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Par : S / Abdessemed
Fragilité osmotique
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1. But :
• La résistance globulaire montre le
comportement des globules rouges dans
différentes solutions hypotoniques, avec
ou sans incubations à 37°C pendant 24 h.
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2. Principe :
• L’hémolyse s’observe quand on dilue une
suspension des globules rouges dans une
solution hypotonique de chlorure de
sodium.
• Elle se produit lorsque la dilution
abaisse la teneur en électrolytes au
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• En milieu hypotonique, les globules
rouges suivent les lois de l’osmose. Les
globules rouges accroissent
progressivement leur volume ; cet
accroissement est du à la pénétration
des molécules d’eau, Cette pénétration
est telle que la membrane cellulaire se
rompt et que le contenu cellulaire se
répand dans le milieu ambiant.
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3. Matériels et réactifs :
• Sang veineux hépariné ou sang
défibriné : répartir dans deux tubes
stériles. un des deux tubes est maintenu
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• Témoin normal : sang d’un témoin normal
prélevé dans les mêmes conditions et en
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• Solution mère de chlorure de sodium
tamponnée : NaCl (90,0g),
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NaH2PO42H2O(2,43g).
Dissoudre et ramener le volume de 1000
ml avec de l’eau distillée. Cette solution
est stable pendant plusieurs mois à 4°C.
S/Abdessemed
• Solution fille de chlorure de sodium
tamponnée 1% : 20 ml de solution mère
de chlorure de sodium tamponnée à 10%
et 180 ml d’eau distillée.
S/Abdessemed
4. Technique sans incubation :
1. Préparer des dilutions du chlorure de sodium 1% :
Tube n° Ml de NaCl à
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distillée
Concentration
du NaCl en %
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0.50
0.55
0.60
0.65
0.75
0.85
1.00
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2) Etiqueter 14 nouveaux tubes et
transférer 5 ml de chaque dilution dans le
tube correspondant.
3) Ajouter 0,05 ml de sang de
l’échantillon hépariné ou défibriné à tester
.Dans une autre série de tubes. faire la
même chose avec le témoin normal. Il est
préférable d’utiliser une pipette
automatique.
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4) Mélanger chaque tube en le
renversant.
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pendant 30 min.
6) Mélanger les tubes et centrifuger à
200 tours/min pendant 5 min.
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7) Conserver le surnageant et lire au
spectrophotomètre a 540 nm. Régler la
densité optique à 0 avec le tube n° 14 ou 0%
d’hémolyse. Le tube n°1 représente 100%
d’hémolyse. Si la densité optique de
l’hémolyse totale dépasse 0,5, il est
recommandé de diluer les surnageant avec un
volume égal de solution à 0,10% de NaCl ou de
partir d’une dilution du sang de 1/200 (0,025
ml de sang sont ajoutés à 5 ml de solution
saline).
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8) Calculer le pourcentage d’hémolyse :
•
𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡é 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑢 𝑠𝑢𝑟𝑛𝑎𝑔𝑒𝑎𝑛𝑡 𝑥 100
𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡é 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑢 𝑠𝑢𝑟𝑛𝑎𝑔𝑒𝑎𝑛𝑡 𝑑𝑢 𝑡𝑢𝑏𝑒 𝑛°1
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reportés sur un graphique. Placer le
pourcentage d’hémolyse en ordonnée et le
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de sodium en abscisse. Faire une courbe
pour le témoin normal et une courbe pour
l’échantillon à tester.
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5. Technique avec incubation :
• Dans le test avec incubation, on laisse
incuber le sang immédiatement à 37 °C
pendant 24h avant d’exécuter le test.
On procède ensuite de la même manière
que dans la méthode sans incubation.
Cependant, l’incubation rend la méthode
plus sensible.
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• On observe une hémolyse plus grande
après incubation.
• La courbe de fragilité peut être
normale sur un échantillon testé
immédiatement et anormale si
l’échantillon est incubé pendant 24 h
avant d’être étudié.
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6. Causes d’erreur :
• Le prélèvement doit être effectué par
ponction franche.
• Le sang prélever sur oxalate, citrate ou
EDTA n’est pas recommandé, car ces
anticoagulants fausseraient les résultats
par un apport d’ions supplémentaires.
• Le témoin normal doit être prélevé et
testé de la même façon et en même temps
que l’échantillon du sujet.
S/Abdessemed
• Le pH du mélange de chlorure de sodium
et de sang doit être à 7,4
• La contamination bactérienne du sang au
cours de l’incubation de 24h à 37°C peut
produire de l’hémolyse et fausser les
résultats.
S/Abdessemed
7. Valeurs pathologiques :
• On trouve une augmentation de la
fragilité osmotique dans les anémies
hémolytiques et la sphérocytose
héréditaire, et une diminution de la
fragilité dans l’anémie par déficience en
fer, la thalassémie, la polyglobulie
essentielle et la drépanocytose.
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8. Valeurs normales :
Concentration du NaCl en
%
Pourcentage d’hémolyse
(test sans incubation)
Pourcentage d’hémolyse
(test avec incubation)
0.00
0.10
0.20
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.75
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1.00
100
100
100
97-100
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0
100
100
95-100
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75-100
65-100
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  • 1. S/AbdessemedS/Abdessemed Par : S / Abdessemed Fragilité osmotique
  • 2. S/Abdessemed 1. But : • La résistance globulaire montre le comportement des globules rouges dans différentes solutions hypotoniques, avec ou sans incubations à 37°C pendant 24 h.
  • 3. S/Abdessemed 2. Principe : • L’hémolyse s’observe quand on dilue une suspension des globules rouges dans une solution hypotonique de chlorure de sodium. • Elle se produit lorsque la dilution abaisse la teneur en électrolytes au dessous d’un certain seuil.
  • 4. S/Abdessemed • En milieu hypotonique, les globules rouges suivent les lois de l’osmose. Les globules rouges accroissent progressivement leur volume ; cet accroissement est du à la pénétration des molécules d’eau, Cette pénétration est telle que la membrane cellulaire se rompt et que le contenu cellulaire se répand dans le milieu ambiant. • En milieu hypertonique, la cellule va se rétracter par perte d’eau.
  • 5. S/Abdessemed 3. Matériels et réactifs : • Sang veineux hépariné ou sang défibriné : répartir dans deux tubes stériles. un des deux tubes est maintenu à 37°C pendant 24h. • Témoin normal : sang d’un témoin normal prélevé dans les mêmes conditions et en même temps que le sang à tester.
  • 6. S/Abdessemed • Solution mère de chlorure de sodium tamponnée : NaCl (90,0g), Na2HPO4 (13,65g) et NaH2PO42H2O(2,43g). Dissoudre et ramener le volume de 1000 ml avec de l’eau distillée. Cette solution est stable pendant plusieurs mois à 4°C.
  • 7. S/Abdessemed • Solution fille de chlorure de sodium tamponnée 1% : 20 ml de solution mère de chlorure de sodium tamponnée à 10% et 180 ml d’eau distillée.
  • 8. S/Abdessemed 4. Technique sans incubation : 1. Préparer des dilutions du chlorure de sodium 1% : Tube n° Ml de NaCl à 1% Ml d’eau distillée Concentration du NaCl en % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 0.0 1.0 2.0 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.5 8.5 10.0 10.0 9.0 8.0 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 2.5 1.5 0.0 0.00 0.10 0.20 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.75 0.85 1.00
  • 9. S/Abdessemed 2) Etiqueter 14 nouveaux tubes et transférer 5 ml de chaque dilution dans le tube correspondant. 3) Ajouter 0,05 ml de sang de l’échantillon hépariné ou défibriné à tester .Dans une autre série de tubes. faire la même chose avec le témoin normal. Il est préférable d’utiliser une pipette automatique.
  • 10. S/Abdessemed 4) Mélanger chaque tube en le renversant. 5) Laisser à la température de la pièce pendant 30 min. 6) Mélanger les tubes et centrifuger à 200 tours/min pendant 5 min.
  • 11. S/Abdessemed 7) Conserver le surnageant et lire au spectrophotomètre a 540 nm. Régler la densité optique à 0 avec le tube n° 14 ou 0% d’hémolyse. Le tube n°1 représente 100% d’hémolyse. Si la densité optique de l’hémolyse totale dépasse 0,5, il est recommandé de diluer les surnageant avec un volume égal de solution à 0,10% de NaCl ou de partir d’une dilution du sang de 1/200 (0,025 ml de sang sont ajoutés à 5 ml de solution saline).
  • 12. S/Abdessemed 8) Calculer le pourcentage d’hémolyse : • 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡é 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑢 𝑠𝑢𝑟𝑛𝑎𝑔𝑒𝑎𝑛𝑡 𝑥 100 𝑑𝑒𝑛𝑠𝑖𝑡é 𝑜𝑝𝑡𝑖𝑞𝑢𝑒 𝑑𝑢 𝑠𝑢𝑟𝑛𝑎𝑔𝑒𝑎𝑛𝑡 𝑑𝑢 𝑡𝑢𝑏𝑒 𝑛°1 9) Les résultats de ce test peuvent être reportés sur un graphique. Placer le pourcentage d’hémolyse en ordonnée et le pourcentage de concentration du chlorure de sodium en abscisse. Faire une courbe pour le témoin normal et une courbe pour l’échantillon à tester.
  • 13. S/Abdessemed 5. Technique avec incubation : • Dans le test avec incubation, on laisse incuber le sang immédiatement à 37 °C pendant 24h avant d’exécuter le test. On procède ensuite de la même manière que dans la méthode sans incubation. Cependant, l’incubation rend la méthode plus sensible.
  • 14. S/Abdessemed • On observe une hémolyse plus grande après incubation. • La courbe de fragilité peut être normale sur un échantillon testé immédiatement et anormale si l’échantillon est incubé pendant 24 h avant d’être étudié.
  • 15. S/Abdessemed 6. Causes d’erreur : • Le prélèvement doit être effectué par ponction franche. • Le sang prélever sur oxalate, citrate ou EDTA n’est pas recommandé, car ces anticoagulants fausseraient les résultats par un apport d’ions supplémentaires. • Le témoin normal doit être prélevé et testé de la même façon et en même temps que l’échantillon du sujet.
  • 16. S/Abdessemed • Le pH du mélange de chlorure de sodium et de sang doit être à 7,4 • La contamination bactérienne du sang au cours de l’incubation de 24h à 37°C peut produire de l’hémolyse et fausser les résultats.
  • 17. S/Abdessemed 7. Valeurs pathologiques : • On trouve une augmentation de la fragilité osmotique dans les anémies hémolytiques et la sphérocytose héréditaire, et une diminution de la fragilité dans l’anémie par déficience en fer, la thalassémie, la polyglobulie essentielle et la drépanocytose.
  • 18. S/Abdessemed 8. Valeurs normales : Concentration du NaCl en % Pourcentage d’hémolyse (test sans incubation) Pourcentage d’hémolyse (test avec incubation) 0.00 0.10 0.20 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.75 0.85 1.00 100 100 100 97-100 90-99 50-90 5-45 0-5 0 0 0 0 0 0 100 100 95-100 85-100 75-100 65-100 55-95 40-85 15-70 0-40 0-10 0 0 0