiques – Core, NS4B et NS5B du VHC – Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et PI4KIIIα* *phosphatidylinositol-4 kinase III alpha Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 60. Recrutement et Activation d’une Phosphatidylinositol Kinase (PI4KIIIα) Reiss et al., Cell Host Microbe 2011;9(1):32-45. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 61. NS5A dans le Cycle Viral • Nombreuses interactions protéiques – Core, NS4B et NS5B – Partenaires cellulaires (>100) dont CypA et PI4KIIIα • Essentielle pour la réplication et l’assemblage des nouvelles particules virales Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 62. Réplication versus Assemblage p56 p58 CKI-α, PI4KIIIα Chatterji et al., Antimicrob Agents Chemother 2015;59(5):2496-507. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 63. Cibles des anti-NS5A Lindenbach and Rice, Nature, 2005;436:933-938. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 64. Activité Antivirale du Daclatasvir Assay EC50 HCV replicon genotype 1a, H77 50±13 pM HCV replicon genotype 1b, Con1 9±4 pM HCV replicon genotype 2a, JFH1 71±17 pM HCV replicon genotype 3a 146±34 pM HCV replicon genotype 4a 12±4 pM HCV replicon genotype 5a 33±10 pM Infectious HCV, genotype 2a, JFH1 28±24 pM Cytotoxicity Huh7 cells 17±1 µM Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 65. Efficacité Antivirale du BMS-790052 après Administration d’une Seule Dose per os Gao et al., Nature 2010;465(7294):96-100. -1.8 Log -3.2 Log Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 66. Interaction NS5A/anti-NS5A Nettles et al., J Med Chem 2014;57(23):10031-43. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 67. Inhibiteurs anti-NS5A 1ère génération 2ème génération Daclatasvir Elbasvir ABT-530 Ledipasvir Velpatasvir ACH-3102 Ombitasvir Activité G1 & G4 Autres génotypes variables Faible barrière à la résistance Activité pangénotype Plus forte barrière à la résistance (/1ère )) Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 68. Modes d’Action des anti-NS5A Eyre NS and Beard MR., Gastroenterology 2014;147(5):959-62. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 69. Les anti-NS5A Bloquent la Formation de novo des “Membranous Web“ Berger et al., Gastroenterology 2014;147(5):1094-105. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 70. Les anti-NS5A Bloquent le Recrutement de la PI4KIIIα Reghellin et al., Antimicrob Agents Chemother 2014;58(12):7128-40. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 71. Lesburg et al., Nat struct Biol 1999, 6: 937-943; Bressanelli et al., Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 13034-13039; Ago et al., Srructure Fold Des 1999, 7: 1417-1426. Protéine NS5B : RdRp Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 72. Réplication – Modèle du poliovirus . Virus à ARN monocaténaire de polarité positive De Clercq., Nature Review Drug Discovery 2007; 6: 1001-18. Réplication Virale Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 73. Variabilité Génétique • Erreurs au cours de la réplication – Fréquentes . 10 -4 -10 -5 mutations par nucléotide copié au cours de la réplication du VHC – Spontanées – Au hasard • Absence d’activité exonucléasique 3’⇒5’ ("proofreading") – Accumulation de mutations • A l’origine de : – La diversification des types et des sous-types – La distribution en quasi-espèces Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 74. Diversification des Génotypes Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27. Hépatite C : Virus et Marqueurs 4 1 5a 3 2 6 7a
  • 75. Distribution des Génotypes Manns and von Hahn., Nat Rev Drug Discov 2013;12(8):595-610. Hépatite C : Virus et Structure
  • 76. Répartition des Génotypes en France 61% 9% 19% 9% 2% Génotype 1 (n=961) Génotype 5 (n=29) Génotype 4 (n=144) Génotype 2 (n=137) Génotype 3 (n=293) Génotypes6 (n=10) 0,6% Brouard et al., J Hepatol 2009, 50(Supl. 1): S148 (abstract 390). Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 77. Distribution en Quasi-espèce Hépatite C : Virus et Marqueurs Domingo E., Cell 1978, 13 (4):735-744.
  • 78. Cibles des anti-NS5B Copyright © 2006 Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey, USA Site A (Thumb/fingertips) Site B (Thumb) Site C (Palm) Site Actif Site D (Palm) AA BB CC DD EE Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 79. Inhibiteurs Nucléos(t)idiques de la RdRp Site actif AA BB CC DD Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 80. Nucleotide Analogues Act as a Chain Terminator SOF 3’ AG C C GA CGGG C 5’ Template strand Primer strand U Hépatite C : Virus et Marqueurs Blocage de l’élongation de la chaîne d’ARN C
  • 81. Inhibiteurs Nucleos(t)idiques de la RdRp Analogues nucléotidiques Sofosbuvir MK-3682 ACH-3422 AL-335 Activité pangénotype Forte barrière à la résistance Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 82. Efficacité Antivirale du SOF D8: -4.65 Log HCV RNA (median) 5/8 (63%) : RNA <15 IU/mL Lawitz et al., J Viral Hepat 2013;20(10):699-707. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 83. Inhibiteurs non-Nucléosiques de la RdRp Site A (Thumb I) Site B (Thumb II) Site C (Palm I) Site D (Palm II) AA BB CC DD Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 84. Inhibiteurs non-Nucléosidiques de la RdRp Site A Site B Site C Beclabuvir GS-9669 Dasabuvir Spectre étroit (G1) Faible barrière à la résistance Spectre étroit (G1) Faible barrière à la résistance Spectre étroit (G1) Faible barrière à la résistance Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 86. Cycle Viral deLemos & Chung., Trends Mol Med 2014;20(6):315-21. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 87. Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700. Hépatite C : Virus et Marqueurs HCV Entry
  • 88. Réplication du VHC • Mécanismes moléculaires encore mal connus • Localisation cytoplasmique au sein de complexes de réplication (membranous web) – NS4B, NS5A, NS34A et NS5B (RdRp) – Association étroite avec des facteurs cellulaires Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 89. "Membranous Web" Paul et al., J Virol 2013;87(19):10612-27. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 90. Modèle de Réplication du VHC • Selon modèle des virus à ARN ss polarité positive (exemple du PV) Ding., Nature Reviews Immunolog, 2010; 10: 632-644. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 91. Assemblage & Sécrétion du VHC Lindenbach & Rice. Nature Reviews Microbiology 2013;11, 688–700. Hépatite C : Virus et Marqueurs
  • 92.
  • 93. Hépatite C Stratégie Diagnostique & Suivi Virologique Stéphane Chevaliez Centre National de Référence des Hépatites Virales B, C et delta Laboratoire de Virologie & INSERM U955 Hôpital Henri Mondor Université Paris-Est Créteil
  • 94. Marqueurs indirects Anticorps anti-VHC totaux Marqueurs directs Ag de capside (AgC) ARN VHC Génotype VHC Profil de résistance Marqueurs Virologiques Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 95. Tests Sérologiques • Détection des anticorps anti-VHC par EIA de 3ème génération • Tests “Combo” – Détection simultanée de l’AgC et des anticorps anti-VHC • TROD (test rapide d’orientation diagnostique) • Détection et quantification de l’antigène de capside (AgC) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 96. Détection des Anticorps anti-VHC • The first-line diagnostic test for HCV infection • Large number of commercially available assays – Specificity: ≥99.5% – Sensitivity: ~100% Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 97. Détection des Anticorps anti-VHC • Trousses commerciales • Faciles à utiliser, automatisées • A l’aide d’un test de 3ème génération ­ ADVIA Centaur (Siemens) ­ VITROS ECi (Ortho-Clinical Diagnostic) ­ AXSYM HCV 3.0 (Abbott) ­ Cobas Elecsys Modular HCV (Roche) ­ INNOTEST HCV Ab IV (Innogenetics) ­ Monolisa anti-HCV Plus version 2 (Bio-Rad) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 98. Détection des Anticorps anti-VHC • The first-line diagnostic test for HCV infection • Large number of commercially available assays – Specificity: ≥99.5% – Sensitivity: ~100% – Low predictive values in populations with a low HCV prevalence (<10%) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 99. Importance of the Signal-to-Cutoff Ratios for EIA Assays Screening Test Manufacturer Signal-to-cutoff ratio predictive of a true positive ≥95% Ortho HCV 3.0 ELISA test Ortho ≥3.8 Abbott HCV EIA 2.0 Abbott ≥3.8 VITROS anti-HCV Ortho ≥8.0 AxSYM anti-HCV Abbott ≥10.0 Architect anti-HCV Abbott ≥5.0 Advia Centaur HCV Bayer ≥11.0 Guidelines for Laboratory Testing and Result Reporting, CDC; http://www.cdc.gov/hepatitis/hcv/labtesting.htm Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 100. Test “Combo“ (AgC/Anti-VHC) • Diagnostic de l’infection par le VHC – Trousses commerciales (2 trousses disponibles) – Faciles à utiliser – Non automatisées – Diminution de la fenêtre sérologique d’environ 20-30 jours – Moins sensibles que les tests de 3ème génération pour la détection des anticorps anti-VHC Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 101. Tests rapides Disposant d’un Marquage CE/IVD ou OMS pour la Détection des Ab anti-VHC Oraquick ® HCV Toyo® HCV Labmen® HCV Multisure HCV Signal HCV v2.0 HCV TriDot 4th Manufacturer Orasure Turklab Turklab MP Diagnostics Span Diagnostics J Mitra & Co Specimen type oral fluid, whole blood, serum, plasma whole blood, serum, plasma whole blood, serum, plasma whole blood, serum, plasma serum, plasma serum, plasma Volume required (µL) 40 (oral fluid) 20 30 10 25 100 One drop (35 µL) Time to read (min) 20 15 15 15 10 3 Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 102. Tests rapides “en cours de Marquage CE/IVD“ pour la Détection des Ab anti-VHC Assure® HCV First Response® HCV Manufacturer MP Diagnostics Premier Medical Corporation Ltd Specimen type whole blood, serum, plasma whole blood, serum, plasma Volume required (µL) 50 One drop (35 µL) Time to read (min) 15 20 Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 103. Performance of RDT Capillary Whole Blood Tests Specificity Sensitivity OraQuick® HCV Rapid Ab Test 100% 99.4% TOYO® anti-HCV test 98.8% 95.8% Labmen® HCV test 100% 63.1% Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press. • 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative subjects Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 104. Tests Specificity Sensitivity OraQuick® HCV Rapid Ab Test 100% 97.6% • 318 patients with chronic HCV infection; 25 patients with resolved HCV infection; 170 HCV-seronegative subjects Performance of RDT Crevicular Fluid Stratégie diagnostique & suivi virologique Chevaliez et al., Clin Microbiol Infect. 2016, in press.
  • 105. Performance of RDT Meta-analysis • More than 13,000 individuals included in 18 studies between 1994 and 2011 – Stratification according to matrix specimens . Whole blood (venous and capillary): 4,259 specimens . Saliva: 3,994 specimens Specimen Specificity Sensitivity Whole blood 99.5% 98.9% Saliva 98.2% 97.1% Shivkumar et al., Ann Intern Med 2012;157(8):558-66. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 106. Antigène de Capside : un Marqueur de la Réplication 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL) HCVcoreAglevel(Logfmol/L) r=0.89;p<0.0001 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 HCV RNAlevel CAP/CTM v2.0 (LogIU/mL) HCVcoreAglevel(Logfmol/L) r=0.88;p<0.0001 Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 107. Antigène de Capside en Fonction des Génotypes Chevaliez et al., J Clin Virol. 2014;61(1):145-8. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 108. Interests of HCV Core Ag Quantification • A surrogate marker of HCV replication • New tool for the monitoring of virologic response during IFN-free DAA regimens • Many advantages over the molecular methods – Cheaper (30-50% less expensive than molecular method) – Stability of marker at RT for 96 hours – Short time to result Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 109. Tests Moléculaires Détermination du Génotype Quel est le génotype du VHC ? Détection de la résistanceDétection de la résistance Quel type de VHC est présent ? Est-ce que le VHC est présent et en quelle quantité ? Tests Qualitatifs-Quantitatifs Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 110. - Identify active viral replication - Make appropriate decisions . Shorten or extend treatment duration . Stop treatment due to futility ­ Identify treatment failure and the emergence of resistance . Virological failure is associated with selection of viral variants with reduced susceptibility to DAAs Clinical Utility of HCV RNA Assays Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 111. Requirements for HCV RNA Assays • Real-time-based assays with – A low lower limit of detection – A broader range of linear quantification – Identical lower limits of detection (LLOD) and quantification (LLOQ) • Satisfactory analytical performance, regardless of the HCV genotype Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 112. Range of Linear Quantification Stratégie diagnostique & suivi virologique 10 102 103 104 107 108 Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0 SuperQuant LCx HCV RNA Assay Versant HCV RNA 3.0 (bDNA) CTM HCV test v2.0CTM HCV test v2.0 (Roche)(Roche) RealTiRealTimme™ HCVe™ HCV (Abbott)(Abbott) Artus HCV QS-RGQArtus HCV QS-RGQ (Qiagen)(Qiagen) CAP/CTM HCV test,CAP/CTM HCV test, v2.0 (Roche)v2.0 (Roche) 105 106 Chevaliez et al., Gastroenterology 2012;142(6):1303-1313.
  • 113. Quantification de l’ARN VHC (CTM v1.0) Adapted from Chevaliez et al., Hepatology 2007;46(1): 22-31. HCVRNAlevelinCAP/CTMv1.0(Log10IU/mL) HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL) 8 7 6 5 4 3 876543 876543 Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL) Differencebetween CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL) +1.5 +1.0 +0.5 0.0 -0.5 -1.5 -1.0 -0.15 +0.48 +1.11 Genotype 3 (n=29) Genotype 2 (n=27) Genotype 1 (n=29) Genotype 4 (n=30) Genotype 6 (n=2) Genotype 5 (n=9) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 114. Impact de Substitutions Nucléotidiques sur la Quantification de l’ARN du VHC Chevaliez et al., Hepatology 2009;50(5):1681. WT G4 or WT G1 A165T or G145A G145A+A165T HCVRNAlevels(Log10IU/mL) 5.7 6.1 6.4 4.0 6.0 6.7 4.3 5.9 6.3 <1.2 6.0 6.6 0 2 4 6 8 CTM v1.0 m2000RT bDNA Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 115. Quantification de l’ARN VHC G4 (CAP/CTM v2.0) HCVRNAlevelinCAP/CTMv2.0(Log10IU/mL) HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL) 8 7 6 5 4 3 876543 876543 Mean of HCV RNA levels in CAP/CTM v1.0 and bDNA (Log10IU/mL) Differencebetween CAP/CTMv1.0andbDNA(Log10IUI/mL) +1.5 +1.0 +0.5 0.0 -0.5 -1.5 -1.0 +0.08 +0.35 +0.62 Genotype 4 (n=122) Chevaliez et al., J Clin Microbiol 2013;51(4):1078-82. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 116. Chevaliez et al., J Clin Microbiol, 2009,47(6):1726-32. HCV RNA Quantification (m2000, Abbott) Genotype 3 (n=29) Genotype 2 (n=21) Genotype 1 (n=55) Genotype 4 (n=24) Genotype 6 (n=3) Genotype 5 (n=9) 876543 Mean of HCV RNA levels in m2000 and bDNA (Log10IU/mL) Differencebetween m2000andbDNA(Log10IUI/mL) +1.5 +1.0 +0.5 0.0 -0.5 -1.5 -1.0 -0.06 +0.26 +0.58 HCVRNAlevelinm2000(Log10IU/mL) HCV RNA level in HCV 3.0 bDNA (Log10 IU/mL) 8 7 6 5 4 3 876543 Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 117. HCV RNA Quantification (GenXpert) 0 2 4 6 8 0 2 4 6 8 HCV RNAlevel m2000 (LogIU/mL) HCVRNAlevelXpert(LogIU/mL) Genotypes1 to4 (n=46) r=0.99;p<0.0001 0 -1.5 -0.5 0.5 1.5 Meanof HC DifferencebetweenXperytHCVandm2000 (Log₁₀IU/mL) Unpublished data. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 118. HCV RNA Level Assessment in the Era of DAA • HCV RNA quantification should be regularly assessed before, during and after treatment • HCV RNA quantification should be based on a real- time PCR (or TMA) assay – With results expressed in IU/mL – With identical LLOD and LLOQ, of the order of 10-15 IU/mL • In a given patient, HCV RNA level monitoring must be performed with the same real-time assay Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 119. Europe or FDA Approval for HCV RNA Quantification Tests • 2 tests are approved by the FDA and in Europe for HCV RNA quantification in clinical practice – m2000 since May 2011 – New version of CAP/CTM since March 2013 • 1 test is approved only in Europe for HCV RNA quantification in clinical practice - Xpert HCV viral load since May 2015 Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 120. Génotypes Smith et al., Hepatology 2014;59(1):318-27. 4 1 5a 3 2 6 7a Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 121. Détermination du Génotype • Méthodes moléculaires (genotyping) – Analyse de la séquence après séquençage direct – Hybridation inverse des produits d’amplification sur des supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics) – PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique • Méthodes sérologiques (“serotyping”) – ELISA compétitif Arens et al., J Clin Virol, 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 122. Arens et al., J Clin Virol 2001; 22:11-29; Davidson et al., J Gen Virol 1995; 76: 1197-204; Lareu et al., 1997; Le Pogam et al., 1998; J Clin Microbiol; 36: 1461-3; Ilina et al., J Clin Miocrobiol, 2005; 43(6): 2810-15. • Méthodes moléculaires (genotyping) – Analyse de la séquence après séquençage direct – Hybridation inverse des produits d’amplification sur des supports solides comportant des sondes génotype spécifique : Line Probe Assay (INNO-LiPA HCV, Innogenetics) – PCR en temps réel à l’aide d’amorces et de sondes génotype spécifique • Méthodes sérologiques (“serotyping”) – ELISA compétitif Stratégie diagnostique & suivi virologique Détermination du Génotype
  • 123. Analyse Phylogénique après Séquençage Direct Région NS5B(286 nt) CLUSTALX DNADist (PHYLIP 3.5) Matrice de distance: Kimura 2- parameter (Ts/Tv=2) Neighbor-Joining Bootstraping : 1000 replicates NJPlot 5aSA13 2aHCJ6 Patient 49 6aEUHK2 3aNLZ1 Patient 62 4aED43 1hFrSSD98 1h98CM1357 1h98CM1521 1cHCG9 1cSR031 1cKhaja1 1aHCV1 1aHCVH 1aHCJ1 1jQC2 1jQC89 1kQC68 1kQC82 1eM4541N 1eCAM1078 1eQC172 1g1382 1g2152 1gEG024 1lM5186N 1l98CM1427 1l98CM1457 1fFR2 Patient 59 Patient 46 Patient 54 Patient 2 Patient 28 Patient 64 Patient 16 Patient 36 Patient 18 Patient 17 Patient 8 Patient 7 1bHCJ4 1bHCVBK 1bHCP01 Patient 40 1iFR16 1iQC77 1iQC181 Patient 48 Patient 60 Patient 52 Patient 26 1dFR17 1dHC1N16 1dBA107 1mGUI17 1mGUI11 1mGUI24 0.05 59 99 96 34 100 72 100 98 43 Génotype 2 Génotype 4 Génotype 3 Génotype 1 Génotype 6 Génotype 2 Génotype 5 Génotype 1, sous-type b Génotype 3, sous-type a Génotype 1, sous-type i Génotype 1, sous-type ? 100 Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 124. Versant® HCV Genotype 2.0 Assay (INNO-LiPA) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 125. Résumé • Détermination du génotype (sous-type) VHC – La détermination du génotype sur la seule région 5’NC doit être proscrite – La 2nde génération de Line Probe Assay qui utilise des sondes dirigées contre la région core en plus de la région 5’NC est la meilleure méthode permettant de distinguer les sous-types 1a et 1b EASL CPG., J Hepatol 2015; 63:199-236. Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 126. Tests de Résistance Disponibles en Europe • Aucune trousse commerciale disponible • Uniquement des techniques de séquençage direct “maison“ de la protease NS3, du domaine I de la NS5A et de la NS5B • Méthodes de séquençage ultra-sensible en développement (NGS) –Sentosa SQ HCV Genotyping Assay (VELA Diagnostics) Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 127. Tests de Résistance Disponibles en Europe • Méthodes commerciales disponibles pour les trois régions ciblées par les DAA – ARN du VHC ≥2000 UI/mL requis – Basée sur technique NGS (cut-off 10%) – G1a or 1b Stratégie diagnostique & suivi virologique
  • 128. Tests de Résistance Disponibles en Europe • Test de résistance systématique en pré-traitement chez des patients naïfs ou en échec de bithérapie ? ­ Taux de RVS élevés – Impact des RAV NS5A sur la réponse au traitement chez les patients cirrhotiques en échec • Test de résistance en cas d’échec du traitement ? – La plupart des patients ont des variants résistants au moment de l’échec • Test de résistance pour le retraitement ? ­ Des données supplémentaires sont nécessaires Stratégie diagnostique & suivi virologique

Notes de l'éditeur

  1. Number of deaths 60,000 in Europe &amp;gt;7,500 in the US &amp;gt;2500 in France People are unaware of the serological status 50.3% in the US 42.6% in France (i.e., 100,000 persons)
  2. Human pegivirus (HPgV) infects an estimated 2% and 5% of the world’s population. HPgV is lymphotrophic, but its pathogenicity for humans is unknown.
  3. cDNA a permis la caractérisation moléculaire du virus mais ce système ne répliquait que le chimpanzé. Réplicons subgénomiques ont permis l’étude de la réplication intracellulaire en l’absence de production de particules virales Pseudoparticules pour l’étude des étapes précoces de l’infection
  4. Les particules VHC infectieuses issues de patients virémiques, c’est-à-dire contenant de l’ARN sédimentent à une densité &amp;lt;1,08 g/mL, à une valeur inférieure de celles observées pour les autres virus appartenant à différentes familles et les particules VHC infectieuses (HCVcc) produites en culture cellulaire. Cette valeur est voisine des coefficients de sédimentation de certaines lipoprotéines plasmatiques, type HDL ou VLDL.
  5. Using mass spectrometry Les esters de CH représentent plus de la moitié de la composition lipidique des particules HCVcc et s’apparentent aux lipoprotéines de type VLDL ou LDL
  6. La région 5’NC est richement structuré avec une structure secondaire de type tige-boucle. La région 5’NC est formée de 4 domaines dont 3 constitue l’IRES ou site d’entrée interne du ribosome. La portion apicale du domaine III présentant une forte affinité pour le su 40S du ribosome et le facteur d’initiation de la traduction eIF3 Le domaine en pseudo-nœud (pseudoknot), situé à la base du domaine 3, est capitale car joue un rôle dans l’orientation du domaine 4 et de l’ORF permettant de placer le codon initiateur AUG en face du du tRNA initiateur pour le démarrage de la traduction. Ce domaine a un rôle capital et est placé au centre de l’IRES
  7. Les microARN sont des ARN non codant de petite taille dont la fonction est d’induire la formation d’un complexe qui a pour rôle de réprimer l’expression du gène targeter. miR-122 est un micro ARN qui joue un rôle majeur dans l’infection VHC
  8. Phase 2b 36 patients G1 Injections SC
  9. Core protéine est formée de 2 domaines D1 et D2. L’analyse HCA (hydrophobic cluster analysis) montre la présence de 2 clusters hydrophobes (2 et 4) et 3 clusters fortement basiques (1, 3 et 5) au niveau du domaine D1. Le domaine D1 est capable d’interagir avec l’ARN viral, tandis que le domaine D2 hydrophobe permet l’association de la protéine de capside avec les gouttelettes lipidiques intracytoplasmiques
  10. Core protein, lipid droplets, and nuclei are stained in red, green, and blue, respectively.
  11. Caractéristiques des protéines de fusion class II : structure avec une prédominance de feuillets beta et existence sous forme de monomères ou hétérodimères avec fusion membranaire
  12. Ig-fold which has a sandwich-like structure formed by two sheets of antiparallel beta strands BVDV: bovine viral diarrhea virus (virus de la diarrhées bovine) TBEV: tick born encephalitis virus
  13. Ig-fold which has a sandwich-like structure formed by two sheets of antiparallel beta strands CD81 interagit avec the front layer et the CD81 binding loop (mutagenesis analysis)
  14. La région E2P7NS2n est plus informative pour les études épidémiologiques que la région NS5B car moins variable entre les génotypes
  15. P7 s’organise sous forme d’hexamères d’un PM de 42 kDa avec 2 domaines transmembranbaires In vitro en culture cellulaire, a été montré jouer un rôle dans la sécrétion des néovirions P7 est requis au virus pour se répliquer chez le chimpanzé. De plus en plus d’études suggèrent que p7 pourrait avoir des fonction similaires à M2 des virus grippaux de type A, c&amp;apos;est-à-dire un rôle dans les étapes précoces au cours de l’entré virale ainsi qu’un rôle dans les tapes tardives au cours de la sécrétion des particules virales protégeant ainsi les Gp des pH acides même si cette deuxième hypothèse est discuté car Gp HCV sont relativement stable à pH acide et on ne sait pas si p7 fait parti de la particule virale.
  16. BVDV: bovine viral diarrhea virus CMA and CMC are two nucloeside analogues
  17. BVDV: bovine viral diarrhea virus
  18. NS2 est une cysteine-protéase de 217 aa qui comprend un domaine N-ter hydrophobe permettant de se lier aux membranes et un domaine C-ter globulaire avec un sous-domaine cytosolique protéasique. Le domaine protéasique est capable de former des homodimères afin de former un site catalytique actif permettant d’assurer en cis le clivage NS2-NS3. La topologie du domaine hydrophobe NS2 a été récemment déterminé par RMN (résonance magnétique nucléaire) et fait apparaître 3 segments transmembranaires (TMS1, 2 et 3). De plus, il a été démontré que la région N-ter de NS2 apparaît indispensable dans l’organisation de la formation des nucléocapsides, mécanisme complexe, qui semble étroitement associé aux gouttelettes lipidiques et qui en plus de la protéine de capside requiert d’autre partenaires tel que E1, E2, p7 et NS2. NS2 est capable d’interagir avec de nombreux partenaires p7, E2, NS3 et plus modérément NS5A
  19. La protéine NS3 comprend deux domaines, un domaine protéasique (serine protéase qui assure la plupart des clivages en trans puis en cis) et un domaine hélicase qui represénte 70% de la protéine NS3 avec 444 amino acides. En rouge est représenté le domaine protéasique en présence de son cofacteur la potéine NS4A en violet et son substrat. Le site actif est constitué d’une triade catalytique (His-57, Asp-81, Ser-139). En gris sur votre droite le domaine hélicase avec le site catalytique/NTP
  20. NS5A is a phosphoprotein with 2 forms basally phosphorylated form (p56) hyperphosphorylated form (p58)
  21. La phosphorylation de NS5A par CKI-alpha facilite l’interaction de la protéine NS5A avec la protéine core et ainsi l’assemblage des nouvelles particules virales
  22. L’interaction de la protéine NS5A avec PI4KIII alpha et son activation est cruciale pour le réplication du VHC
  23. HCV genotype 1
  24. ABT-530 efficacité évaluée avec 2 doses 120 et 40 mg en association à une anti-NS3 (ABT-493)
  25. Plusieurs mécanismes d’action des anti-NS5A ont été décrits dans la littérature: 1- Inhibition de la formation des complexes de réplication 2- Inhibition du recrutement de la protéine kinase PI4KIII alpha 3- Augmentation de la stabilité de la protéine NS5A 4- Augmentation de la capacité de dimérisation de NS5A 5-Facilitation de la disruption des complexes NS5A
  26. 48 patients au total 8 dans la cohorte 3
  27. The first step of HCV LVP entry is the binding of E1/E2 and /or ApoE on heparan sulfate proteoglycan and LDLR. SRBI may play a role in HCV binding via HCV E2 and/or lipoproteins. SRBI may play also a role at the post-binding step of HCV entry. Receptor tyrosine kinase including epidermal growth factor (EGFR) but also ephrin receptor A2 mediate HCV entry through facilitating association between CD81 and claudin 1. Claudin 1 and occludin are component of tight junctions that contributes to post-binding steps of the HCV entry process. Recently, Niemann Pick C-1 like 1 (NPC1L1) plays an important role in CH reabsorption from biliary secretion and as a cofactor for HCV entry during post-binding steps. Un facteur clé dans l’entrée du VHC est la capacité de mouvement latéral du complexe HCV-CD81 jusqu’au jonctions serrées permettant l’interaction avec claudin-1 et induction de l’endocytose clathrine-dépendante. On a une acidification du compartiment endosomal et induction de la fusion entre la membrane endosomale et celle de l’enveloppe virale. Suite à la fusion, le génome viral est libéré dans la cytosol, où il est directement traduit afin de produire les différentes protéines virales
  28. Double membrane vesicles (DMV)
  29. L’ARN viral fraichement répliqué au sein des complexes de réplication va servir pour la formation de nouvelles particules virales qui vont budder à travers le RE. Ce processus implique la protéine de capside et les glycoprotéines E1 et E2, ainsi que l’ARN viral. Les particules virales naissantes sont maturées au sein du Golgi afin d’acquérir leur faible densité avant exocytose à la surface des hépatocytes. De nombreuses protéines virales et cellulaires sont impliquées dans ce processus. La protéine de capside une fois synthétisée à la capacité de s’homodimériser et d’interagir avec les LD qui sont les organelles intracellulaires de stockage des lipides. La transit de la protéine de capside via les LD n’est pas totalement élucidé, peut être un rôle de séquestration de protéine de capside jusqu’à l’assemblage… Ce trafficking implique des protéines cellulaires comme des MAPK et DGAT1, une des 2 enzymes nécessaires à la biosynthèse des TG. Ensuite la protéine de core doit être transférée vers les sites d’assemblage et cela implique des facteurs cellulaires. De nombreuses protéines virales sont impliquées dans l’assemblage et la sécrétion, c’est le cas de p7-NS2, NS3/4A, NS5A et NS5B bien que toutes ne soient pas empaquetées dans la particules virale. La première étape implique l’interaction de NS5A avec les LD-core. NS2-P7 jouent également un rôle majeur.