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Découvrez le vaccin
contre le paludisme




Atelier d’expérimentation
PROTOCOLE
Introduction
Le paludisme est considéré comme la maladie                         ventions sont menées à bien sous la forme de
la plus importante du monde due à un parasite                       différentes mesures combinées comprenant
et est responsable du décès de près de                              l’utilisation de moustiquaires imprégnées
800 000 personnes chaque année, en particulier                      d’insecticide, d’aérosols insecticides et de trai-
d’enfants de moins de cinq ans et de femmes                         tements de prévention, ainsi que l’implantation
enceintes. Selon l’Organisation mondiale de la                      de programmes éducatifs et d’interventions
santé (OMS), près de 3 000 millions de personnes                    environnementales, entre autres.
risquent de contracter l’infection, et 225 millions
de cas de paludisme se sont produits dans le                        La communauté scientifique travaille inten-
monde en 2010, dont 90 % ont eu lieu en Afrique.                    sément pour mettre au point un vaccin qui,
                                                                    associé aux mesures actuelles, pourrait contri-
De nos jours, le paludisme est endémique dans                       buer de manière significative, selon les experts,
plus de 100 pays localisés en Afrique subsa-                        à un meilleur contrôle du paludisme. Il existe
harienne et dans les régions du sud de l’Asie,                      déjà actuellement un vaccin en phase d’étude
d’Amérique latine et d’Océanie. Les derniers                        clinique, qui sera efficace dans 50 % des cas.
rapports montrent que la moitié de la population
mondiale vit dans des zones présentant un risque
de contracter la maladie et où le paludisme n’a
pas seulement des conséquences sur la santé de
la population, mais contribue aussi à fragiliser
davantage la situation économique de la zone.                         Cet atelier vous permettra d’étudier
                                                                      différents candidats-vaccins afin de décider
Afin d’éradiquer la maladie dans les zones à                          quel candidat est le plus efficace.
haut risque de transmission, plusieurs inter-




        Pays ou zones où a lieu la transmission du paludisme               Pays ou zones à risque réduit de transmission du paludisme



Source : Organisation mondiale de la santé (OMS). Données de 2009




                                                                                                                                        2
Comment se transmet le paludisme ?                   Pourquoi un vaccin contre le
                                                     paludisme est-il nécessaire ?
Le paludisme est une maladie infectieuse
transmise par la piqûre d’un moustique du            Historiquement, les vaccins ont constitué l’un
genre Anopheles qui transmet des parasites           des moyens les plus efficaces pour prévenir
du genre Plasmodium et agit par conséquent           des maladies et sauver des vies, en particulier
comme un vecteur. Au sein de l’organisme             dans le cas des maladies infectieuses. L’obten-
humain, les parasites se multiplient dans le         tion d’un vaccin partiellement efficace pourrait
foie pour infecter ensuite les globules rouges.      représenter la possibilité de sauver des cen-
Parmi les symptômes du paludisme, les plus           taines de milliers de vies.
significatifs sont la fièvre, les maux de tête
et les vomissements, survenant 10 à 15 jours         L’obtention d’un vaccin impliquera une avan-
après la piqûre du moustique.                        cée majeure. Il pourra être ajouté à l’arsenal
                                                     actuel de mesures utilisées pour la prévention
                                                     du paludisme, telles que les moustiquaires
                                                     imprégnées d’insecticide ainsi que le traitement
                                                     opportun et adéquat des cas diagnostiqués de
Quelles sont les interventions                       paludisme.
mises en place pour contrôler le
paludisme ?                                          Comme son efficacité à court terme sera
Les principales interventions pour contrôler le      partielle, il ne remplacera pas ces mesures,
paludisme sont réparties en plusieurs groupes :      mais les complètera, constituant ensemble une
                                                     réponse complète pour la prévention du palu-
                                                     disme.
1                    Des stratégies contre le
                     moustique ou vecteur,
                     telles que la fumigation
                     des espaces fermés à
                     l’aide d’insecticides.
                            d’




2                    Des stratégies permettant
                     d’éviter le contact vecteur-
                     hôte, comme l’utilisation de
                     moustiquaires imprégnées
                     d’insecticide.




3                      Des stratégies contre le
                       parasite. Ce dernier groupe
                       comprend le traitement à
                       base d’une association de
                       médicaments mis au point
                       à partir d’une molécule
appelée artémisinine, qui est rapide et efficace.
Un vaccin serait aussi une stratégie de contrôle
du parasite qui, en combinaison avec d’autres
stratégies, pourrait contribuer de manière
significative à l’éradication du paludisme.




                                                                                                        3
Que faisons-nous à l’ISGLOBAL, l’Institut de santé globale de Barcelone ?
L’Institut de santé globale de Barcelone             1. Étude des bases moléculaires de la mala-
(ISGlobal) est une organisation à but non               die, ainsi que des différentes réponses
lucratif, dont l’objectif est d’améliorer la santé      immunitaires.
et le développement des populations les plus
vulnérables par la génération, la gestion, la        2. Mise au point de nouveaux médicaments
transmission et l’application de connaissances.         et évaluation de leur sécurité, efficacité et
Sa vision est un monde où nous puissions tous           effectivité.
être en bonne santé et il compte avec le soutien
de l’œuvre sociale « la Caixa », entre autres        3. Évaluation des caractéristiques épidémio-
institutions.                                           logiques du paludisme au sein de différents
                                                        environnements et des aspects sociocultu-
L’un des piliers essentiels de l’ISGlobal est la        rels qui l’entourent.
recherche centrée sur les problèmes de santé
affectant les populations les plus vulnérables       4. Analyse de l’efficacité de différents outils de
et elle se déroule au Centre de recherche sur la        prévention, ainsi que du rapport coût/efficacité
santé internationale de Barcelone (CRESIB). La          des interventions.
recherche sur le paludisme effectuée au CRESIB
est consacrée aux travaux suivants :                 Dans le cadre du point (4), le CRESIB réalise
                                                     des études cliniques de sécurité, d’efficacité et
                                                     d’effectivité des vaccins. Il participe actuelle-
                                                     ment à la mise au point du vaccin RTS,S contre
                                                     le paludisme, qui est efficace chez plus de 50 %
                                                     des enfants infectés. Parallèlement, le travail
                                                     des chercheurs du CRESIB porte sur l’identifi-
                                                     cation de nouveaux candidats-vaccins.




                                                                                                           4
Objectifs de l’atelier                       1
Dans le cadre de cet atelier, nous vous
proposons de travailler sur différents
candidats-vaccins contre le paludisme en cours
d’étude au CRESIB, pour identifier le meilleur
candidat. Les candidats-vaccins du CRESIB ont
été obtenus à partir de protéines du parasite
préalablement purifiées.

Afin de procéder à leur étude, vous disposerez
de plusieurs échantillons de sang de personnes
résidant dans des zones affectées par le
paludisme, qui ont déjà souffert de la maladie à
plusieurs reprises et sont immunisées.

Pour confirmer l’efficacité de nos candidats-
vaccins, nous devons vérifier si les personnes
immunisées ont développé une réponse contre
ces candidats. Si une activation de la réponse
immunitaire contre les protéines candidates        2
est observée, cela signifie qu’elles pourraient
constituer de bons candidats-vaccins car
elles pourraient aussi déclencher la réponse
nécessaire à la protection contre de futures
infections.




                                                   3




                                                       5
Cet atelier a pour vocation de vous familiariser                 contre les candidats indique la capacité à
avec l’une des techniques les plus utilisées dans                déclencher une bonne réponse immunitaire et
les laboratoires de biomédecine, la technique                    qu’il peut donc s’agir d’un bon candidat.
ELISA (« Enzima Linked Immuno Sorbent Assay »).
                                                                 Grâce à cette technique, nous découvrirons en
Il s’agit d’une analyse permettant de détecter                   particulier lequel des antigènes disponibles
la présence d’anticorps dans les échantillons                    dans le laboratoire est un bon candidat-vaccin
de sang. La présence d’anticorps spécifiques                     contre le paludisme.




        Principes fondamentaux de la technique ELISA
Le principe fondamental de cette technique                       Pour mener à bien l’identification, nous utili-
repose sur l’interaction du candidat-vaccin, ou                  sons des anticorps liés à une molécule appelée
antigène (1), avec l’anticorps (2). Un anticorps                 enzyme (3) ayant la capacité de réagir avec une
spécifique se lie à un antigène spécifique pour                  substance appelée substrat (4) que nous ajou-
former un complexe antigène-anticorps exclusif.                  tons, et de produire une couleur.

La technique ELISA nous permet de mettre                         Ainsi, si l’échantillon contient l’anticorps que nous
en évidence la présence des anticorps et, par                    voulons détecter, celui-ci se lie à celui que nous
conséquent, la formation de complexes anti-                      ajoutons lié à une enzyme, ce qui fait apparaître
gène-anticorps lors du contact des échantillons                  un changement de couleur du substrat, nous indi-
de sang avec les candidats-vaccins.                              quant de cette manière un résultat positif.



                                                                                                             Substrat
                                                                          Enzyme
                                           Anticorps



          Antigène




1. Antigène : toute substance étrangère susceptible de se lier de manière spécifique aux anticorps ou lymphocytes spé-
   cifiques et de déclencher une réponse immunitaire. En général, les antigènes ont un poids moléculaire élevé et sont
   normalement des protéines ou des polysaccharides.
2. Anticorps : protéines (immunoglobulines - Ig) du sérum générées en réponse à l’invasion de molécules étrangères dans
   l’organisme, soit par exposition naturelle à un antigène, soit par immunisation au moyen de vaccins. Ils ont la forme d’un
   Y et sont constitués de quatre chaînes polypeptidiques liées grâce à des liaisons disulfures intercaténaires. Les anticorps
   possèdent une région constante et une région variable.
3. Enzyme : protéine contribuant aux réactions spécifiques du métabolisme.
4. Substrat : solution contenant un composé sur lequel agira une enzyme.




                                                                                                                                 6
Organisation de l’atelier
Afin de découvrir lequel des candidats-vac-             des anticorps contre ceux-ci.
cins ou antigènes est le plus efficace, nous            Pour ce faire, l’expérience est divisée en
analysons si les échantillons de sang de per-           3 étapes principales.
sonnes immunisées contre le paludisme ont


1. LIAISON DES PROTÉINES CANDIDATES (OU ANTIGÈNES) À LA SURFACE DES PUITS
La première étape consiste à fixer les protéines candidates faisant l’objet de l’étude sur un support solide.




2. FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS
Nous ajoutons ensuite les échantillons de sang, plus précisément le sérum (correspondant aux
échantillons de sang après extraction des cellules et des facteurs de la coagulation), et un anticorps
marqué par une enzyme que nous appelons anticorps secondaire. Les échantillons de sang conte-
nant l’anticorps à étudier présentent la formation de complexes antigène-anticorps, qui se lient à
leur tour à l’anticorps marqué par l’enzyme.


                                   Sérum                               Anticorps
                                 des patients                      secondaire marqué
                                                                    par une enzyme




3. LECTURE DE LA RÉACTION
Enfin, nous ajoutons le substrat de l’enzyme, qui, en présence du complexe antigène-anticorps,
change de couleur. Nous pouvons ainsi savoir si les échantillons de sang contiennent l’anticorps à
étudier et la quantité d’anticorps.



                                                      Substrat
                                                     de l’enzyme




      Résultats et conclusions
Les résultats obtenus permettent de décider             immunitaire plus intense et peut donc être le
quel candidat-vaccin déclenche une réponse              meilleur candidat.




                                                                                                                7
Équipement et matériel
nécessaire
Instruments et ustensiles de laboratoire




    Agitateur magnétique (1)                    Noyau magnétique et                               Micropipette
  (pour préparer le PBS-Tween)                « extracteur de noyaux »                          de 20 à 200 µl (2)




                                                 Éprouvette              Flacon en verre de
           Chronomètre                                                                                    Entonnoir
                                                 de 100 ml                    250 ml

Consommables




       Barrettes de 12 puits                       Pipettes Pasteur en                     Pointes pour micropipette
        d’ELISA et portoirs                        plastique graduées




         Papier absorbant                           Feutre permanent                       Gants, lunettes et blouse


1. Si vous ne disposez pas d’agitateurs magnétiques, vous pouvez acheter le PBS liquide
2. Si vous ne disposez pas de micropipettes, vous pouvez utiliser des pipettes Pasteur de petit volume




                                                                                                                       8
Réactifs et échantillons




   Solution tampon PBS (3)                    Détergent Tween-20 (4)                          Eau distillée




                                                                                                      Anticorps secondaire
       A                     B                    C+                 C-



       Candidats-vaccins                          Contrôles positifs                     Anticorps secondaire
          (antigènes)                              et négatifs (5)                         lié à une enzyme
                                                                                             (peroxydase)
                  Substrat




                                                     1                  2                 3                                  4


      Substrat ou solution                     Échantillons de sérum de quatre personnes résidant
          révélatrice                         dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont
                                                          immunisées contre la maladie


3. Permet de maintenir le pH de la solution grâce aux phosphates de sodium et de potassium.
4. Permet de prévenir des liaisons d’anticorps non spécifiques.
5. C+ : contient un mélange de sérums de personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont
immunisées contre la maladie. C- : mélange de sérums de personnes n’ayant jamais été exposées au paludisme.




                                                                                                                                 9
Procédures
Pour déterminer la présence ou l’absence d’an-       résidant dans des zones où le paludisme est
ticorps spécifiques contre les deux antigènes        endémique avec ces antigènes afin d’observer
candidats-vaccins disponibles dans le labora-        si des anticorps spécifiques contre nos anti-
toire, nous mettons en contact le sang (plus         gènes sont présents dans ces sérums.
précisément le sérum) de différents patients



    1        Liaison des antigènes à la surface des puits

Les barrettes de micropuits sont recouvertes de      La liaison de ces antigènes à la surface des
candidats-vaccins (antigènes) à analyser pour        puits se produit facilement car ces derniers
découvrir s’il s’agit de bons candidats-vaccins      sont constitués d’un plastique traité ayant une
contre le paludisme.                                 grande affinité pour lier des protéines.




PROTOCOLE POUR LA LIAISON DES ANTIGÈNES À LA SURFACE DES PUITS

1
        Annotez ensuite le contenu de chaque puits (contrôles, échantillons de sang et nom des
        antigènes à étudier).




2
        Étiquetez les puits en marquant le
        lieu de dépôt de chaque échantillon.




                                                                                                       10
3
      Préparez une solution de lavage (PBS-Tween à 0,05 %).




A                                                                    B




  Mesurez 200 ml d’eau distillée à l’aide de
  l’éprouvette et complétez au volume avec                              Introduisez le noyau magnétique dans le
  la pipette Pasteur. Versez les 200 ml d’eau                           flacon et diluez dans l’eau une pastille de
  distillée dans le flacon à l’aide de l’entonnoir.                      PBS à l’aide de l’agitateur magnétique.


C                                                                    D




    Après dissolution de la pastille, procédez à
    l’extraction du noyau magnétique et ajoutez
    100 µl de Tween-20 à l’aide d’une pipette                           Agitez bien le contenu du flacon en le
    Pasteur en plastique.                                               retournant plusieurs fois.


Remarque : La solution de lavage contient du PBS (phosphate buffer saline) permettant de maintenir les anticorps dans un
environnement stable qui aide à la conservation de leur structure. Le Tween-20 est un détergent permettant d’éliminer les pro-
téines liées de manière non spécifique. Il se lie aux parties du puits non recouvertes d’antigène, réduisant ainsi le bruit de fond.




                                                                                                                                       11
4                                              5
    Ajoutez les deux
    antigènes à
    étudier aux puits
    correspondants
    à l’aide de la
    micropipette
    (50 µl par puits).
    Il est important
    d’utiliser une pointe
    propre pour déposer
    les antigènes,
    afin d’éviter des
    contaminations.

                                                     Laissez incuber pendant 5 minutes à
                                                     température ambiante.



6                                              7




                                                   Lavez pour éliminer l’excès d’antigène non
    Éliminez les résidus d’antigène en             lié à la barrette. Pour ce faire, remplissez
    retournant la barrette sur un papier           les puits avec la solution de lavage à l’aide
    absorbant.                                     d’une pipette Pasteur en plastique.



8                                              9




Éliminez la solution de lavage en retournant
la barrette sur un papier absorbant.                 Répétez une fois les étapes 7 et 8.




                                                                                                   12
2         Formation de complexes antigène-anticorps


Au cours de cette étape, nous préparons            par une enzyme appelée peroxydase. Comme
d’abord le sérum des patients pour détecter la     chaque anticorps primaire peut être lié à plus
présence d’anticorps contre le candidat-vaccin.    d’un anticorps secondaire, nous observerons
Nous appelons anticorps primaires ces anti-        une augmentation de la quantité de couleur
corps que nous voulons analyser. Nous ajou-        obtenue lors de l’étape trois. La technique sera
tons ensuite un anticorps secondaire marqué        ainsi plus sensible.



                                                              Anticorps
                                 Sérum                    secondaire marqué
                               des patients                par une enzyme




PROTOCOLE DE FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS




1                                                  2




      Ajoutez les contrôles positifs et négatifs        Ajoutez les différents échantillons
      aux puits correspondants à l’aide de la           de sérums de quatre personnes
      micropipette (50 µl par puits).                   résidant dans des zones où le
      Le contrôle positif (C+) contient un              paludisme est endémique aux
      mélange de sérums de personnes résidant           puits correspondants à l’aide de la
      dans des zones où le paludisme est                micropipette (50 µl par puits).
      endémique, qui sont immunisées contre la
      maladie. Le contrôle négatif (C-) contient
      un mélange de sérums de personnes
      n’ayant jamais été exposées au paludisme.




                                                                                                      13
3                                               4




    Laissez incuber pendant 5 minutes à         Éliminez l’excès d’échantillon par retournement
    température ambiante.                       de la barrette sur un papier absorbant.


5                                               6




    Lavez tous les puits afin d’éliminer les
    anticorps n’ayant pas réagi avec les
    antigènes, qui sont par conséquent non
    spécifiques. Remplissez les puits avec la       Éliminez la solution de lavage par
    solution de lavage à l’aide d’une pipette       retournement de la barrette sur un
    Pasteur en plastique.                           papier absorbant.


7                                               8




                                                    Ajoutez l’anticorps secondaire lié à une
                                                    enzyme à tous les puits à l’aide de la
    Répétez deux fois les étapes 5 et 6.            micropipette (50 µl par puits).




                                                                                                  14
9                                                      10




                                                            Éliminez l’excès d’anticorps secondaire
     Laissez incuber pendant 5 minutes à                    par retournement de la barrette sur un
     température ambiante.                                  papier absorbant.



11                                                     12




     Lavez les puits en les remplissant avec                Éliminez la solution de lavage par
     la solution de lavage à l’aide d’une                   retournement de la barrette sur un
     pipette Pasteur en plastique.                          papier absorbant.


13




     Répétez trois fois les deux étapes précédentes.




                                                                                                      15
3         Lecture de la réaction


À la fin du lavage pour éliminer toutes les
molécules marquées non liées sous la forme
de complexes antigène-anticorps, ajoutez le
substrat enzymatique en solution, qui facilitera
le changement de couleur.




                                                    Substrat
                                                   de l’enzyme




PROTOCOLE DE LA LECTURE DE LA RÉACTION


1                                                      2




      Ajoutez le substrat de l’enzyme à                     Laissez incuber pendant 5 minutes au
      l’ensemble des puits à l’aide de la                   cours desquelles le substrat se lie à
      micropipette (50 µl par puits).                       l’enzyme pour faire apparaître la couleur
                                                            à température ambiante.




                                                                                                        16
3
             Annotez les résultats sous la forme d’un graphique à barres.




ANTIGÈNE 1

maximum
 Intensité




minimum                                                                               Échantillons

                      C+            C-            M1            M2          M3   M4




ANTIGÈNE 2

maximum
 Intensité




minimum                                                                               Échantillons

                      C+            C-            M1            M2          M3   M4




                                                                                                     17
Résultats et conclusions
 Interprétez et notez les résultats



 1. Quel antigène parmi ceux que vous avez analysés est, selon vous, le meilleur candidat-vaccin ?
 Pensez-vous que les antigènes que vous avez analysés sont des bons candidats-vaccins ? Pourquoi ?




 2. Quand une réaction est-elle positive ou négative ? Pourquoi ?




 3. Pourquoi, selon vous, faut-il utiliser les contrôles ?




                                                                                                     18
4. Quelle partie de l’anticorps primaire est reconnue par l’anticorps secondaire : la région
constante ou la région variable ? Justifiez la réponse.




5. Que se passerait-il si les lavages n’étaient pas effectués avant l’ajout du substrat révélateur ?




6. Du sang des collègues de votre classe peut-il être utilisé pour déterminer si nos antigènes
de laboratoire sont de bons candidats pour mettre au point un vaccin contre le paludisme ?
Justifiez la réponse.




7. Pensez-vous que cette expérience ait démontré que le candidat sélectionné déclenche la
réponse immunitaire ? Faut-il effectuer un autre type d’expérience en vue d’évaluer s’il est
aussi capable de déclencher un autre type de réponse ?




                                                                                                       19
Annexe I
                                                        PORT DES LUNETTES   PORT DE LA BLOUSE   PORT DES GANTS
                                                           OBLIGATOIRE         OBLIGATOIRE       OBLIGATOIRE
Consignes de sécurité

INFORMEZ-VOUS                                          et lavez-vous souvent les mains si vous utilisez
Localisez les éléments de sécurité du labora-          des produits toxiques ou corrosifs. N’approchez
toire ou de l’espace prévu pour effectuer des          pas des récipients contenant des réactifs d’une
expériences (extincteurs, douches ou bain,             flamme. Ne chauffez pas des liquides inflam-
sorties, etc.). Veuillez lire attentivement les ins-   mables. Transportez les flacons en les tenant
tructions avant de commencer une expérience.           par le fond, en aucun cas par l’ouverture.
N’oubliez pas de lire les étiquettes de sécurité
des réactifs et des appareils.                         ÉLIMINATION DES DÉCHETS
                                                       Déposez dans des conteneurs prévus à cet effet
UTILISEZ DES VÊTEMENTS ADÉQUATS                        et dûment identifiés le verre cassé, les réactifs
Gants, blouse et lunettes de protection.               toxiques, nocifs ou néfastes pour l’environ-
                                                       nement et les déchets biologiques. Ne jetez
RÈGLES GÉNÉRALES                                       jamais des résidus solides dans l’évier.
Il est interdit de fumer, de manger ou de boire
dans le laboratoire ou l’espace prévu pour             En cas d’accident, prévenez immédiatement
effectuer des expériences.                             l’éducateur. Rappel : en cas de doute, veuillez
Lavez-vous les mains avant de sortir du labora-        consulter l’éducateur.
toire. Travaillez de manière ordonnée, propre-
ment et calmement. Si un produit se répand sur         PRÉCAUTIONS SPÉCIFIQUES
le sol ou sur la paillasse, nettoyez-le immédia-       À PRENDRE LORS DE CET ATELIER
tement. Nettoyez et rangez le matériel. N’utili-       Au cours de cette pratique, vous devez manipuler
sez jamais un équipement ou un appareil sans           les réactifs en respectant les précautions cou-
connaître parfaitement son fonctionnement.             rantes prévues pour la manipulation des produits
                                                       chimiques. Seuls les produits présentant les degrés
MANIPULATION DU VERRE                                  de danger suivants sont indiqués ci-dessous :
Protégez-vous les mains lorsque vous manipulez du
                                                                    	
  
matériel en verre. N’utilisez pas du verre fissuré.    • PBS :
                                                         toxique par ingestion, inhalation et contact
PRODUITS CHIMIQUES                                       avec la peau.

                                                                                 	
  
N’utilisez jamais un flacon de réactifs sans
                                                                           	
         	
  
étiquette. Ne sentez, n’inhalez, ne goûtez et          • Tween 20 :
ne touchez jamais les produits chimiques. Ne             toxique par ingestion, inhalation et contact
pipetez jamais avec la bouche. Mettez des gants          avec la peau. Irritant.



Annexe II
Références des réactifs

NOM                                                    RÉFÉRENCE                  SOCIÉTÉ COMMERCIALE
PBS                                                    P4417-50TAB                        Sigma
Tween-20                                               P1379-100ML                        Sigma
CHK IGY, bagged (= ANTIGÈNE)                           1662406EDU                        BioRad
RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA)                         1662407EDU                        BioRad
GAR-HRP, bagged (= ANTICORPS SECONDAIRE)               1662408EDU                        BioRad
SUBSTRAT RÉVÉLATEUR                                    1662402EDU                        BioRad




                                                                                                                 20
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Chercheurs ayant collaboré avec les contenus : Laura Puyol, chercheuse au CRESIB, ISGlobal.

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Découvrez le vaccin contre le paludisme

  • 1. Découvrez le vaccin contre le paludisme Atelier d’expérimentation PROTOCOLE
  • 2. Introduction Le paludisme est considéré comme la maladie ventions sont menées à bien sous la forme de la plus importante du monde due à un parasite différentes mesures combinées comprenant et est responsable du décès de près de l’utilisation de moustiquaires imprégnées 800 000 personnes chaque année, en particulier d’insecticide, d’aérosols insecticides et de trai- d’enfants de moins de cinq ans et de femmes tements de prévention, ainsi que l’implantation enceintes. Selon l’Organisation mondiale de la de programmes éducatifs et d’interventions santé (OMS), près de 3 000 millions de personnes environnementales, entre autres. risquent de contracter l’infection, et 225 millions de cas de paludisme se sont produits dans le La communauté scientifique travaille inten- monde en 2010, dont 90 % ont eu lieu en Afrique. sément pour mettre au point un vaccin qui, associé aux mesures actuelles, pourrait contri- De nos jours, le paludisme est endémique dans buer de manière significative, selon les experts, plus de 100 pays localisés en Afrique subsa- à un meilleur contrôle du paludisme. Il existe harienne et dans les régions du sud de l’Asie, déjà actuellement un vaccin en phase d’étude d’Amérique latine et d’Océanie. Les derniers clinique, qui sera efficace dans 50 % des cas. rapports montrent que la moitié de la population mondiale vit dans des zones présentant un risque de contracter la maladie et où le paludisme n’a pas seulement des conséquences sur la santé de la population, mais contribue aussi à fragiliser davantage la situation économique de la zone. Cet atelier vous permettra d’étudier différents candidats-vaccins afin de décider Afin d’éradiquer la maladie dans les zones à quel candidat est le plus efficace. haut risque de transmission, plusieurs inter- Pays ou zones où a lieu la transmission du paludisme Pays ou zones à risque réduit de transmission du paludisme Source : Organisation mondiale de la santé (OMS). Données de 2009 2
  • 3. Comment se transmet le paludisme ? Pourquoi un vaccin contre le paludisme est-il nécessaire ? Le paludisme est une maladie infectieuse transmise par la piqûre d’un moustique du Historiquement, les vaccins ont constitué l’un genre Anopheles qui transmet des parasites des moyens les plus efficaces pour prévenir du genre Plasmodium et agit par conséquent des maladies et sauver des vies, en particulier comme un vecteur. Au sein de l’organisme dans le cas des maladies infectieuses. L’obten- humain, les parasites se multiplient dans le tion d’un vaccin partiellement efficace pourrait foie pour infecter ensuite les globules rouges. représenter la possibilité de sauver des cen- Parmi les symptômes du paludisme, les plus taines de milliers de vies. significatifs sont la fièvre, les maux de tête et les vomissements, survenant 10 à 15 jours L’obtention d’un vaccin impliquera une avan- après la piqûre du moustique. cée majeure. Il pourra être ajouté à l’arsenal actuel de mesures utilisées pour la prévention du paludisme, telles que les moustiquaires imprégnées d’insecticide ainsi que le traitement opportun et adéquat des cas diagnostiqués de Quelles sont les interventions paludisme. mises en place pour contrôler le paludisme ? Comme son efficacité à court terme sera Les principales interventions pour contrôler le partielle, il ne remplacera pas ces mesures, paludisme sont réparties en plusieurs groupes : mais les complètera, constituant ensemble une réponse complète pour la prévention du palu- disme. 1 Des stratégies contre le moustique ou vecteur, telles que la fumigation des espaces fermés à l’aide d’insecticides. d’ 2 Des stratégies permettant d’éviter le contact vecteur- hôte, comme l’utilisation de moustiquaires imprégnées d’insecticide. 3 Des stratégies contre le parasite. Ce dernier groupe comprend le traitement à base d’une association de médicaments mis au point à partir d’une molécule appelée artémisinine, qui est rapide et efficace. Un vaccin serait aussi une stratégie de contrôle du parasite qui, en combinaison avec d’autres stratégies, pourrait contribuer de manière significative à l’éradication du paludisme. 3
  • 4. Que faisons-nous à l’ISGLOBAL, l’Institut de santé globale de Barcelone ? L’Institut de santé globale de Barcelone 1. Étude des bases moléculaires de la mala- (ISGlobal) est une organisation à but non die, ainsi que des différentes réponses lucratif, dont l’objectif est d’améliorer la santé immunitaires. et le développement des populations les plus vulnérables par la génération, la gestion, la 2. Mise au point de nouveaux médicaments transmission et l’application de connaissances. et évaluation de leur sécurité, efficacité et Sa vision est un monde où nous puissions tous effectivité. être en bonne santé et il compte avec le soutien de l’œuvre sociale « la Caixa », entre autres 3. Évaluation des caractéristiques épidémio- institutions. logiques du paludisme au sein de différents environnements et des aspects sociocultu- L’un des piliers essentiels de l’ISGlobal est la rels qui l’entourent. recherche centrée sur les problèmes de santé affectant les populations les plus vulnérables 4. Analyse de l’efficacité de différents outils de et elle se déroule au Centre de recherche sur la prévention, ainsi que du rapport coût/efficacité santé internationale de Barcelone (CRESIB). La des interventions. recherche sur le paludisme effectuée au CRESIB est consacrée aux travaux suivants : Dans le cadre du point (4), le CRESIB réalise des études cliniques de sécurité, d’efficacité et d’effectivité des vaccins. Il participe actuelle- ment à la mise au point du vaccin RTS,S contre le paludisme, qui est efficace chez plus de 50 % des enfants infectés. Parallèlement, le travail des chercheurs du CRESIB porte sur l’identifi- cation de nouveaux candidats-vaccins. 4
  • 5. Objectifs de l’atelier 1 Dans le cadre de cet atelier, nous vous proposons de travailler sur différents candidats-vaccins contre le paludisme en cours d’étude au CRESIB, pour identifier le meilleur candidat. Les candidats-vaccins du CRESIB ont été obtenus à partir de protéines du parasite préalablement purifiées. Afin de procéder à leur étude, vous disposerez de plusieurs échantillons de sang de personnes résidant dans des zones affectées par le paludisme, qui ont déjà souffert de la maladie à plusieurs reprises et sont immunisées. Pour confirmer l’efficacité de nos candidats- vaccins, nous devons vérifier si les personnes immunisées ont développé une réponse contre ces candidats. Si une activation de la réponse immunitaire contre les protéines candidates 2 est observée, cela signifie qu’elles pourraient constituer de bons candidats-vaccins car elles pourraient aussi déclencher la réponse nécessaire à la protection contre de futures infections. 3 5
  • 6. Cet atelier a pour vocation de vous familiariser contre les candidats indique la capacité à avec l’une des techniques les plus utilisées dans déclencher une bonne réponse immunitaire et les laboratoires de biomédecine, la technique qu’il peut donc s’agir d’un bon candidat. ELISA (« Enzima Linked Immuno Sorbent Assay »). Grâce à cette technique, nous découvrirons en Il s’agit d’une analyse permettant de détecter particulier lequel des antigènes disponibles la présence d’anticorps dans les échantillons dans le laboratoire est un bon candidat-vaccin de sang. La présence d’anticorps spécifiques contre le paludisme. Principes fondamentaux de la technique ELISA Le principe fondamental de cette technique Pour mener à bien l’identification, nous utili- repose sur l’interaction du candidat-vaccin, ou sons des anticorps liés à une molécule appelée antigène (1), avec l’anticorps (2). Un anticorps enzyme (3) ayant la capacité de réagir avec une spécifique se lie à un antigène spécifique pour substance appelée substrat (4) que nous ajou- former un complexe antigène-anticorps exclusif. tons, et de produire une couleur. La technique ELISA nous permet de mettre Ainsi, si l’échantillon contient l’anticorps que nous en évidence la présence des anticorps et, par voulons détecter, celui-ci se lie à celui que nous conséquent, la formation de complexes anti- ajoutons lié à une enzyme, ce qui fait apparaître gène-anticorps lors du contact des échantillons un changement de couleur du substrat, nous indi- de sang avec les candidats-vaccins. quant de cette manière un résultat positif. Substrat Enzyme Anticorps Antigène 1. Antigène : toute substance étrangère susceptible de se lier de manière spécifique aux anticorps ou lymphocytes spé- cifiques et de déclencher une réponse immunitaire. En général, les antigènes ont un poids moléculaire élevé et sont normalement des protéines ou des polysaccharides. 2. Anticorps : protéines (immunoglobulines - Ig) du sérum générées en réponse à l’invasion de molécules étrangères dans l’organisme, soit par exposition naturelle à un antigène, soit par immunisation au moyen de vaccins. Ils ont la forme d’un Y et sont constitués de quatre chaînes polypeptidiques liées grâce à des liaisons disulfures intercaténaires. Les anticorps possèdent une région constante et une région variable. 3. Enzyme : protéine contribuant aux réactions spécifiques du métabolisme. 4. Substrat : solution contenant un composé sur lequel agira une enzyme. 6
  • 7. Organisation de l’atelier Afin de découvrir lequel des candidats-vac- des anticorps contre ceux-ci. cins ou antigènes est le plus efficace, nous Pour ce faire, l’expérience est divisée en analysons si les échantillons de sang de per- 3 étapes principales. sonnes immunisées contre le paludisme ont 1. LIAISON DES PROTÉINES CANDIDATES (OU ANTIGÈNES) À LA SURFACE DES PUITS La première étape consiste à fixer les protéines candidates faisant l’objet de l’étude sur un support solide. 2. FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS Nous ajoutons ensuite les échantillons de sang, plus précisément le sérum (correspondant aux échantillons de sang après extraction des cellules et des facteurs de la coagulation), et un anticorps marqué par une enzyme que nous appelons anticorps secondaire. Les échantillons de sang conte- nant l’anticorps à étudier présentent la formation de complexes antigène-anticorps, qui se lient à leur tour à l’anticorps marqué par l’enzyme. Sérum Anticorps des patients secondaire marqué par une enzyme 3. LECTURE DE LA RÉACTION Enfin, nous ajoutons le substrat de l’enzyme, qui, en présence du complexe antigène-anticorps, change de couleur. Nous pouvons ainsi savoir si les échantillons de sang contiennent l’anticorps à étudier et la quantité d’anticorps. Substrat de l’enzyme Résultats et conclusions Les résultats obtenus permettent de décider immunitaire plus intense et peut donc être le quel candidat-vaccin déclenche une réponse meilleur candidat. 7
  • 8. Équipement et matériel nécessaire Instruments et ustensiles de laboratoire Agitateur magnétique (1) Noyau magnétique et Micropipette (pour préparer le PBS-Tween) « extracteur de noyaux » de 20 à 200 µl (2) Éprouvette Flacon en verre de Chronomètre Entonnoir de 100 ml 250 ml Consommables Barrettes de 12 puits Pipettes Pasteur en Pointes pour micropipette d’ELISA et portoirs plastique graduées Papier absorbant Feutre permanent Gants, lunettes et blouse 1. Si vous ne disposez pas d’agitateurs magnétiques, vous pouvez acheter le PBS liquide 2. Si vous ne disposez pas de micropipettes, vous pouvez utiliser des pipettes Pasteur de petit volume 8
  • 9. Réactifs et échantillons Solution tampon PBS (3) Détergent Tween-20 (4) Eau distillée Anticorps secondaire A B C+ C- Candidats-vaccins Contrôles positifs Anticorps secondaire (antigènes) et négatifs (5) lié à une enzyme (peroxydase) Substrat 1 2 3 4 Substrat ou solution Échantillons de sérum de quatre personnes résidant révélatrice dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie 3. Permet de maintenir le pH de la solution grâce aux phosphates de sodium et de potassium. 4. Permet de prévenir des liaisons d’anticorps non spécifiques. 5. C+ : contient un mélange de sérums de personnes résidant dans des zones où le paludisme est endémique, qui sont immunisées contre la maladie. C- : mélange de sérums de personnes n’ayant jamais été exposées au paludisme. 9
  • 10. Procédures Pour déterminer la présence ou l’absence d’an- résidant dans des zones où le paludisme est ticorps spécifiques contre les deux antigènes endémique avec ces antigènes afin d’observer candidats-vaccins disponibles dans le labora- si des anticorps spécifiques contre nos anti- toire, nous mettons en contact le sang (plus gènes sont présents dans ces sérums. précisément le sérum) de différents patients 1 Liaison des antigènes à la surface des puits Les barrettes de micropuits sont recouvertes de La liaison de ces antigènes à la surface des candidats-vaccins (antigènes) à analyser pour puits se produit facilement car ces derniers découvrir s’il s’agit de bons candidats-vaccins sont constitués d’un plastique traité ayant une contre le paludisme. grande affinité pour lier des protéines. PROTOCOLE POUR LA LIAISON DES ANTIGÈNES À LA SURFACE DES PUITS 1 Annotez ensuite le contenu de chaque puits (contrôles, échantillons de sang et nom des antigènes à étudier). 2 Étiquetez les puits en marquant le lieu de dépôt de chaque échantillon. 10
  • 11. 3 Préparez une solution de lavage (PBS-Tween à 0,05 %). A B Mesurez 200 ml d’eau distillée à l’aide de l’éprouvette et complétez au volume avec Introduisez le noyau magnétique dans le la pipette Pasteur. Versez les 200 ml d’eau flacon et diluez dans l’eau une pastille de distillée dans le flacon à l’aide de l’entonnoir. PBS à l’aide de l’agitateur magnétique. C D Après dissolution de la pastille, procédez à l’extraction du noyau magnétique et ajoutez 100 µl de Tween-20 à l’aide d’une pipette Agitez bien le contenu du flacon en le Pasteur en plastique. retournant plusieurs fois. Remarque : La solution de lavage contient du PBS (phosphate buffer saline) permettant de maintenir les anticorps dans un environnement stable qui aide à la conservation de leur structure. Le Tween-20 est un détergent permettant d’éliminer les pro- téines liées de manière non spécifique. Il se lie aux parties du puits non recouvertes d’antigène, réduisant ainsi le bruit de fond. 11
  • 12. 4 5 Ajoutez les deux antigènes à étudier aux puits correspondants à l’aide de la micropipette (50 µl par puits). Il est important d’utiliser une pointe propre pour déposer les antigènes, afin d’éviter des contaminations. Laissez incuber pendant 5 minutes à température ambiante. 6 7 Lavez pour éliminer l’excès d’antigène non Éliminez les résidus d’antigène en lié à la barrette. Pour ce faire, remplissez retournant la barrette sur un papier les puits avec la solution de lavage à l’aide absorbant. d’une pipette Pasteur en plastique. 8 9 Éliminez la solution de lavage en retournant la barrette sur un papier absorbant. Répétez une fois les étapes 7 et 8. 12
  • 13. 2 Formation de complexes antigène-anticorps Au cours de cette étape, nous préparons par une enzyme appelée peroxydase. Comme d’abord le sérum des patients pour détecter la chaque anticorps primaire peut être lié à plus présence d’anticorps contre le candidat-vaccin. d’un anticorps secondaire, nous observerons Nous appelons anticorps primaires ces anti- une augmentation de la quantité de couleur corps que nous voulons analyser. Nous ajou- obtenue lors de l’étape trois. La technique sera tons ensuite un anticorps secondaire marqué ainsi plus sensible. Anticorps Sérum secondaire marqué des patients par une enzyme PROTOCOLE DE FORMATION DE COMPLEXES ANTIGÈNE-ANTICORPS 1 2 Ajoutez les contrôles positifs et négatifs Ajoutez les différents échantillons aux puits correspondants à l’aide de la de sérums de quatre personnes micropipette (50 µl par puits). résidant dans des zones où le Le contrôle positif (C+) contient un paludisme est endémique aux mélange de sérums de personnes résidant puits correspondants à l’aide de la dans des zones où le paludisme est micropipette (50 µl par puits). endémique, qui sont immunisées contre la maladie. Le contrôle négatif (C-) contient un mélange de sérums de personnes n’ayant jamais été exposées au paludisme. 13
  • 14. 3 4 Laissez incuber pendant 5 minutes à Éliminez l’excès d’échantillon par retournement température ambiante. de la barrette sur un papier absorbant. 5 6 Lavez tous les puits afin d’éliminer les anticorps n’ayant pas réagi avec les antigènes, qui sont par conséquent non spécifiques. Remplissez les puits avec la Éliminez la solution de lavage par solution de lavage à l’aide d’une pipette retournement de la barrette sur un Pasteur en plastique. papier absorbant. 7 8 Ajoutez l’anticorps secondaire lié à une enzyme à tous les puits à l’aide de la Répétez deux fois les étapes 5 et 6. micropipette (50 µl par puits). 14
  • 15. 9 10 Éliminez l’excès d’anticorps secondaire Laissez incuber pendant 5 minutes à par retournement de la barrette sur un température ambiante. papier absorbant. 11 12 Lavez les puits en les remplissant avec Éliminez la solution de lavage par la solution de lavage à l’aide d’une retournement de la barrette sur un pipette Pasteur en plastique. papier absorbant. 13 Répétez trois fois les deux étapes précédentes. 15
  • 16. 3 Lecture de la réaction À la fin du lavage pour éliminer toutes les molécules marquées non liées sous la forme de complexes antigène-anticorps, ajoutez le substrat enzymatique en solution, qui facilitera le changement de couleur. Substrat de l’enzyme PROTOCOLE DE LA LECTURE DE LA RÉACTION 1 2 Ajoutez le substrat de l’enzyme à Laissez incuber pendant 5 minutes au l’ensemble des puits à l’aide de la cours desquelles le substrat se lie à micropipette (50 µl par puits). l’enzyme pour faire apparaître la couleur à température ambiante. 16
  • 17. 3 Annotez les résultats sous la forme d’un graphique à barres. ANTIGÈNE 1 maximum Intensité minimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4 ANTIGÈNE 2 maximum Intensité minimum Échantillons C+ C- M1 M2 M3 M4 17
  • 18. Résultats et conclusions Interprétez et notez les résultats 1. Quel antigène parmi ceux que vous avez analysés est, selon vous, le meilleur candidat-vaccin ? Pensez-vous que les antigènes que vous avez analysés sont des bons candidats-vaccins ? Pourquoi ? 2. Quand une réaction est-elle positive ou négative ? Pourquoi ? 3. Pourquoi, selon vous, faut-il utiliser les contrôles ? 18
  • 19. 4. Quelle partie de l’anticorps primaire est reconnue par l’anticorps secondaire : la région constante ou la région variable ? Justifiez la réponse. 5. Que se passerait-il si les lavages n’étaient pas effectués avant l’ajout du substrat révélateur ? 6. Du sang des collègues de votre classe peut-il être utilisé pour déterminer si nos antigènes de laboratoire sont de bons candidats pour mettre au point un vaccin contre le paludisme ? Justifiez la réponse. 7. Pensez-vous que cette expérience ait démontré que le candidat sélectionné déclenche la réponse immunitaire ? Faut-il effectuer un autre type d’expérience en vue d’évaluer s’il est aussi capable de déclencher un autre type de réponse ? 19
  • 20. Annexe I PORT DES LUNETTES PORT DE LA BLOUSE PORT DES GANTS OBLIGATOIRE OBLIGATOIRE OBLIGATOIRE Consignes de sécurité INFORMEZ-VOUS et lavez-vous souvent les mains si vous utilisez Localisez les éléments de sécurité du labora- des produits toxiques ou corrosifs. N’approchez toire ou de l’espace prévu pour effectuer des pas des récipients contenant des réactifs d’une expériences (extincteurs, douches ou bain, flamme. Ne chauffez pas des liquides inflam- sorties, etc.). Veuillez lire attentivement les ins- mables. Transportez les flacons en les tenant tructions avant de commencer une expérience. par le fond, en aucun cas par l’ouverture. N’oubliez pas de lire les étiquettes de sécurité des réactifs et des appareils. ÉLIMINATION DES DÉCHETS Déposez dans des conteneurs prévus à cet effet UTILISEZ DES VÊTEMENTS ADÉQUATS et dûment identifiés le verre cassé, les réactifs Gants, blouse et lunettes de protection. toxiques, nocifs ou néfastes pour l’environ- nement et les déchets biologiques. Ne jetez RÈGLES GÉNÉRALES jamais des résidus solides dans l’évier. Il est interdit de fumer, de manger ou de boire dans le laboratoire ou l’espace prévu pour En cas d’accident, prévenez immédiatement effectuer des expériences. l’éducateur. Rappel : en cas de doute, veuillez Lavez-vous les mains avant de sortir du labora- consulter l’éducateur. toire. Travaillez de manière ordonnée, propre- ment et calmement. Si un produit se répand sur PRÉCAUTIONS SPÉCIFIQUES le sol ou sur la paillasse, nettoyez-le immédia- À PRENDRE LORS DE CET ATELIER tement. Nettoyez et rangez le matériel. N’utili- Au cours de cette pratique, vous devez manipuler sez jamais un équipement ou un appareil sans les réactifs en respectant les précautions cou- connaître parfaitement son fonctionnement. rantes prévues pour la manipulation des produits chimiques. Seuls les produits présentant les degrés MANIPULATION DU VERRE de danger suivants sont indiqués ci-dessous : Protégez-vous les mains lorsque vous manipulez du   matériel en verre. N’utilisez pas du verre fissuré. • PBS : toxique par ingestion, inhalation et contact PRODUITS CHIMIQUES avec la peau.   N’utilisez jamais un flacon de réactifs sans     étiquette. Ne sentez, n’inhalez, ne goûtez et • Tween 20 : ne touchez jamais les produits chimiques. Ne toxique par ingestion, inhalation et contact pipetez jamais avec la bouche. Mettez des gants avec la peau. Irritant. Annexe II Références des réactifs NOM RÉFÉRENCE SOCIÉTÉ COMMERCIALE PBS P4417-50TAB Sigma Tween-20 P1379-100ML Sigma CHK IGY, bagged (= ANTIGÈNE) 1662406EDU BioRad RB ANTI-CHK, bagged (= PLASMA) 1662407EDU BioRad GAR-HRP, bagged (= ANTICORPS SECONDAIRE) 1662408EDU BioRad SUBSTRAT RÉVÉLATEUR 1662402EDU BioRad 20
  • 21. Continuez vos recherches sur Xplore Health ! Chercheurs ayant collaboré avec les contenus : Laura Puyol, chercheuse au CRESIB, ISGlobal. MIS AU POINT PAR Cet ouvrage est sous une licence Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Unported de Creative Commons. Pour voir une copie de la licence, consultez le lien suivant : http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/