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Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011
UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’
évolution de la résistance de Plasmodium falciparum
aux médicaments antipaludiques
jerome.clain@parisdescartes.fr
histoire de la résistance aux antipaludiques
adapted from Ekland & Fidock, 2008
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques
ART-T
SE Asia
Ato/Pg-R
travellers
• pfcrt (3 SNPs)
• pfmdr1 (SNPs)
• pdhfr (3-4 SNPs)
• dhps (1-3 SNPs)
• pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP)
• vacuole digestive
• fonction inconnue
• cytoplasme
• synthèse d’ADN
• mitochondrie
• transfert d’e-
• combien d’origines de chimiorésistance ?
• comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?
1- brefs rappels de génétique des populations
2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine
3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)
les 2 échelles de l’évolution
• au sein d’1 espèce
• au sein/entre populations
• échelle : générations
• entre plusieurs espèces
• échelle : temps géologiques
mutation
migration
dérive génétique
sélection naturelle
évolution des populations
changement des fréquences alléliques au sein d’une population
génération 1
2N tirages
0.75
0.25
0.75
0.25
urne des gamètes
effectifs infinis
N individus diploïdes
♀ ♂
génération 2
Évolution si :
• mutation
• migration
• dérive génétique
• sélection naturelle
2 allèles
N individus diploïdes
marqueurs du polymorphisme génétique (1)
SNP : single nucleotide polymorphism
Mu et al. 2006
• ~ 1 SNP / 300 pdb
• ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000)
allèle sauvage :
allèles mutants :
5’-ATAACATGA-3’
ATAAAATGA ATAAGATGA
« délétère »
« désavantageux »
« neutre »
« bénéfique »
« avantageux »
5’-ATAATATGA-3’
• polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites
5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8
5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10
marqueurs moléculaires du polymorphisme (2)
- très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population
- neutres le plus souvent
dhfr
-5.3 -0.1-4.4kb
phénotype
sensible
S
S
S
S
S
S
10
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9
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11
13
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11
: microsatellite
: séquence codante
(TA)n (TAA)n (CG)n
diversité génétique et origine des mutations
dhfr
-5.3 -0.1-4.4kb
phénotype
résistant
sensible
S
S
S
S
S
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11
: séquences répétées en tandem (microsatellite)
: séquence codante
(TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108
apparition d’un allèle de résistance par mutation
sélection de l’allèle de résistance
10
8
9
9
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traitement
=
sélection
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
1. fréquence de l’allèle de résistance  : sélection directionnelle positive
2. effet « auto-stop » ou hitchhiking
3. déséquilibre de liaison
8
9
9
6
12
11
7
8
9
7
10
11
12
10
9
7
8
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13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
13 12 10
diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné
application 1 :
recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan
identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine
Wooton 2001, Nature
parasites résistants à la chloroquine
chromosomes
parasites sensibles à la chloroquine
Réductiondeladiversitéallélique
15
application 2 :
origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique
dhfr ts
51 59 108
wild type
triple mutant
N
I
C
R
S
N
> base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase
> origine unique en Asie du Sud Est
> triple mutant asiatique importé dans le sud
et l’est de l’Afrique
> probabilité élevée d’échec thérapeutique
1978
? généralisation à l’ensemble du continent africain ?
stratégie
allèles dhfr
• sauvage (WT) n = 75
• triple mutant n = 204
-0.1-3.9 51 59 108 +0.5 +1.5 kb
WT
triple mutant
N
I
C
R
S
N
-
-
-
-
-
-
-
-
dhfr ts
: microsatellite
: séquence codante
resistant wild-type
-3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5
FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 -
THAI - - IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 166 NCS 99 -
- 139 IRN - - - - IRN 107 - - - IRN - - 187 145 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93
- - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 -
- - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204
- - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204
- - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 -
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204
- - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 -
- - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 -
- 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204
- 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101
- - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204
- - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 -
- - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205
- - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 -
- - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204
- - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204
Maïga, 2007, J Infect Dis
-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfrFCM29
Thaï
application 3 :
origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil
(Ato-PG ou Malarone®)
• traitement et prévention des infections à P. falciparum
• Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1
• proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)
résistance à Ato-PG
0 2000 4000 6000 (pb)
coding
cox III
cox I cytb
4294a>c → Tyr268Ser
4294a>g → Tyr268Cys
• résistance à Ato
- base génétique simple
- 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N
- sensibilité in vitro à Ato :  x102-103
- perte de la synergie entre Ato et PG synergy
Musset 2007, Microb Inf
paradoxe de la résistance à Ato-PG
• traitement cher (35-60 €)
- pas/peu utilisé dans les zones d’endémies
• allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles
- donc probablement non transmis par le moustique
• échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !!
- résistance du parasite
- allèle mutant non détecté au début du traitement
? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de
résistance pfcytb268 ?
stratégie expérimentale
• 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268)
- Ato-PG (6)
- atovaquone seule (1)
• 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant
l’allèle mutée pfcytbY268)
• séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité
moléculaire autour du locus pfcytb268
0 2000 4000 6000 (pb)
cox III
cox I cytb
échantillon : CNR Paludisme (Paris, France)
analyses :
• génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)
Mitochondrial genome nucleotide position
cox3 cox1 cytb
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r
Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . -
R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T
R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . -
R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . -
R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . -
R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . -
R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . -
S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . -
S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . -
S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . -
S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . -
S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . -
S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . -
S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . -
S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . -
Musset , Mol Biol Evol 2007
relations entre les haplotypes mitochondriaux
minimum-spanning network
S8
R3
R6
R7
R2
S1
S4 S6
S5 S7
S2
S3
R5
: pfcytbY268SR
R4
R1
: pfcytbY268CR
• diversité génétique des sauvages et
des résistants comparables
• pas compatible avec une origine
unique et récente de la résistance
variations de séquence avant et après traitement
• 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec
• 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire
• 1 patient : D0 non collecté
Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite
1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5
6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4
8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5
4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4
Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C -
T
A
A
8
7
T
A
A
6
0
A
R
A
2
P
f
P
K
2
T
A
A
8
1
D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175
D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175
(length, bp)
D0 Déchéc
Ato-PG
interprétation des données
mutation
*
***
*
*
*
*
traitement
~ 105
~ 108-1012
reproduction
asexuée
*
*
• mutation se produit et est sélectionnée
chez les patients indépendamment
• multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG
• cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de
l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant
par le moustique
• Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone
d’endémie
conclusions sur la résistance à Ato-PG
évolution de la résistance aux antipaludiques
• origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs)
• sélection intense sur les populations
• migrations intra et intercontinentales
• échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites
chimiorésistants
• origines multiples pour Ato-PG
• échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de
novo (SP, CQ)
• signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées
dans les génomes de populations
- diminution de la diversité génétique
- différenciation génétique entre populations
CNR Paludisme
• Pr Jacques Le Bras
• Véronique Hubert
• Dr Sandrine Houzé
UMR216
• Pr Jacques Le Bras
• Dr Oumou Maïga
• Dr Lise Musset
• Emmanuelle Renard
• Dr Jérôme Clain
Collaborateurs
• Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako)
• Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM)
• Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte)
• Dr Agnès Aubouy (Gabon)
• Dr Sabah Omar (Kenya)

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Evolution de la résistance de Plasmodium falciparum aux médicaments antipaludiques

  • 1. Institut Pasteur de Madagascar, 29 mars 2011 UMR216 ‘Santé de la mère et de l’enfant face aux infections tropicales’ évolution de la résistance de Plasmodium falciparum aux médicaments antipaludiques jerome.clain@parisdescartes.fr
  • 2. histoire de la résistance aux antipaludiques adapted from Ekland & Fidock, 2008 ART-T SE Asia Ato/Pg-R travellers
  • 3. principaux gènes de résistance aux médicaments antipaludiques ART-T SE Asia Ato/Pg-R travellers • pfcrt (3 SNPs) • pfmdr1 (SNPs) • pdhfr (3-4 SNPs) • dhps (1-3 SNPs) • pfmdr1 (CNVs) • pfcytb (1 SNP) • vacuole digestive • fonction inconnue • cytoplasme • synthèse d’ADN • mitochondrie • transfert d’e-
  • 4. • combien d’origines de chimiorésistance ? • comment évoluent les allèles (gènes) de chimiorésistance ?
  • 5. 1- brefs rappels de génétique des populations 2- gène pfdhfr et origine de la résistance à la pyriméthamine 3- gène pfcytb et résistance à la Malarone (atovaquone-proguanil)
  • 6. les 2 échelles de l’évolution • au sein d’1 espèce • au sein/entre populations • échelle : générations • entre plusieurs espèces • échelle : temps géologiques mutation migration dérive génétique sélection naturelle
  • 7. évolution des populations changement des fréquences alléliques au sein d’une population génération 1 2N tirages 0.75 0.25 0.75 0.25 urne des gamètes effectifs infinis N individus diploïdes ♀ ♂ génération 2 Évolution si : • mutation • migration • dérive génétique • sélection naturelle 2 allèles N individus diploïdes
  • 8. marqueurs du polymorphisme génétique (1) SNP : single nucleotide polymorphism Mu et al. 2006 • ~ 1 SNP / 300 pdb • ~ 100 000 SNPs (objectif : 350 000) allèle sauvage : allèles mutants : 5’-ATAACATGA-3’ ATAAAATGA ATAAGATGA « délétère » « désavantageux » « neutre » « bénéfique » « avantageux » 5’-ATAATATGA-3’
  • 9. • polymorphismes de séquences répétées en tandem : microsatellites 5’-ATCTAGCACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)8 5’-ATCTAGCACACACACACACACACACATCCTG-3’ (CA)10 marqueurs moléculaires du polymorphisme (2) - très polymorphes : nombreux allèles différents dans une population - neutres le plus souvent
  • 10. dhfr -5.3 -0.1-4.4kb phénotype sensible S S S S S S 10 8 9 9 6 12 11 12 7 8 9 7 10 11 13 12 10 9 7 8 11 : microsatellite : séquence codante (TA)n (TAA)n (CG)n diversité génétique et origine des mutations
  • 11. dhfr -5.3 -0.1-4.4kb phénotype résistant sensible S S S S S 10 8 9 9 6 12 11 12 7 8 9 7 10 11 13 12 10 9 7 8 11 : séquences répétées en tandem (microsatellite) : séquence codante (TA)n (TAA)n (CG)n 51 59 108 apparition d’un allèle de résistance par mutation
  • 12. sélection de l’allèle de résistance 10 8 9 9 6 12 11 12 7 8 9 7 10 11 13 12 10 9 7 8 11 10 8 9 9 6 12 11 12 7 8 9 7 10 11 13 12 10 9 7 8 11 traitement = sélection 13 12 10 13 12 10 13 12 10 13 12 10 1. fréquence de l’allèle de résistance  : sélection directionnelle positive 2. effet « auto-stop » ou hitchhiking 3. déséquilibre de liaison
  • 13. 8 9 9 6 12 11 7 8 9 7 10 11 12 10 9 7 8 11 13 12 10 13 12 10 13 12 10 13 12 10 13 12 10 diversité réduite à proximité de l’allèle sélectionné
  • 14. application 1 : recherche de locus sélectionnés par approche genome-scan identification du gène pfcrt, déterminant de la résistance à la chloroquine Wooton 2001, Nature parasites résistants à la chloroquine chromosomes parasites sensibles à la chloroquine Réductiondeladiversitéallélique
  • 15. 15 application 2 : origine de la résistance à la pyrimethamine en Afrique dhfr ts 51 59 108 wild type triple mutant N I C R S N > base génétique : 3 SNPs dans le gène dihydrofolate reductase > origine unique en Asie du Sud Est > triple mutant asiatique importé dans le sud et l’est de l’Afrique > probabilité élevée d’échec thérapeutique 1978 ? généralisation à l’ensemble du continent africain ?
  • 16. stratégie allèles dhfr • sauvage (WT) n = 75 • triple mutant n = 204 -0.1-3.9 51 59 108 +0.5 +1.5 kb WT triple mutant N I C R S N - - - - - - - - dhfr ts : microsatellite : séquence codante
  • 17. resistant wild-type -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 -3,9 -0,1 dhfr +0,5 +1,5 FCM29 194 147 IRN 105 202 196 - IRN - - - - IRN - - 185 140 NCS 99 - THAI - - IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 166 NCS 99 - - 139 IRN - - - - IRN 107 - - - IRN - - 187 145 NCS 109 - - - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 190 127 NCS 93 - - IRN 107 - - - IRN 111 - - - IRN - - 191 127 NCS 109 - - - IRN 107 - - - IRN - - - - IRN - - 191 136 NCS 107 204 - - IRN 109 - - - IRN - - - - IRN - - 192 127 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 136 NCS 107 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 196 127 NCS 99 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 139 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 151 NCS 99 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 158 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 127 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 137 NCS 103 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 140 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 154 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 224 142 NCS 95 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 141 NCS 93 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 97 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 191 163 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 197 - NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 150 NCS 85 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 160 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 137 NCS 99 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 127 NCS 109 204 - - IRN - - 189 - IRN - - - IRN - - 207 137 NCS 103 - - - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 210 150 NCS 99 204 - - IRN - - - - IRN 103 - - - IRN - - 191 153 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN 95 - 201 127 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 146 NCS 97 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 156 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 202 147 NCS 85 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 140 NCS 97 204 - - IRN - - - - IRN - - 192 152 IRN 103 204 189 153 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - 196 - IRN - - 189 154 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 204 192 135 NCS 97 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS 107 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 135 NCS - 204 - - IRN - - 200 - IRN - - - - IRN - - 192 140 NCS 99 - - - IRN - - 202 - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 102 - - 154 IRN - - - 150 IRN - - - - IRN - - 192 154 NCS 103 204 - 154 IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 - NCS 101 - - IRN 103 - - - IRN - - - - IRN - - 202 139 NCS - 204 - - IRN - 204 - - IRN - - - - IRN - - 202 143 NCS 85 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 141 NCS 97 195 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 204 143 NCS - - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 206 139 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - 192 - IRN - - 206 146 NCS 99 - - - IRN 103 - - - IRN - - 202 - IRN - - 206 151 NCS 97 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN 107 - 208 135 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 210 137 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 127 NCS 111 205 - - IRN - - 151 IRN - - - - IRN - - - 139 NCS 99 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 187 143 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 188 162 NCS 103 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 192 144 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 140 NCS 99 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 198 149 NCS 93 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 200 144 NCS 85 204 - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 212 149 NCS - - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 214 127 NCS 99 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - - 150 NCS 95 - - - IRN - - - - IRN - - - - IRN - - 190 142 NCS 99 204 - - IRN - - - - IRN - - 191 127 NCS 111 204 Maïga, 2007, J Infect Dis -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr -3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfr-3.9 -0.1 +0.5 +1.5dhfrFCM29 Thaï
  • 18. application 3 : origine de la résistance à l’atovaquone + proguanil (Ato-PG ou Malarone®) • traitement et prévention des infections à P. falciparum • Ato : inhibe le complexe mitochondriale : cytochrome bc1 • proguanil (PG) : augmente l’activité de l’atovaquone (Ato)
  • 19. résistance à Ato-PG 0 2000 4000 6000 (pb) coding cox III cox I cytb 4294a>c → Tyr268Ser 4294a>g → Tyr268Cys • résistance à Ato - base génétique simple - 1 SNP mitochondrial : pfcytbY268S/C/N - sensibilité in vitro à Ato :  x102-103 - perte de la synergie entre Ato et PG synergy Musset 2007, Microb Inf
  • 20. paradoxe de la résistance à Ato-PG • traitement cher (35-60 €) - pas/peu utilisé dans les zones d’endémies • allèle de résistance pfcytb268 extrêmement rare dans populations naturelles - donc probablement non transmis par le moustique • échecs thérapeutiques chez les voyageurs : 0,1 - 1 % !! - résistance du parasite - allèle mutant non détecté au début du traitement ? ces échecs sont-ils dus à un seul ou différents allèles de résistance pfcytb268 ?
  • 21. stratégie expérimentale • 7 isolats provenant d’échecs thérapeutiques (portant l’allèle mutée pfcytb268) - Ato-PG (6) - atovaquone seule (1) • 28 isolats appariés provenant de succès thérapeutiques par Ato-PG (portant l’allèle mutée pfcytbY268) • séquençage du génome mitochondrial : analyse de la diversité moléculaire autour du locus pfcytb268 0 2000 4000 6000 (pb) cox III cox I cytb échantillon : CNR Paludisme (Paris, France) analyses : • génotypage de polymorphes nucléaires (microsatellites)
  • 22. Mitochondrial genome nucleotide position cox3 cox1 cytb 1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5 6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4 8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5 4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4 r r r n n s r i i i s s n n n s s i i r Haplotype Origin n A - - G T G A G T C C C A A G C A G C - R1 IVC 1 . - - . . . . . . . . . . G . . . . . - R2 IVC 1 . - - T . . T . . . . . . C . . . . T T R3 UPV 1 . - - . . . . . . . . T . C . . . . . - R4 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - R5 UPV 1 . - - . . . . . . . . . . C . . . . . - R6 GUI 1 . - - . . A . T . . . . . C . . G . . - R7 THA 1 . - - . . . . . C . . . . C . . . . . - S1 IVC/UPV/GUI 13 . - - . . . . . . . . . . . . . . . . - S2 IVC/UPV/GUI 9 . - - . . . . A . . . . . . . . . . . - S3 IVC 1 . - - . . . . C . . . . T . . . . . . - S4 UPV 1 . - - . C . . A . . . . . . . . . . . - S5 UPV 1 . - - . . . . A . . T . . . . T . . . - S6 GUI 1 . - - . . . . A . . . . . . . . . T . - S7 GUI 1 . A T . . . . A . . . . . . . . . . . - S8 GUI 1 G - - . . . . . . T . . . . . . . . . - Musset , Mol Biol Evol 2007
  • 23. relations entre les haplotypes mitochondriaux minimum-spanning network S8 R3 R6 R7 R2 S1 S4 S6 S5 S7 S2 S3 R5 : pfcytbY268SR R4 R1 : pfcytbY268CR • diversité génétique des sauvages et des résistants comparables • pas compatible avec une origine unique et récente de la résistance
  • 24. variations de séquence avant et après traitement • 5 patients : identité moléculaire parfaite entre D0 et Déchec • 1 patient : séquence D0 incomplète, identité nucléaire • 1 patient : D0 non collecté Mitochondrial genome nucleotide position Microsatellite 1 1 1 1 1 2 3 3 4 4 4 4 4 4 5 6 7 7 8 8 1 5 6 7 9 6 1 6 2 3 5 6 7 9 4 8 1 1 6 9 6 0 9 7 1 4 6 1 9 8 5 2 8 5 5 4 0 1 9 1 5 9 4 8 3 9 7 9 6 9 2 4 0 4 4 Time Hap A - - G T G A G T C C C A A G C A G C - T A A 8 7 T A A 6 0 A R A 2 P f P K 2 T A A 8 1 D22 R4 . - - . . . . . . . . . . G A . . . . - 80 71 98 165 175 D0 . - - . . . . . . . . . . . A . . . . - 80 71 98 165 175 (length, bp) D0 Déchéc Ato-PG
  • 25. interprétation des données mutation * *** * * * * traitement ~ 105 ~ 108-1012 reproduction asexuée * * • mutation se produit et est sélectionnée chez les patients indépendamment
  • 26. • multiples origines de l’allèle de résistance à Ato-PG • cas unique : observer en situation naturelle la phase initiale de l’évolution la résistance, avant la transmission de l’allèle mutant par le moustique • Ato-PG non recommandé pour un usage massif en zone d’endémie conclusions sur la résistance à Ato-PG
  • 27. évolution de la résistance aux antipaludiques • origines rares pour SP et CQ (≥ 3 SNPs) • sélection intense sur les populations • migrations intra et intercontinentales • échecs thérapeutiques liés à la transmission de parasites chimiorésistants • origines multiples pour Ato-PG • échecs thérapeutiques liés à la sélection de mutations de novo (SP, CQ) • signatures de sélection naturelle peuvent être recherchées dans les génomes de populations - diminution de la diversité génétique - différenciation génétique entre populations
  • 28. CNR Paludisme • Pr Jacques Le Bras • Véronique Hubert • Dr Sandrine Houzé UMR216 • Pr Jacques Le Bras • Dr Oumou Maïga • Dr Lise Musset • Emmanuelle Renard • Dr Jérôme Clain Collaborateurs • Dr Abdoulaye Djimdé (MRTC, Bamako) • Dr Milijaona Randrianarivelojosia (IPM) • Dr JF Lepère (Bandraboua, Mayotte) • Dr Agnès Aubouy (Gabon) • Dr Sabah Omar (Kenya)