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Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene
Faculté des Sciences Biologiques
Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire
Groupe : 2
Master en
Génie-Biologique & Innovation Technologique
Réaliser par:
BENTALEB Kawther
BOULAHBEL Houria
BELATACHE AMINA
Proposé par :
Contrôle microbiologiques des
médicaments
Madame : OUSSEDIK
Le plan:
1/Introduction
2/Les techniques microbiologique
3/Contrôle microbiologique de l’ environnement
4/ Contrôle microbiologique des médicaments
5/ Application sur le contrôle microbiologique
des médicaments
6/Conclusion
Le médicament est l’un des produits de
consommations le plus délicat
C’est pourquoi la stabilité et la régularité de
ce produit est une exigence dans la
fabrication pharmaceutique , et pour
l’atteindre il faut une mise en place d’un
contrôle de la qualité soigneusement dirigé
par un système d’assurance qualité . parmi
ces contrôles on a le contrôle microbiologique
• afin d’appliquer le contrôle microbiologique
il faut d’abord savoir les différents origines
des contaminations accidentelles qui peuvent
toucher la santé des patients surtout lors du
mélanges des matières premières qui sont
résumé ci-dessous
Origine de contamination des produits
pharmaceutiques
Contamination par les surfaces et le matériel
Biocontamination d’origine humaine
Contamination par l’air
Contamination par l’eau
Matière premières
Conditions de fabrication
 Condition de stockage
Dans le but d’identifier toutes causes ou agent
nuisibles afin de réduire ou d’éliminer ces
contaminations pour assurer l’innocuité et la stabilité
du médicament pendant toute la durée de sa
validation des contrôles de qualité sont réaliser y
compris physico-chimique et microbiologique.
Est une série d’épreuves:
qualitatives (contrôle microbiologique ,toxicologique)
 de dosage (contrôle physico-chimique)
auxquelles doivent être soumis avant sa commercialisation tout
produit terminé et produit intermédiaire et matière première, suivant
les techniques décrites dans le dossier d’autorisation de mise sur le
marché par la pharmacopée afin de répondre aux normes prévues
Contrôle de la qualité:
défini les critères de pureté des matières
premières ou des préparation entrant
dans la fabrication des médicaments et
les méthodes d’essai et d’analyses à
utiliser pour assurer leur contrôle dans le
but d’unifier la composition des
médicaments et d’indiquer le mode de
préparation de certains médicaments
Pharmacopée européenne
Afin d’apprécier la qualité microbiologique d'un médicament
durant le procédé de fabrication des différents étapes sont
utiliser dans le but de rechercher et dénombrer dans les
différents échantillons prélevés les microorganismes suivant:
•Les bactéries aérobies viable totale: concerne tous les
microorganismes aptes a se multiplier a des températures
moyennes
•Les levures et moisissures: sont responsables de nombreux
phénomènes d'altération d'enzymes hydrolytiques(amylases,
protéases, lipases ,...)
•Les germes spécifiques « Staphylococcus aureus ,
Pseudomonas, E.coli , entérobactéries.
Analyse microbiologique
Techniques de microbiologie
Techniques de
microbiologie
Techniques de stérilisation
La stérilisation est une opération qui vise à détruire tous les
micro-organismes d'un objet de façon durable.
objectif
contrôler les micro-organismes.
prévenir une éventuelle contamination
Stérilisation par la
chaleur
Stérilisation par
gaz
Stérilisation par
action des
radiations
Stérilisation par
des agents
chimiques
Stérilisation par
filtration
A/ Stérilisation par la chaleur
I. Chaleur sèche
On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».
a/ Flambage
Le passage dans la flamme
(bec BUNSEN) de la
surface de matériel non
inflammable assure une
parfaite stérilisation. On
stérilise de cette façon les
fils de platine et les pipettes
Pasteur.
b/ Four Pasteur
C'est un four - étuve à air chaud et sec. Il
est utilisé pour la stérilisation de la
verrerie vide
La verrerie à stériliser doit être propre et
sèche, bouchée avec du coton et emballée
dans du papier solide.
Elle est alors disposée à l'intérieur du
four et subit un chauffage de :
- 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C
- 2 heures à 160°C.
Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans
l'étuve jusqu'à son refroidissement, puis
stocké à l'abri des poussières.
I. Chaleur humide
La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois
modalités:
la stérilisation à l’autoclave
La Pasteurisation
La Tyndallisation
I. Chaleur humide
la stérilisation à l’autoclave
Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un
laboratoire de microbiologie.
Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une
T° de 120°C pendant une durée qui varie en fonction du
milieu, de la température utilisée et du volume des
récipients.
Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les
endospores.
I. Chaleur humide
La Pasteurisation
la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides,
tuant des pathogènes mais pas forcément toutes les
bactéries. Les températures de la pasteurisation se
situent entre 75 à 80°C
Principe de la pasteurisation
I. Chaleur humide
La Tyndallisation
La tyndallisation est une série de 3 chauffages bref
à des températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci
afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de
germer pour les tuer au chauffage suivant.
Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait
par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C
pendant 15 minutes
B/ Stérilisation par filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide
à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm.
Les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le
filtre.
Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits
thermolabiles comme: certains acides aminés aromatiques,
vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne
partie des antibiotiques
Principe :
C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des
membranes poreuses
B/ Stérilisation par filtration
 La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».
 la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».
C/ Action des agents chimiques
I / Antiseptiques
-Tuent les cellules
vivantes,
microorganismes et
autres. Leur action
est quasi
instantannée. Ils
agissent à
l'intérieur de
l'organisme ou à sa
surface : teinture
d'iode, ,
permanganate de
potassium, eau
oxygénée
II / Désinfectants
- Empêche les
contaminations
humaines et
animales
- vapeurs ( formol,
gaz sulfureux, oxyde
d'éthylène )
- liquides ( phénols,
sulfate de cuivre, de
fer, eau de Javel,
permangante de
potassium )
-solide ( chaux vive )
III / Antibiotiques
Substances d'origine
naturelle ou
obtenues par
synthèse chimique.
On distingue :
- les antibiotiques
bactériostatiques qui
stoppent la
multiplication des
bactéries sans les
détruire
- les antibiotiques
bactéricides qui tuent
les bactéries
L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes
déterminées au sein d'une flore poly-microbienne.
C/ Action des radiations
La radio-stérilisation est opérée par
exposition du produit à un rayonnement
ionisant , le principe repose sur l’ionisation
et l’excitation des atomes des cellules et leur
milieu avec formation de radicaux libres ; la
rupture des liaisons protéiques altère les
acides nucléiques des bactéries.
E/ sterilisation par gaz
L’évolution des dispositifs médicaux et
l’utilisation de plus en plus répandue des
contenants en matière plastique (polymériques),
se qui nécessite de technique de stérilisation à
basse température efficace, facile à mettre en
œuvre , valable autant pour le petit matériel que
des grands volumes (locaux).
Techniques de
microbiologie
Techniques d’ensemensement
L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un
milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une
pipette Pasteur.
.
A / Ensemencement avec une anse: B/ ensemencement avec la pipette Pasteur
Les milieux de culture
Les milieux
d’enrichissement:
permettant de
favoriser la croissance
d’une espèce en faible
quantité dans un
échantillon.
les milieux
d’isolement:
permettant la
croissance de plusieurs
espèces bactériennes
les milieux sélectifs:
favorisant la
croissance d’un type
bactérien particulier
tout en inhibant celle
des autres types
bactériens.
Les milieux de cultures les souches Température
d’incubation
Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux 35°C
Sabouraud levures et moisissures 25°C
Mac Conkey Escherichia coli 35°C
Vogel –johnson Staphylococcus aureus 35°C
Cetrimide Pseudomonas aeruginosa 35°C
Gélose agar lactosée ou
saccharosée
Salmonella 35°C
On distingue plusieurs types de milieux de culture selon
leur fonction
A / Ensemencement avec une anse:
- flamber l’ouverture du tube
- stériliser l’anse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser
refroidir dans la zone stérile.
- prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage :
. repiquage sur milieu solide :
repiquer en déplaçant en zig zag
l’aiguille sur la surface de l’agar, du
fond du tube vers l’ouverture, en
prenant soin de ne pas érafler la
gélose
. repiquage dans un milieu liquide :
repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur
de la boucle
- repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en la portant au rouge. L’aiguille est
prête pour un nouvel ensemencement .
flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher
B/ ensemencement avec la
pipette Pasteur :
Les manipulations se différencient des précédentes par
quelques détails :
- la pipette est passée rapidement dans la flamme.
- l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.
- on aspire les bouillons de culture
- on souffle pour ensemencer dans le tube stérile.
- la pipette ne sert qu'une fois.
Techniques de
microbiologie
Techniques d’isolement
Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire
une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées :
1/ La méthode des stries 2/ La méthode des dilutions
1/ La méthode des stries
- porter l'anse au rouge
dans la flamme du bec, la
laisser refroidir dans la
zone stérile et avec l'autre
main entrouvrir la boite de
culture ( solide ) ou le tube (
liquide )
prélever une colonie ou
une goutte de suspension
avec l'anse, refermer la
boite ou le tube et prendre
la boite vierge
. Flamber l'anse, la
laisser refroidir et repartir
perpendiculairement à la
direction
- les boites de Pétri sont mises
en position renversée à l'étuve
à 30°C. Observer après 24 à 48
heures selon le cas ( la
position renversée permet à
l'eau de condensation de
s'évaporer
2/ La méthode des dilutions
Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :
- les dilutions sont
faites dans de l'eau
distillée ou dans un
liquide physiologique
de type Ringer
- numéroter des tubes
à essai de 1 à 10,
chaque tube contient
1 ml de liquide de
dilution
- homogénéiser par
aspirations
successives et souffler
la dilution 1, en
prélever 0.1 ml et
verser dans le tube 2.
- dans le tube 1, à l'aide
d'une pipette stérile,
ajouter 0.1 ml de la
suspension fournie,
rincer la pipette trois
fois.
Ainsi de suite jusqu'à l'obtention
de la dilution n°10.
I/Contrôle
microbiologique
environnemental
le contrôle d’environnement est un domaine qui prend de plus en plus d’importance
du fait de son lien avec une éventuelle contamination des produits pharmaceutiques
OBJECTIF
Identifier les voies de contamination possibles
mettre en place des actions correctives avant que le
produit ne soit contaminé
Contrôle microbiologique
environnemental
Personnel
Air et Eau
Locaux
Air et Eau
1/ Air :
 Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement
dans des zones à atmosphères contrôlées .
 Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de
traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie
But : Estimer la charge microbienne de l’air, à des différents lieux définis du
local.
Principe: La méthode utilisée est dite la méthode statique ou de
sédimentation
Mode opératoire :
l’exposition des boites de Pétri
ouvertes renfermant un milieu de
culture standard (gélose nutritive)
pendant 4 heures
incuber à 37°C pendant 48 heures
dénombrement des particules donnant
naissance à des colonies sédimentées
Air et Eau
1/ Air :
 Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement
dans des zones à atmosphères contrôlées .
 Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de
traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie
2/ Eau (concernant surtout les médicaments
obligatoirement stériles):
 Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements
capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-
organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre)
par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose
inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression,
permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en
fonction de leur taille.
2/ Eau (concernant surtout les médicaments
obligatoirement stériles):
 Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements
capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-
organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre)
par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose
inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression,
permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en
fonction de leur taille.
Personnel
Les tenues doivent être stériles, donc conçues pour ne libérer ni fibres ni particules et
doivent retenir les particules émises par l’opérateur
Tenue
Cagoule qui renferme
totalement les
cheveux
Masque
couvre le
bas du
visage
Lunette qui raccorde la
cagoule et le masque
Combinaison
Serrée
complétées par
des bottes
But : estimer la charge microbienne retrouvée sur les mains gantées des opérateurs.
Principe : méthode des empreintes digitales.
faire une empreinte des cinq doigts pour les
deux mains (droite, gauche et, chacune dans
une boite), sur un milieu gélosé nutritif coulé
sur boite de Pétri.
Incuber à 37°C pendant 48 heures
Expression des résultats : en UFC/ 5 doigts.
Locaux
situés dans un environnement qui représente un risque minimum de contamination
Dans les zones à atmosphère contrôlé (ZAC) , les surfaces doivent être
Lisse
imperméable
sans fissures
Réduire l’accumulation des
microorganismes
Utilisation des produits de nettoyage et désinfectant stériles pour éviter
même le développement des souches résistantes
But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées.
But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées
. Principe: technique de l’écouvillonnage qui réside à des prélèvements à l’aide d’un
écouvillon.
Humidification de l’extrémité de l’écouvillon par l’eau distillée,
•Rouler doucement l’écouvillon sur la surface à contrôler soit 25 cm2. ,
•Réaliser des suspensions bactériennes de 5 ml,
•Ensemencer un inoculum de 1 ml dans deux boites de Pétri pour chaque écouvillon,
•Incuber à 32°C pendant 5 jours.
Mode opératoire :
Lecture des résultats : en UFC par boite.
On distingue 2 catégories d'enceinte stérile :
1.Les enceintes physiquement fermées dénommées isolateurs
2.Les enceintes physiquement ouvertes à flux d'air laminaire dénommées hottes à flux d'air laminaire
prélèvements à l’aide
d’un écouvillon : une
petite brosse
cylindrique qui sert à
nettoyer l'intérieur
des récipients à col
étroit
Les hottes à flux d'air laminaire
Les hottes à flux d'air laminaire sont des enceintes qui sont traversées par un flux
d'air qui se déplace à une vitesse uniforme suivant des lignes parallèles.
Le principe
Le principe des hottes à flux d'air laminaire consiste à absorber de l'air et à le filtrer
avec un filtre HEPA avant de le projeter sur la paillasse de travail. Ce flux d'air
entraîne un effet piston qui repousse les micro-organismes.
Le rôle de la filtration est double :
- apporter de l'air propre dans la zone de travail.
- éviter l'élimination de produits dangereux dans l'environnement
L’isotechnie
 Elle consiste à créer une barrière physique
entre l’opérateur, qui se trouve dans une zone
non-stérile, et les équipements dans lesquels se
déroulent les étapes critiques du remplissage et
du bouchage des médicaments (injectables
surtout.)
 Les manipulations s’effectuent de l’extérieur,
à travers :
gants étanches
fixés à la paroi
demi-scaphandre.
L’isotéchnie a été conçue pour réduire sensiblement
les risques de contamination de l’environnement des
produits fabriqués de façon aseptique.
1 / La filtration sur membrane
une méthode efficace d’analyse de la contamination microbienne ou particulaire
des solutions aqueuses. Elle est largement utilisée pour :
Le comptage
des bactéries
hétérotrophes
Le comptage
des
champignons
(levures et
moisissures)
L’isolation de
E. coli,
Pseudomonas sp.,
Lactobacillus sp.
et
autres
Principe :
C’est une technique de
séparation non dénaturante à
travers des membranes
poreuses
 La phase traversant la
membrane Est appelée
« Perméat ».
 la phase retenue par la
membrane est
appelée« Rétentat ».
Produits obligatoirement stériles :consiste à vérifier l’absence de
contamination bactérienne dans les substances ,les préparations et les
produits qui doivent être stériles selon la pharmacopée.
Produits non obligatoirement stériles :il s’agit du dénombrement
des germes aérobies viables totaux (les bactéries ,levures et
moisissures ) et de rechercher des micro-organismes spécifiés :
Escherichia coli,Pseudomonas
On a deux types de contrôles:
Médicaments
obligatoirement stérile
Procédure :
A/ Filtrez 100 mL de l’échantillon avec une
membrane Pall à l’aide d’un entonnoir de filtration
et d’un système à vide.
Tous les organismes présents dans le
prélèvement se concentrent à la surface de la
membrane. Membranes
Entonnoirs a usage unique
B / L’échantillon est versé dans l’entonnoir et
si nécessaire, la membrane est rincée une
fois ou plusieurs fois pour éliminer les
substances inhibitrices qui étaient
présents dans l'échantillon
C/ Placez le filtre à membrane dans
la boîte de Pétri préparée. Procédez à
l’incubation à la température appropriée
pendant le délai prévu.
D /Comptez les colonies sous un
grossissement 10-15x et identifiez
le type de contamination.
Avantages
Isoler et de dénombrer les micro-
organismes, tout en indiquant s’ils
sont présents ou absents en à peine
24 heures.
Permet de
concentrer de
grands volumes
d’échantillons.
Autorise
l’isolation et le
comptage de
colonies
discrètes.
Réduit le délai de préparation par
rapport aux autres
méthodes traditionnelles
2 / Ensemencement par inclusion :
Rappel:
L’ensemencement est une opération qui
consiste à déposer dans un milieu de culture
stérile des germes prélevés à partir d’une culture
mère (milieu naturel) ou culture pure , le
transfert est généralement effectué avec :
• Un fil à ensemencer.
• L’anse de platine.
• Une pipette Pasteur.
Milieu gélosé
fondu
solidification
Echantillon dilué
Incubation
Lecture des UFC
3/ Ensemencement en stries :
C’est une méthode classique d’isolement
par dissémination des germes microbiens
aérobies (bactéries et levures) à la
surface des milieux de culture solides.
Le mélange microbien est transféré au
bord d’une boite de Pétri gélosée à l’aide
d’une boucle d’inoculation ou d’un
écouvillon et étalé à la surface d’une boite
en suivant un motif défini
4/ Méthode NPP du nombre le plus probable:
But : estimation du
nombre de bactéries dans
des échantillons solides
ou liquides contaminés
difficilement analysé par
la filtration sur membrane
Principe :
Témoin Echantillon dilué en série + milieu de culture
Incubation 24h à 44,5°C(Croissance des bactéries )
Noter le nombre de tubes positifs selon les tables du
NPP basées sur la loi du Poisson.
Après ces différentes techniques effectuées
sur les matières premières et les produits
semi-fini , on procède pour une deuxième
fois à une filtration sur membrane mais
réalisée sur le produit fini et qu’elle est suivie
d’un ensemencement direct
5 / Ensemencement direct
Inoculum S’il ya des
troubles
Repiquage sur
milieu frais
Incubation au
moins 4 jours
24 jours
6/ Test de recherche des microorganismes
Lesgermes totaux:
Concerne tous les micro-organismes capable de se multiplier à des températures
moyennes
les germesfongiques
Concerne tous les micro-organismes capables de secréter des enzymes
hydrolytiques provoquant plusieurs phénomènes d’altération.
Entérobactéries
Escherichia coli
Staphylococcus
aureus
Les salmonelles
LES MICROORGANISMESSPECIFIQUES:
Dans le but de rechercher ces différents microorganismes , on effectue des
repiquages c’est-à-dire des transplantations des cultures pures sur des milieux de
culture neufs spécifiques pour chaque microorganisme:
Les milieux de cultures les souches
Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux
Sabouraud levures et moisissures
Bouillon Mac Conkey
Agar Mac Conkey
Escherichia coli
Vogel –johnson
Mannitol Salt Agar
Staphylococcus aureus
Agar Cetrimide Pseudomonas aeruginosa
Gélose agar lactosée ou
saccharosée
bouillon soja RVS
Salmonella spp
7 /Lecture des colonies :
Type de germes
dénombrés
Observation des colonies
Avant utilisation Après utilisation
Germe
fongique
(Gélose Sabouraud)
E. Coli
(Gélose Mac Conkey)
Pseudomonas
aeruginosa
(Gélose au Cétrimide)
Salmonella
spp
(Gélose SS)
Staphylococcus
aureus
(Gélose Vogel-
johnson)
Les repiquages effectués sont suivis d’un dénombrement par la technique du
nombre le plus probable
7/ Recherche de pyrogènes :
 C’est un test obligatoire pour tous les solutés injectables dont le
volume de conditionnement est supérieur ou égal à 15 ml,
Des microorganismes susceptibles de
provoquer des réactions d’hyperthermie
à l’injection le plus souvent par les
endotoxines bactériennes des bactéries
Gram négatif
 Les pyrogènes sont recherchés dans l’eau , les produits intermédiaires
et les produits finis en effectuant deux tests :
Essai in
vivo
Essai in
vitro
1. Injection d’une solution de NaCl
0.9% apyrogène 1 à 3 jours afin
d’exclure les animaux ayant une
variation de température trop
importante.
2. Injection durant 4 minutes dans la
veine marginale de l’oreille du
liquide préchauffé à 38.5°C.
Utilise un lysat de cellules
sanguines du crabe limulus
(arthropode), qui a la propriété
de floculer (coaguler) en
présence d’endotoxines de
bactéries à Gram négatif.
Les symptômes de
pyrogénicité
 Frissons intenses
 Cyanose,
Un pouls rapide accompagné
de dyspnée
Des douleurs lombaires
Donc : l’apyrogénicité définie comme l’absence
respective de micro-organismes viables et de
substances pyrogènes, constitue un critère de qualité
microbiologique et de sécurité pour l’administration des
médicaments ou l’utilisation des dispositifs médicaux
chez l’homme.
Le contrôle de ce paramètre, en terme d’objectif, de
conditions opératoires et d’interprétation des résultats,
est fixé par la Pharmacopée pour les médicaments et
normes pour les dispositifs médicaux.
Application sur le contrôle
microbiologique de médicament
Application N°1
Contrôle microbiologique,
d’une suspension buvable
pour enfant, obligatoirement
stérile,
anti-inflammatoire non
stéroïdien
« ALGIFEN® » durant sa
production
et son conditionnement.
Forme et présentation
ALGIFEN® est une
suspension buvable
réservée aux nourrissons
et à l’enfant de 3 à 12 ans
dosée à 20 mg/ml dans
des flacons de 125ml avec
un bouchon doseur gradué
en ml ou pipette pour
administration orale
graduée en Kg .La
posologie usuelle est de
20 à 30 mg/kg 3 à 4 fois
par jour.
Antalgique
AntipyrétiqueAnti-
inflammatoire
Traitement symptomatique des
affections douloureuses et/ou fébriles
ALGIFENE
Ibuprofèn
e Polysorba
te 80
Acide
citrique
anhydre
Sorbitol
70%
Eau
purifiée
Gomme
xanthane
Saccharose
Glycérol
Benzoate
de sodium
Acésulfam
e
potassique
Rouge de
cochenille
A
Edétate
disodique
Arôme
banane
Arôme
Fraise
vanille
Composition chimique du médicament :
Dénombrement
des bactéries
viables totales
Dénombrement
des levures et
moisissures
Bactéries viables totales. Levures et moisissures
2 lots au début du conditionnement 2 lots au milieu du conditionnement 1 lot à la fin du conditionnement
Dilution dans 90mL d’une solution tampon peptonée au chlorure de sodium
Milieu TSA
Incubation à 30-35°C pdt
5jrs
Milieu Sabouraud
Incubation à 20-25°C
pdt 5jrs
Pré-enrichissement
sur 90 mL
de bouillon peptoné
à la caséine de Soja.
Incubation à 37°C pdt 48h
Un enrichissement sur bouillon
MacConkey à44°C pdt 24h
puis un isolement sur gélose de
MacConkey.
 le médicament ALGIFEN® est de bonne qualité tout au long de
son processus de fabrication, et est définis comme étant prêt à la
consommation pour le plus grand bonheur des parents,
 ALGIFEN® présente l’avantage d’être commercialisé à
moindre cout, de fait qu’il soit localement produit, ce qui
diminue les charges.
Conclusion2:
Application N°2
Présentation de médicament :
Classe thérapeutique:
le Maalox® appartient à la classe des antiacides et pansements gasto-intestinaux.
Nom commercial: Maalox®.
Principes actifs : Hydroxyde de magnésium (E527), Hydroxyde
d'aluminium.
Laboratoire : Sanofi-Aventis France.
DCI: Hydroxyde d’aluminium et hydroxyde de magnésium.
le MAALOX est un médicament qui traite les
manifestations douloureuses de l'hyperacidité des
voies digestives supérieures, la gastrite, l'ulcère
gastroduodénal, l'hernie hiatale et l' oesophagite. La
production de la suspension MAALOX s'effectue à
partir d'une dilution à l'eau purifiée de sa forme
primaire le « PREMIX » auquel on rajoute aussi de
l'eau déminéralisée.
Présentation de médicament :
Ce médicament existe sous 4 formes :
comprimé
suspension buvable
(flacon de 250ml)
Suspension buvable en flacon de 250ml goût
menthe.
Suspension buvable en sachets-dose de 20 x 4 ,3 ml
goût citron
Comprimés à croquer goût menthe.
Comprimés à croquer sans sucre goût citron.
Composition de Maalox®:
PA
-hydroxyde de magnésium (10g/flacon)
-hydroxyde d'aluminium (8.75 g/f)
Excipients
l'acide chlorhydrique concentré
-une huile essentielle de menthe poivrée
-sorbitol concentré à 70%
-D- mannitol
-Saccharine sodique
Conservateurs parahydroxybenzoate de méthyle (Nipagine)
-parahydroxybenzoate de propyle (Nipazol)
Analyse microbiologique de Maalox®:
Analyse microbiologique de Maalox®:
La recherche
et le
dénombrement:
Concerne tous les
micro-organismes aptes
à se multiplier à des
températures moyennes
Sont responsables de
nombreux phénomènes
d’altération dus à leur
pouvoir de sécrétion
d’enzymes hydrolytiques
(amylases, protéases,
lipases, etc.)
Analyse microbiologique de Maalox®:
Escherichia coli
Elle représente l'une des causes majeures des diarrhées
aigues et des infections intestinales.
Entérobactéries Constituent un grand groupe de bactéries ayant une forte
similitude, certaines sont dangereuses et provoquent des
problèmes sanitaires d'où l'importance de leur recherche
Staphylococcus
aureus
Recherchée systématiquement dans le produit fini du
fait de l'excrétion de nombreuses substances toxiques
(enterotoxines, hémolysine) provoquant des infections
graves
Les salmonelles
Sont des agents de Gastro-entérites, elles sont parmi les
principales bactéries responsables de toxi-infection.
La recherche de 4 types de germes spécifiés suivants:
Air
Préparation des boites de pétri
TSA
Sabouraud
Tergitol
Germes totaux Germes
fongiques
Germes
pathogènes
30-35° C pendant 5 J 22-25° C pendant 24h à 48h 30-35° C pendant 24h à 48h
Ramener les boites à la T° du labo et vérifier l’absence de
croissance microbienne
Exposition des boites
Pendant 4 h
Incubation à 37° pdt 3jrs
+ 15 ml de milieu sabouraud à 45°C,
laisser refroidir à 25°C pendant 5 J
+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser
refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J
1 ml dans chaque boite de pétri
10 ml de la suspension à analyser (prémix)
90 ml
Tampon
peptoné
e au
NaCl
Dénombrement des
germes totaux
Dénombrement des
germes fongiques
Ensemencement en masse
Prémix
10 ml de l’eau à analyser
90 ml
Tampon
peptonée
au NaCl
Dénombrement des germes
totaux
Dénombrement de P.aeruginosa
Déposer la membrane sur milieu TSA
37°C, 48h
Bouillon BCS
Gélose au cétrimide
entonnoir
Mb filtrante
0,45µm
30°c, 5 jrs
Étalement de 1ml
10ml
Eau purifiée
Introduire 200ml d’une solution tampon pH 7,2 et boucher à l’aide d’un bouchon cardé
Flacons à tester
Dénombrement des germes
totaux
Recherche des germes pathogène
Déposer la mb sur milieu Mac Conkey Déposer la mb sur milieu TSA
Laisser en contact 1 à 2 h
Flacons
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
90ml
Tampon
phosphater
1 ml dans chaque boite
Dénombrement des
germes totaux
Dénombrement des
germes fongiques
Dénombrement
de Staph.aureus
+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser
refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J
+ 15 ml de milieu
sabouraud incuber à
25°C pendant 5 J
+ Vogel Jonhson
incuber à 37°C
pendant 3 J
Maalox® et eaux de rinçage
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
1 ml
Gélose Mac-Conkey.
incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose au cétrimide.
incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose SS. incuber à
37°C pendant 48 h
Pour la recherche
de E.Coli
Pour la recherche
de Salmonella sp
Pour la recherche
de P.aeruginosa
10 ml de la suspension à analyser (Maalox)
1 ml
Gélose Mac-Conkey.
incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose au cétrimide.
incuber à 37°C pendant
48 h
Gélose SS. incuber à
37°C pendant 48 h
Pour la recherche
de E.Coli
Pour la recherche
de Salmonella sp
Pour la recherche
de P.aeruginosa
Dénombrement de Pseudomonas aeruginosa sur
Gélose au Cétrimide
Avant utilisation Après utilisation
Les colonies sont verdâtres et
fluorescentes.
Dénombrement de Salmonella sur
Gélose SS
les colonies sont transparentes
avec centre noir.
Avant utilisation Après utilisation
Dénombrement de Staphylococcus aureus sur
Gélose Vogel-johnson
les colonies sont noires avec
un halo jaune.
Les résultats sont exprimés en Unités Formant Colonie par millilitre ou par
gramme (UFC/ml ou /g).
le comptage peut s’effectuer soit par comparaison visuelle à un abaque fourni par
le fabricant, soit par compteur laser (ceci nécessitant un milieu non opaque).
Le contrôle Les normes
L’air Germes totaux ≤ 10 2 UFC/cm2
Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/cm2
(pharmacopée Européenne 2002)
Le prémix « PA + excipients » Germes totaux ≤ 10 2 UFC/g
Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/g
Germes pathogènes :
 S.aureus: Abs
 P.aeruginosa: Abs
 E.coli: Abs
 Salmonella.sp: Abs
L’eau purifiée Germes totaux ≤ 10 2 UFC/ml
P.aeruginosa : Abs/10ml
(pharmacopée Européenne 2002)
Les flacons Germes totaux ≤ 10 3UFC/ml
Germes pathogènes : Abs/10ml
(pharmacopée Européenne 1997)
Maalox® et eaux de rinçage Germes totaux ≤ 10 2 UFC/ml
Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/ml
Germes pathogènes : Abs
Résultats:
une très bonne qualité microbiologique révélée par l’absence
même de la flore fongique mais étant donné que le Maalox®
est regroupé dans la catégorie des préparations
pharmaceutiques non obligatoirement stériles, on peut noter la
présence de quelques germes totaux et fongiques a condition
que cela reste toujours dans les normes exigées par le
partenaire.
Si Maalox® reste conforme aux normes tout au long de son
processus de fabrication, à partir des matières premières
(prémix, eau purifiée et eau oxygénée) et articles de
conditionnement jusqu’au produit fini, défini comme étant
prêt à la consommation.
Application N° 3
Notre choix s’est porté sur un médicament non
obligatoirement stérile « Mycocide®», qui est
une pommade dermique hydrophobe
présentée sous forme d’un tube de 15g. ce
médicament est une association de trois
principes actifs et de deux excipients (tableau).
Vu sa composition, « Mycocide ®» est
indiquée pour le traitement des dermatoses
corticosensibles sur infectées par un germe
sensible à la néomycine et/ou par un Candida.
Forme et présentation
composants formule définition Rôle
Principesactifs
Triamcinolone
acétonide (0,1g)
C24H31FO6
Glucocorticoïde
synthétique présente
sous forme d’acétonide
Anti-inflammatoire
stéroïdien à activité
modérée.
Néomycine
sulfate (0,25)
C23H46N6O13
XH2SO4
Mélange de sulfate et
d’aminoside produits par
Streptomyces fradiae
Antibactérien à effet
bactéricide (inhibition de
la synthèse protéique
bactérienne).
Nystatine
(10 MUI)
C47H75NO17 Substance chimique très
complexe produite par
Streptomyces noursei
Antifongique à activité
fongistatique
(augmentation de la
perméabilité des
champignons). Elle est
efficace essentiellement
sur les Candida
Excipients(100g)
Huile de
vaseline épaisse
Entre C22 et C35 Mélange
d’hydrocarbures saturés
liquides, obtenus à partir
de pétrole.
Excipient de surface pour
les pommades
hydrophobes.
Cire de
polyéthylène
Dérivé pétrolier Conférer une consistance
à la pommade.
Composition du médicament
Méthodes d’analyses microbiologiques du produit fini
A partir de chaque lot, cinq échantillons sont prélevés et destinés à être
examinés. L’évaluation de la propreté microbiologique passe par deux étapes
principales à savoir la préparation des solutions, et l’isolement dans les milieux
de cultures sélectifs.
1. Préparation de solutions
(solution A)
Dissolvez 10g de Mycocide
®
90ml d’une solution
peptonée au chlorure de
sodium additionnée au
Tween (pH =7)
deux dilutions décimales.
2. Recherche de germes
spécifiques
•Milieu d’enrichissement
pour les Entérobactéries
(solution B) :
Dissolvez 10 g de Mycocide
®
100ml de bouillon lactosé
incuber à 37°C pdt 2-5 heures.
•Milieu d’enrichissement
pour S.aureus et
P.aeruginosa (solutionC)
10ml solution A
100ml de bouillon peptoné
de caseine de soja
incubez à 37°C pdt 24h
3. Isolement des germes sur milieux sélectifs
Germes
recherchés
Milieu de culture Ensemencement Incubation Dénombrement
Germes aérobies
viables totaux
gélose peptoné à la caséine
soja pour les bactéries, et
gélose Saboureaud pour les
levures et moisissures
Ensemencer en
profondeur 1ml de la
solution A et de chaque
dilution dans aux moins
deux boites de pétri.
32 à 35°C pendant
2 à 5 jours pour
les bactéries et à
25°C pendant 2 à
5 jours pour les
levures et
moisissures.
Comptage des
colonies apparues
à la surface des
géloses en UFC/G
Entérobactéries et
certaines autres
bactéries gram-
Bouillon Mossel Ensemencer 1ml de la
solution B dans le
bouillon Mossel à 3
dilutions décimales dans
un milieu liquide
35 à 37°C pendant
18 à 24 heures
Méthode du
nombre le plus
probable (NPP)
Pseudomonas
aeruginosa
Gélose Cetrimide Ensemencer en surface
quelque goutte de la
solution C
37°C pendant 72
heures
Comptage des
colonies apparues
à la surface de
gélose en UFC/g
Staphylococcus
aureus
Gélose Vogel Johnson Ensemencer en surface
quelque goutte de la
solution C
37°C pendant 24
heures
Peptone de viande 10g
Extrait de viande 1g
NaCl 10g
Mannitol 10g
Rouge de phenol 0,025g
Sulfate de polymixine B 0,010g
Agar agar 12-14g
Tryptone 10g/l
Etrait de levure 5g/l
Mannitol 10 g/l
Phosphate dipotassique 5g/l
Chlorure de lithium 5g/l
Glycine 10g/l
Tellurite de photassium à 10g/l 20ml
Rouge de phenol 0,0 25 g/l
Thiosulfate de sodium 0,60 g/l
Lecithine de soja 0,30 g/l
Tween R 80 2,5 g/l
Histidine,Hcl 0,10 g/l
Agar 17 g/l
Résultat des analyses microbiologiques du produit fini
N° de lot des
germes
Recherchés
1 2 3 4 5
NORMES (Pharmacopée
Européenne 2005)
Germes aérobies
viables totaux
0 0 15 0 5 ≤ 500 UFC/g
Entérobactéries et
certaines autres
bactéries Gram-
<10 <10 <10 <10 <10 ≤ 50 UFC/g
Pseudomonas
aeruginosa
Absence Absence Absence Absence Absence Absence
Staphylococcus
aureus
Absence Absence Absence Absence Absence Absence
 Une révélation d’une flore mycélienne appartenant au genre Penicillium et Mucor
qui sont des germes saprophytes de l’environnement.
Résultats des tests d’identifications des germes trouvés dans l’air :
COLONIE ASPECT
MACROSCOPIQUE
Aspect microscopique Le genre
Colonie 1 Colonie blanche, ronde,
cotonneuse.
Thalle ramifié cloison. Penicillium
Colonie 2 Colonie marron,
rhizoïde.
Thalle non cloisonné
non ramifié avec tête
sphérique.
Mucor
1. Résultats d’identification macroscopique et microscopique des moisissures trouvés
dans l’air.
Points de
prélèvement
Germes identifiés UFC/boite %
Au dessus de la
cuve de pesage des
huiles
S.Saprophyticus
S.epidermidis
S.simulans
Staphylococcus sp
Mucor
20
17
4
2
1
37
31
16.66
3.7
1.85
Au dessus de la
cuve de stockage
S.epidermidis
S.Saprophyticus
S.simulans
Mucor
5
2
4
3
31.25
12.5
16.66
18.75
Au dessus des
remplisseuses des
tubes
S.epidermidis
S.Saprophyticus
S.simulans
S.intermedius
Staphylococcus sp
92
10
8
8
1
76.03
8.26
6.61
6.61
1
2. Répartition des germes trouvés dans l’air
Résultats des tests d’identification des germes trouvés chez le personnel
Zone de
prélèvement
Opérateur UFC/5 doigts
Mains droite Mains gauche
Zone de
production
Opérateur1 8 5
Opérateur2 6 16
Zone de
conditionnement
Opérateur3 92 167
Résultats de dénombrement des germes trouvés chez le personnel
 Les résultats révèlent la présence d’une charge microbienne importante chez
l’opérateur n°3 du conditionnement qui peut être due à diverse manipulations
effectuées par cet opérateur avec non respect des règles des BPF.
 Les germes identifiés appartiennent aux genres Staphylococcus et
Penicillium.
Conclusion:
D’après les résultats des analyses microbiologiques de produit
fini, nous constatant l’absence totale de germes pathogènes
(Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), et la présence
non significative des germes aérobies viables totaux (bactéries,
levures et moisissures), ce qui explique la bonne qualité
microbiologique du produit, ce ci est due :
- Au respect des bonnes pratiques de la fabrication.
- A la composition de la pommade (présence d’antibiotiques).
- L’efficacité du processus du nettoyage et de désinfection.
Le médicament est sensé guérir un mal et non
pas l’engendrer, pour cela il doit satisfaire a
l’attente légitime du consommateur concernant
en particulier sa composition, sa teneur en
substance actives, son identité, sa quantité, sa
date de fabrication et de péremption, son mode
d’utilisationLe contrôle microbiologique permet :
de garantir une bonne qualité hygiénique
minimiser les pertes dues à des mauvaises
conditions de stockage et donc avoir le moins
possible de produits non conformes.
garantir un bon rendement

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les techniques de controle microbiologique des medicaments

  • 1. Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene Faculté des Sciences Biologiques Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Groupe : 2 Master en Génie-Biologique & Innovation Technologique Réaliser par: BENTALEB Kawther BOULAHBEL Houria BELATACHE AMINA Proposé par : Contrôle microbiologiques des médicaments Madame : OUSSEDIK
  • 2. Le plan: 1/Introduction 2/Les techniques microbiologique 3/Contrôle microbiologique de l’ environnement 4/ Contrôle microbiologique des médicaments 5/ Application sur le contrôle microbiologique des médicaments 6/Conclusion
  • 3. Le médicament est l’un des produits de consommations le plus délicat C’est pourquoi la stabilité et la régularité de ce produit est une exigence dans la fabrication pharmaceutique , et pour l’atteindre il faut une mise en place d’un contrôle de la qualité soigneusement dirigé par un système d’assurance qualité . parmi ces contrôles on a le contrôle microbiologique
  • 4. • afin d’appliquer le contrôle microbiologique il faut d’abord savoir les différents origines des contaminations accidentelles qui peuvent toucher la santé des patients surtout lors du mélanges des matières premières qui sont résumé ci-dessous
  • 5. Origine de contamination des produits pharmaceutiques Contamination par les surfaces et le matériel Biocontamination d’origine humaine Contamination par l’air Contamination par l’eau Matière premières Conditions de fabrication  Condition de stockage
  • 6. Dans le but d’identifier toutes causes ou agent nuisibles afin de réduire ou d’éliminer ces contaminations pour assurer l’innocuité et la stabilité du médicament pendant toute la durée de sa validation des contrôles de qualité sont réaliser y compris physico-chimique et microbiologique.
  • 7. Est une série d’épreuves: qualitatives (contrôle microbiologique ,toxicologique)  de dosage (contrôle physico-chimique) auxquelles doivent être soumis avant sa commercialisation tout produit terminé et produit intermédiaire et matière première, suivant les techniques décrites dans le dossier d’autorisation de mise sur le marché par la pharmacopée afin de répondre aux normes prévues Contrôle de la qualité:
  • 8. défini les critères de pureté des matières premières ou des préparation entrant dans la fabrication des médicaments et les méthodes d’essai et d’analyses à utiliser pour assurer leur contrôle dans le but d’unifier la composition des médicaments et d’indiquer le mode de préparation de certains médicaments Pharmacopée européenne
  • 9. Afin d’apprécier la qualité microbiologique d'un médicament durant le procédé de fabrication des différents étapes sont utiliser dans le but de rechercher et dénombrer dans les différents échantillons prélevés les microorganismes suivant: •Les bactéries aérobies viable totale: concerne tous les microorganismes aptes a se multiplier a des températures moyennes •Les levures et moisissures: sont responsables de nombreux phénomènes d'altération d'enzymes hydrolytiques(amylases, protéases, lipases ,...) •Les germes spécifiques « Staphylococcus aureus , Pseudomonas, E.coli , entérobactéries. Analyse microbiologique
  • 12. Techniques de stérilisation La stérilisation est une opération qui vise à détruire tous les micro-organismes d'un objet de façon durable. objectif contrôler les micro-organismes. prévenir une éventuelle contamination Stérilisation par la chaleur Stérilisation par gaz Stérilisation par action des radiations Stérilisation par des agents chimiques Stérilisation par filtration
  • 13. A/ Stérilisation par la chaleur I. Chaleur sèche On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ». a/ Flambage Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la surface de matériel non inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les fils de platine et les pipettes Pasteur. b/ Four Pasteur C'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie vide La verrerie à stériliser doit être propre et sèche, bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide. Elle est alors disposée à l'intérieur du four et subit un chauffage de : - 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C - 2 heures à 160°C. Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement, puis stocké à l'abri des poussières.
  • 14. I. Chaleur humide La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités: la stérilisation à l’autoclave La Pasteurisation La Tyndallisation
  • 15. I. Chaleur humide la stérilisation à l’autoclave Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une T° de 120°C pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les endospores.
  • 16. I. Chaleur humide La Pasteurisation la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la pasteurisation se situent entre 75 à 80°C Principe de la pasteurisation
  • 17. I. Chaleur humide La Tyndallisation La tyndallisation est une série de 3 chauffages bref à des températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes
  • 18. B/ Stérilisation par filtration La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm. Les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre. Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles comme: certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques
  • 19. Principe : C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses B/ Stérilisation par filtration  La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».  la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».
  • 20. C/ Action des agents chimiques I / Antiseptiques -Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantannée. Ils agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface : teinture d'iode, , permanganate de potassium, eau oxygénée II / Désinfectants - Empêche les contaminations humaines et animales - vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène ) - liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permangante de potassium ) -solide ( chaux vive ) III / Antibiotiques Substances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique. On distingue : - les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire - les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes déterminées au sein d'une flore poly-microbienne.
  • 21. C/ Action des radiations La radio-stérilisation est opérée par exposition du produit à un rayonnement ionisant , le principe repose sur l’ionisation et l’excitation des atomes des cellules et leur milieu avec formation de radicaux libres ; la rupture des liaisons protéiques altère les acides nucléiques des bactéries.
  • 22. E/ sterilisation par gaz L’évolution des dispositifs médicaux et l’utilisation de plus en plus répandue des contenants en matière plastique (polymériques), se qui nécessite de technique de stérilisation à basse température efficace, facile à mettre en œuvre , valable autant pour le petit matériel que des grands volumes (locaux).
  • 24. Techniques d’ensemensement L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une pipette Pasteur. . A / Ensemencement avec une anse: B/ ensemencement avec la pipette Pasteur
  • 25. Les milieux de culture Les milieux d’enrichissement: permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible quantité dans un échantillon. les milieux d’isolement: permettant la croissance de plusieurs espèces bactériennes les milieux sélectifs: favorisant la croissance d’un type bactérien particulier tout en inhibant celle des autres types bactériens. Les milieux de cultures les souches Température d’incubation Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux 35°C Sabouraud levures et moisissures 25°C Mac Conkey Escherichia coli 35°C Vogel –johnson Staphylococcus aureus 35°C Cetrimide Pseudomonas aeruginosa 35°C Gélose agar lactosée ou saccharosée Salmonella 35°C On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur fonction
  • 26. A / Ensemencement avec une anse:
  • 27. - flamber l’ouverture du tube - stériliser l’anse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone stérile. - prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage : . repiquage sur milieu solide : repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant soin de ne pas érafler la gélose . repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la boucle - repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en la portant au rouge. L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement . flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher
  • 28. B/ ensemencement avec la pipette Pasteur :
  • 29. Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails : - la pipette est passée rapidement dans la flamme. - l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile. - on aspire les bouillons de culture - on souffle pour ensemencer dans le tube stérile. - la pipette ne sert qu'une fois.
  • 31. Techniques d’isolement Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées : 1/ La méthode des stries 2/ La méthode des dilutions
  • 32. 1/ La méthode des stries - porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture ( solide ) ou le tube ( liquide ) prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge . Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction - les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48 heures selon le cas ( la position renversée permet à l'eau de condensation de s'évaporer
  • 33. 2/ La méthode des dilutions Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide : - les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un liquide physiologique de type Ringer - numéroter des tubes à essai de 1 à 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution - homogénéiser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prélever 0.1 ml et verser dans le tube 2. - dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois fois. Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilution n°10.
  • 35. le contrôle d’environnement est un domaine qui prend de plus en plus d’importance du fait de son lien avec une éventuelle contamination des produits pharmaceutiques OBJECTIF Identifier les voies de contamination possibles mettre en place des actions correctives avant que le produit ne soit contaminé
  • 37. Air et Eau 1/ Air :  Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement dans des zones à atmosphères contrôlées .  Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie But : Estimer la charge microbienne de l’air, à des différents lieux définis du local. Principe: La méthode utilisée est dite la méthode statique ou de sédimentation Mode opératoire : l’exposition des boites de Pétri ouvertes renfermant un milieu de culture standard (gélose nutritive) pendant 4 heures incuber à 37°C pendant 48 heures dénombrement des particules donnant naissance à des colonies sédimentées
  • 38. Air et Eau 1/ Air :  Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement dans des zones à atmosphères contrôlées .  Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie 2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):  Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro- organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille. 2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):  Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro- organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille.
  • 39. Personnel Les tenues doivent être stériles, donc conçues pour ne libérer ni fibres ni particules et doivent retenir les particules émises par l’opérateur Tenue Cagoule qui renferme totalement les cheveux Masque couvre le bas du visage Lunette qui raccorde la cagoule et le masque Combinaison Serrée complétées par des bottes
  • 40. But : estimer la charge microbienne retrouvée sur les mains gantées des opérateurs. Principe : méthode des empreintes digitales. faire une empreinte des cinq doigts pour les deux mains (droite, gauche et, chacune dans une boite), sur un milieu gélosé nutritif coulé sur boite de Pétri. Incuber à 37°C pendant 48 heures Expression des résultats : en UFC/ 5 doigts.
  • 41. Locaux situés dans un environnement qui représente un risque minimum de contamination Dans les zones à atmosphère contrôlé (ZAC) , les surfaces doivent être Lisse imperméable sans fissures Réduire l’accumulation des microorganismes Utilisation des produits de nettoyage et désinfectant stériles pour éviter même le développement des souches résistantes But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées.
  • 42. But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées . Principe: technique de l’écouvillonnage qui réside à des prélèvements à l’aide d’un écouvillon. Humidification de l’extrémité de l’écouvillon par l’eau distillée, •Rouler doucement l’écouvillon sur la surface à contrôler soit 25 cm2. , •Réaliser des suspensions bactériennes de 5 ml, •Ensemencer un inoculum de 1 ml dans deux boites de Pétri pour chaque écouvillon, •Incuber à 32°C pendant 5 jours. Mode opératoire : Lecture des résultats : en UFC par boite. On distingue 2 catégories d'enceinte stérile : 1.Les enceintes physiquement fermées dénommées isolateurs 2.Les enceintes physiquement ouvertes à flux d'air laminaire dénommées hottes à flux d'air laminaire prélèvements à l’aide d’un écouvillon : une petite brosse cylindrique qui sert à nettoyer l'intérieur des récipients à col étroit
  • 43. Les hottes à flux d'air laminaire Les hottes à flux d'air laminaire sont des enceintes qui sont traversées par un flux d'air qui se déplace à une vitesse uniforme suivant des lignes parallèles. Le principe Le principe des hottes à flux d'air laminaire consiste à absorber de l'air et à le filtrer avec un filtre HEPA avant de le projeter sur la paillasse de travail. Ce flux d'air entraîne un effet piston qui repousse les micro-organismes. Le rôle de la filtration est double : - apporter de l'air propre dans la zone de travail. - éviter l'élimination de produits dangereux dans l'environnement
  • 44. L’isotechnie  Elle consiste à créer une barrière physique entre l’opérateur, qui se trouve dans une zone non-stérile, et les équipements dans lesquels se déroulent les étapes critiques du remplissage et du bouchage des médicaments (injectables surtout.)  Les manipulations s’effectuent de l’extérieur, à travers : gants étanches fixés à la paroi demi-scaphandre. L’isotéchnie a été conçue pour réduire sensiblement les risques de contamination de l’environnement des produits fabriqués de façon aseptique.
  • 45. 1 / La filtration sur membrane une méthode efficace d’analyse de la contamination microbienne ou particulaire des solutions aqueuses. Elle est largement utilisée pour : Le comptage des bactéries hétérotrophes Le comptage des champignons (levures et moisissures) L’isolation de E. coli, Pseudomonas sp., Lactobacillus sp. et autres Principe : C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses  La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».  la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».
  • 46. Produits obligatoirement stériles :consiste à vérifier l’absence de contamination bactérienne dans les substances ,les préparations et les produits qui doivent être stériles selon la pharmacopée. Produits non obligatoirement stériles :il s’agit du dénombrement des germes aérobies viables totaux (les bactéries ,levures et moisissures ) et de rechercher des micro-organismes spécifiés : Escherichia coli,Pseudomonas On a deux types de contrôles:
  • 48. Procédure : A/ Filtrez 100 mL de l’échantillon avec une membrane Pall à l’aide d’un entonnoir de filtration et d’un système à vide. Tous les organismes présents dans le prélèvement se concentrent à la surface de la membrane. Membranes Entonnoirs a usage unique
  • 49. B / L’échantillon est versé dans l’entonnoir et si nécessaire, la membrane est rincée une fois ou plusieurs fois pour éliminer les substances inhibitrices qui étaient présents dans l'échantillon C/ Placez le filtre à membrane dans la boîte de Pétri préparée. Procédez à l’incubation à la température appropriée pendant le délai prévu. D /Comptez les colonies sous un grossissement 10-15x et identifiez le type de contamination.
  • 50. Avantages Isoler et de dénombrer les micro- organismes, tout en indiquant s’ils sont présents ou absents en à peine 24 heures. Permet de concentrer de grands volumes d’échantillons. Autorise l’isolation et le comptage de colonies discrètes. Réduit le délai de préparation par rapport aux autres méthodes traditionnelles
  • 51. 2 / Ensemencement par inclusion : Rappel: L’ensemencement est une opération qui consiste à déposer dans un milieu de culture stérile des germes prélevés à partir d’une culture mère (milieu naturel) ou culture pure , le transfert est généralement effectué avec : • Un fil à ensemencer. • L’anse de platine. • Une pipette Pasteur. Milieu gélosé fondu solidification Echantillon dilué Incubation Lecture des UFC
  • 52. 3/ Ensemencement en stries : C’est une méthode classique d’isolement par dissémination des germes microbiens aérobies (bactéries et levures) à la surface des milieux de culture solides. Le mélange microbien est transféré au bord d’une boite de Pétri gélosée à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’un écouvillon et étalé à la surface d’une boite en suivant un motif défini
  • 53. 4/ Méthode NPP du nombre le plus probable: But : estimation du nombre de bactéries dans des échantillons solides ou liquides contaminés difficilement analysé par la filtration sur membrane Principe : Témoin Echantillon dilué en série + milieu de culture Incubation 24h à 44,5°C(Croissance des bactéries ) Noter le nombre de tubes positifs selon les tables du NPP basées sur la loi du Poisson.
  • 54. Après ces différentes techniques effectuées sur les matières premières et les produits semi-fini , on procède pour une deuxième fois à une filtration sur membrane mais réalisée sur le produit fini et qu’elle est suivie d’un ensemencement direct
  • 55. 5 / Ensemencement direct Inoculum S’il ya des troubles Repiquage sur milieu frais Incubation au moins 4 jours 24 jours
  • 56. 6/ Test de recherche des microorganismes Lesgermes totaux: Concerne tous les micro-organismes capable de se multiplier à des températures moyennes les germesfongiques Concerne tous les micro-organismes capables de secréter des enzymes hydrolytiques provoquant plusieurs phénomènes d’altération.
  • 58. Dans le but de rechercher ces différents microorganismes , on effectue des repiquages c’est-à-dire des transplantations des cultures pures sur des milieux de culture neufs spécifiques pour chaque microorganisme: Les milieux de cultures les souches Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux Sabouraud levures et moisissures Bouillon Mac Conkey Agar Mac Conkey Escherichia coli Vogel –johnson Mannitol Salt Agar Staphylococcus aureus Agar Cetrimide Pseudomonas aeruginosa Gélose agar lactosée ou saccharosée bouillon soja RVS Salmonella spp
  • 59. 7 /Lecture des colonies : Type de germes dénombrés Observation des colonies Avant utilisation Après utilisation Germe fongique (Gélose Sabouraud) E. Coli (Gélose Mac Conkey)
  • 60. Pseudomonas aeruginosa (Gélose au Cétrimide) Salmonella spp (Gélose SS) Staphylococcus aureus (Gélose Vogel- johnson) Les repiquages effectués sont suivis d’un dénombrement par la technique du nombre le plus probable
  • 61. 7/ Recherche de pyrogènes :  C’est un test obligatoire pour tous les solutés injectables dont le volume de conditionnement est supérieur ou égal à 15 ml, Des microorganismes susceptibles de provoquer des réactions d’hyperthermie à l’injection le plus souvent par les endotoxines bactériennes des bactéries Gram négatif  Les pyrogènes sont recherchés dans l’eau , les produits intermédiaires et les produits finis en effectuant deux tests : Essai in vivo Essai in vitro 1. Injection d’une solution de NaCl 0.9% apyrogène 1 à 3 jours afin d’exclure les animaux ayant une variation de température trop importante. 2. Injection durant 4 minutes dans la veine marginale de l’oreille du liquide préchauffé à 38.5°C. Utilise un lysat de cellules sanguines du crabe limulus (arthropode), qui a la propriété de floculer (coaguler) en présence d’endotoxines de bactéries à Gram négatif. Les symptômes de pyrogénicité  Frissons intenses  Cyanose, Un pouls rapide accompagné de dyspnée Des douleurs lombaires
  • 62. Donc : l’apyrogénicité définie comme l’absence respective de micro-organismes viables et de substances pyrogènes, constitue un critère de qualité microbiologique et de sécurité pour l’administration des médicaments ou l’utilisation des dispositifs médicaux chez l’homme. Le contrôle de ce paramètre, en terme d’objectif, de conditions opératoires et d’interprétation des résultats, est fixé par la Pharmacopée pour les médicaments et normes pour les dispositifs médicaux.
  • 63. Application sur le contrôle microbiologique de médicament
  • 64. Application N°1 Contrôle microbiologique, d’une suspension buvable pour enfant, obligatoirement stérile, anti-inflammatoire non stéroïdien « ALGIFEN® » durant sa production et son conditionnement.
  • 65. Forme et présentation ALGIFEN® est une suspension buvable réservée aux nourrissons et à l’enfant de 3 à 12 ans dosée à 20 mg/ml dans des flacons de 125ml avec un bouchon doseur gradué en ml ou pipette pour administration orale graduée en Kg .La posologie usuelle est de 20 à 30 mg/kg 3 à 4 fois par jour.
  • 67. ALGIFENE Ibuprofèn e Polysorba te 80 Acide citrique anhydre Sorbitol 70% Eau purifiée Gomme xanthane Saccharose Glycérol Benzoate de sodium Acésulfam e potassique Rouge de cochenille A Edétate disodique Arôme banane Arôme Fraise vanille Composition chimique du médicament :
  • 69. Bactéries viables totales. Levures et moisissures
  • 70. 2 lots au début du conditionnement 2 lots au milieu du conditionnement 1 lot à la fin du conditionnement Dilution dans 90mL d’une solution tampon peptonée au chlorure de sodium
  • 71. Milieu TSA Incubation à 30-35°C pdt 5jrs Milieu Sabouraud Incubation à 20-25°C pdt 5jrs Pré-enrichissement sur 90 mL de bouillon peptoné à la caséine de Soja. Incubation à 37°C pdt 48h Un enrichissement sur bouillon MacConkey à44°C pdt 24h puis un isolement sur gélose de MacConkey.
  • 72.  le médicament ALGIFEN® est de bonne qualité tout au long de son processus de fabrication, et est définis comme étant prêt à la consommation pour le plus grand bonheur des parents,  ALGIFEN® présente l’avantage d’être commercialisé à moindre cout, de fait qu’il soit localement produit, ce qui diminue les charges. Conclusion2:
  • 74. Présentation de médicament : Classe thérapeutique: le Maalox® appartient à la classe des antiacides et pansements gasto-intestinaux. Nom commercial: Maalox®. Principes actifs : Hydroxyde de magnésium (E527), Hydroxyde d'aluminium. Laboratoire : Sanofi-Aventis France. DCI: Hydroxyde d’aluminium et hydroxyde de magnésium.
  • 75. le MAALOX est un médicament qui traite les manifestations douloureuses de l'hyperacidité des voies digestives supérieures, la gastrite, l'ulcère gastroduodénal, l'hernie hiatale et l' oesophagite. La production de la suspension MAALOX s'effectue à partir d'une dilution à l'eau purifiée de sa forme primaire le « PREMIX » auquel on rajoute aussi de l'eau déminéralisée. Présentation de médicament :
  • 76. Ce médicament existe sous 4 formes : comprimé suspension buvable (flacon de 250ml) Suspension buvable en flacon de 250ml goût menthe. Suspension buvable en sachets-dose de 20 x 4 ,3 ml goût citron Comprimés à croquer goût menthe. Comprimés à croquer sans sucre goût citron.
  • 77. Composition de Maalox®: PA -hydroxyde de magnésium (10g/flacon) -hydroxyde d'aluminium (8.75 g/f) Excipients l'acide chlorhydrique concentré -une huile essentielle de menthe poivrée -sorbitol concentré à 70% -D- mannitol -Saccharine sodique Conservateurs parahydroxybenzoate de méthyle (Nipagine) -parahydroxybenzoate de propyle (Nipazol)
  • 79. Analyse microbiologique de Maalox®: La recherche et le dénombrement: Concerne tous les micro-organismes aptes à se multiplier à des températures moyennes Sont responsables de nombreux phénomènes d’altération dus à leur pouvoir de sécrétion d’enzymes hydrolytiques (amylases, protéases, lipases, etc.)
  • 80. Analyse microbiologique de Maalox®: Escherichia coli Elle représente l'une des causes majeures des diarrhées aigues et des infections intestinales. Entérobactéries Constituent un grand groupe de bactéries ayant une forte similitude, certaines sont dangereuses et provoquent des problèmes sanitaires d'où l'importance de leur recherche Staphylococcus aureus Recherchée systématiquement dans le produit fini du fait de l'excrétion de nombreuses substances toxiques (enterotoxines, hémolysine) provoquant des infections graves Les salmonelles Sont des agents de Gastro-entérites, elles sont parmi les principales bactéries responsables de toxi-infection. La recherche de 4 types de germes spécifiés suivants:
  • 81. Air Préparation des boites de pétri TSA Sabouraud Tergitol Germes totaux Germes fongiques Germes pathogènes 30-35° C pendant 5 J 22-25° C pendant 24h à 48h 30-35° C pendant 24h à 48h Ramener les boites à la T° du labo et vérifier l’absence de croissance microbienne Exposition des boites Pendant 4 h Incubation à 37° pdt 3jrs
  • 82. + 15 ml de milieu sabouraud à 45°C, laisser refroidir à 25°C pendant 5 J + 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J 1 ml dans chaque boite de pétri 10 ml de la suspension à analyser (prémix) 90 ml Tampon peptoné e au NaCl Dénombrement des germes totaux Dénombrement des germes fongiques Ensemencement en masse Prémix
  • 83. 10 ml de l’eau à analyser 90 ml Tampon peptonée au NaCl Dénombrement des germes totaux Dénombrement de P.aeruginosa Déposer la membrane sur milieu TSA 37°C, 48h Bouillon BCS Gélose au cétrimide entonnoir Mb filtrante 0,45µm 30°c, 5 jrs Étalement de 1ml 10ml Eau purifiée
  • 84. Introduire 200ml d’une solution tampon pH 7,2 et boucher à l’aide d’un bouchon cardé Flacons à tester Dénombrement des germes totaux Recherche des germes pathogène Déposer la mb sur milieu Mac Conkey Déposer la mb sur milieu TSA Laisser en contact 1 à 2 h Flacons
  • 85. 10 ml de la suspension à analyser (Maalox) 90ml Tampon phosphater 1 ml dans chaque boite Dénombrement des germes totaux Dénombrement des germes fongiques Dénombrement de Staph.aureus + 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J + 15 ml de milieu sabouraud incuber à 25°C pendant 5 J + Vogel Jonhson incuber à 37°C pendant 3 J Maalox® et eaux de rinçage
  • 86. 10 ml de la suspension à analyser (Maalox) 1 ml Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant 48 h Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant 48 h Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h Pour la recherche de E.Coli Pour la recherche de Salmonella sp Pour la recherche de P.aeruginosa
  • 87. 10 ml de la suspension à analyser (Maalox) 1 ml Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant 48 h Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant 48 h Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h Pour la recherche de E.Coli Pour la recherche de Salmonella sp Pour la recherche de P.aeruginosa
  • 88. Dénombrement de Pseudomonas aeruginosa sur Gélose au Cétrimide Avant utilisation Après utilisation Les colonies sont verdâtres et fluorescentes. Dénombrement de Salmonella sur Gélose SS les colonies sont transparentes avec centre noir. Avant utilisation Après utilisation
  • 89. Dénombrement de Staphylococcus aureus sur Gélose Vogel-johnson les colonies sont noires avec un halo jaune. Les résultats sont exprimés en Unités Formant Colonie par millilitre ou par gramme (UFC/ml ou /g). le comptage peut s’effectuer soit par comparaison visuelle à un abaque fourni par le fabricant, soit par compteur laser (ceci nécessitant un milieu non opaque).
  • 90. Le contrôle Les normes L’air Germes totaux ≤ 10 2 UFC/cm2 Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/cm2 (pharmacopée Européenne 2002) Le prémix « PA + excipients » Germes totaux ≤ 10 2 UFC/g Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/g Germes pathogènes :  S.aureus: Abs  P.aeruginosa: Abs  E.coli: Abs  Salmonella.sp: Abs L’eau purifiée Germes totaux ≤ 10 2 UFC/ml P.aeruginosa : Abs/10ml (pharmacopée Européenne 2002) Les flacons Germes totaux ≤ 10 3UFC/ml Germes pathogènes : Abs/10ml (pharmacopée Européenne 1997) Maalox® et eaux de rinçage Germes totaux ≤ 10 2 UFC/ml Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/ml Germes pathogènes : Abs Résultats:
  • 91. une très bonne qualité microbiologique révélée par l’absence même de la flore fongique mais étant donné que le Maalox® est regroupé dans la catégorie des préparations pharmaceutiques non obligatoirement stériles, on peut noter la présence de quelques germes totaux et fongiques a condition que cela reste toujours dans les normes exigées par le partenaire. Si Maalox® reste conforme aux normes tout au long de son processus de fabrication, à partir des matières premières (prémix, eau purifiée et eau oxygénée) et articles de conditionnement jusqu’au produit fini, défini comme étant prêt à la consommation.
  • 93. Notre choix s’est porté sur un médicament non obligatoirement stérile « Mycocide®», qui est une pommade dermique hydrophobe présentée sous forme d’un tube de 15g. ce médicament est une association de trois principes actifs et de deux excipients (tableau). Vu sa composition, « Mycocide ®» est indiquée pour le traitement des dermatoses corticosensibles sur infectées par un germe sensible à la néomycine et/ou par un Candida. Forme et présentation
  • 94. composants formule définition Rôle Principesactifs Triamcinolone acétonide (0,1g) C24H31FO6 Glucocorticoïde synthétique présente sous forme d’acétonide Anti-inflammatoire stéroïdien à activité modérée. Néomycine sulfate (0,25) C23H46N6O13 XH2SO4 Mélange de sulfate et d’aminoside produits par Streptomyces fradiae Antibactérien à effet bactéricide (inhibition de la synthèse protéique bactérienne). Nystatine (10 MUI) C47H75NO17 Substance chimique très complexe produite par Streptomyces noursei Antifongique à activité fongistatique (augmentation de la perméabilité des champignons). Elle est efficace essentiellement sur les Candida Excipients(100g) Huile de vaseline épaisse Entre C22 et C35 Mélange d’hydrocarbures saturés liquides, obtenus à partir de pétrole. Excipient de surface pour les pommades hydrophobes. Cire de polyéthylène Dérivé pétrolier Conférer une consistance à la pommade. Composition du médicament
  • 95. Méthodes d’analyses microbiologiques du produit fini A partir de chaque lot, cinq échantillons sont prélevés et destinés à être examinés. L’évaluation de la propreté microbiologique passe par deux étapes principales à savoir la préparation des solutions, et l’isolement dans les milieux de cultures sélectifs. 1. Préparation de solutions (solution A) Dissolvez 10g de Mycocide ® 90ml d’une solution peptonée au chlorure de sodium additionnée au Tween (pH =7) deux dilutions décimales. 2. Recherche de germes spécifiques •Milieu d’enrichissement pour les Entérobactéries (solution B) : Dissolvez 10 g de Mycocide ® 100ml de bouillon lactosé incuber à 37°C pdt 2-5 heures. •Milieu d’enrichissement pour S.aureus et P.aeruginosa (solutionC) 10ml solution A 100ml de bouillon peptoné de caseine de soja incubez à 37°C pdt 24h
  • 96. 3. Isolement des germes sur milieux sélectifs Germes recherchés Milieu de culture Ensemencement Incubation Dénombrement Germes aérobies viables totaux gélose peptoné à la caséine soja pour les bactéries, et gélose Saboureaud pour les levures et moisissures Ensemencer en profondeur 1ml de la solution A et de chaque dilution dans aux moins deux boites de pétri. 32 à 35°C pendant 2 à 5 jours pour les bactéries et à 25°C pendant 2 à 5 jours pour les levures et moisissures. Comptage des colonies apparues à la surface des géloses en UFC/G Entérobactéries et certaines autres bactéries gram- Bouillon Mossel Ensemencer 1ml de la solution B dans le bouillon Mossel à 3 dilutions décimales dans un milieu liquide 35 à 37°C pendant 18 à 24 heures Méthode du nombre le plus probable (NPP) Pseudomonas aeruginosa Gélose Cetrimide Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C 37°C pendant 72 heures Comptage des colonies apparues à la surface de gélose en UFC/g Staphylococcus aureus Gélose Vogel Johnson Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C 37°C pendant 24 heures Peptone de viande 10g Extrait de viande 1g NaCl 10g Mannitol 10g Rouge de phenol 0,025g Sulfate de polymixine B 0,010g Agar agar 12-14g Tryptone 10g/l Etrait de levure 5g/l Mannitol 10 g/l Phosphate dipotassique 5g/l Chlorure de lithium 5g/l Glycine 10g/l Tellurite de photassium à 10g/l 20ml Rouge de phenol 0,0 25 g/l Thiosulfate de sodium 0,60 g/l Lecithine de soja 0,30 g/l Tween R 80 2,5 g/l Histidine,Hcl 0,10 g/l Agar 17 g/l
  • 97. Résultat des analyses microbiologiques du produit fini N° de lot des germes Recherchés 1 2 3 4 5 NORMES (Pharmacopée Européenne 2005) Germes aérobies viables totaux 0 0 15 0 5 ≤ 500 UFC/g Entérobactéries et certaines autres bactéries Gram- <10 <10 <10 <10 <10 ≤ 50 UFC/g Pseudomonas aeruginosa Absence Absence Absence Absence Absence Absence Staphylococcus aureus Absence Absence Absence Absence Absence Absence
  • 98.  Une révélation d’une flore mycélienne appartenant au genre Penicillium et Mucor qui sont des germes saprophytes de l’environnement. Résultats des tests d’identifications des germes trouvés dans l’air : COLONIE ASPECT MACROSCOPIQUE Aspect microscopique Le genre Colonie 1 Colonie blanche, ronde, cotonneuse. Thalle ramifié cloison. Penicillium Colonie 2 Colonie marron, rhizoïde. Thalle non cloisonné non ramifié avec tête sphérique. Mucor 1. Résultats d’identification macroscopique et microscopique des moisissures trouvés dans l’air.
  • 99. Points de prélèvement Germes identifiés UFC/boite % Au dessus de la cuve de pesage des huiles S.Saprophyticus S.epidermidis S.simulans Staphylococcus sp Mucor 20 17 4 2 1 37 31 16.66 3.7 1.85 Au dessus de la cuve de stockage S.epidermidis S.Saprophyticus S.simulans Mucor 5 2 4 3 31.25 12.5 16.66 18.75 Au dessus des remplisseuses des tubes S.epidermidis S.Saprophyticus S.simulans S.intermedius Staphylococcus sp 92 10 8 8 1 76.03 8.26 6.61 6.61 1 2. Répartition des germes trouvés dans l’air
  • 100. Résultats des tests d’identification des germes trouvés chez le personnel Zone de prélèvement Opérateur UFC/5 doigts Mains droite Mains gauche Zone de production Opérateur1 8 5 Opérateur2 6 16 Zone de conditionnement Opérateur3 92 167 Résultats de dénombrement des germes trouvés chez le personnel  Les résultats révèlent la présence d’une charge microbienne importante chez l’opérateur n°3 du conditionnement qui peut être due à diverse manipulations effectuées par cet opérateur avec non respect des règles des BPF.  Les germes identifiés appartiennent aux genres Staphylococcus et Penicillium.
  • 101. Conclusion: D’après les résultats des analyses microbiologiques de produit fini, nous constatant l’absence totale de germes pathogènes (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), et la présence non significative des germes aérobies viables totaux (bactéries, levures et moisissures), ce qui explique la bonne qualité microbiologique du produit, ce ci est due : - Au respect des bonnes pratiques de la fabrication. - A la composition de la pommade (présence d’antibiotiques). - L’efficacité du processus du nettoyage et de désinfection.
  • 102. Le médicament est sensé guérir un mal et non pas l’engendrer, pour cela il doit satisfaire a l’attente légitime du consommateur concernant en particulier sa composition, sa teneur en substance actives, son identité, sa quantité, sa date de fabrication et de péremption, son mode d’utilisationLe contrôle microbiologique permet : de garantir une bonne qualité hygiénique minimiser les pertes dues à des mauvaises conditions de stockage et donc avoir le moins possible de produits non conformes. garantir un bon rendement

Notes de l'éditeur

  1. Ces locaux doivent être efficacement ventilés avec de l'air filtré
  2. Les colonies de levures: sont brillantes, rondes, bombées de couleur blanche. Les moisissures: aspect velouté parfois pigmenté. Les colonies ont une couleur rouge brique entourées parfois d’une zone de précipitation rougeâtre.
  3. macromolécules issues de métabolisme microbien appelées également endotoxines
  4. D’après le tableau on remarque la présence des staphyloccous epidermidis dans toutes les salles de fabrication, avec un taux relativement élevé d’une salle à une autre. la présence d’un taux relativement élevé de moisissures