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Le Polymorphisme
génétique
Année universitaire 2015/2016 DR. OULDJAOUI AHMED
Définition
– variation individuelle de la séquence nucléotidique
– entraînant l’existence au même locus d’au moins 2 formes
différentes de la séquence, appelés allèles
– dont la fréquence est > à 1% dans la population
– intra ou extra-génique
– d’effet neutre
• En dehors d’un gène
• Dans une région non codante d’un gène (intron)
• Dans une région codante mais sans altérer la signification
(redondance du code génétique)
Diversité des séquences humaines
- Pour les 95 % non codants
Des estimations donnent:
2 génomes humains diffèrent en moyenne par
1/100 à 1/500 nucléotides. Si on pouvait comparer
entre l’ADN d’origine paternelle et l’ADN d’origine
maternelle chez un individu on trouvait 10 milliard de
différence correspondant à l’accumulation de
mutations au cours de l’évolution humaine.
La proportion totale de bases polymorphiques
«Index d’hétérozygotie d’ADN» a été estimé à
1/270pb pour tout segment d’ADN du génome choisi
au hasard.
Diversité des séquences humaines
-Pour les 5 % codants
Les régions codantes sont soumises à une sélection plus
importante. La présence de mutations dans ces régions est plus
faible.
Diversité nucléotidique π :
Nombre de différences, rapporté à la longueur de la
séquence examinée, entre 2 séquences prises au hasard dans la
population.
AGTCCTA…………..GGAAACTG…………TTTACGT….
AGTGCTA…………..GGTAACTG…………TTGACGT….
7500 pb
π = 3/7500 = 1/2500
1. RFLP bi-allèliques
2. Minisatellites
3. Microsatellites
4. SNP (single nucleotide polymorphism)
I. Les Marqueurs polymorphes
Comment toutes ces variations ont été détectées?
1. Polymorphisme de la longueur des
fragments de restriction
[RFLP: Restriction Fragment Length polymorphism]
- Ce sont des variations individuelles de la séquence d’ADN
révélées par des modifications de la carte de restriction. Mise
en évidence par le Southern qui montre des différences
obtenues avec une enzyme donnée et une sonde donnée.
- Les enzymes de restrictions possèdent des séquences
reconnues dans l’ADN, une mutation au niveau de cet ADN
entraine la formation ou la perte de site de reconnaissance, ce
qui entraine des modifications dans la taille d’un ou plusieurs
fragments révélés par Southern.
- De même si un segment d’ADN situé entre 2 sites de
restriction était délété ou inséré, la taille du fragment de
restriction sera différente.
Les sites polymorphes
Allèle 1 6.5 kb 1.5 kb
Allèle 2 8 kb
PAS DE SITE INTERNE
1/1 1/2 2/2
8 kb
6.5 kb
Les sites polymorphes
Allèle 1 4 kb 2.5 kb
Allèle 2 8 kb
SITE POLYMORPHE INTERNE
1/1 1/2 2/2
8 kb
4 kb
2.5 kb
6.5 kb
Les sites polymorphes
Allèle 1 4 kb
2.5 kb
Allèle 2
SITE INTERNE NON POLYMORPHE
SITE EXTERNE POLYMORPHE
1/1 1/2 2/2
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4 kb
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5.5 kb
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Les sites polymorphes
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Allèle 2
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SITE POLYMORPHE INTERNE
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1.5 kb
• Dans toute séquence non codante (97% ADN)
• Dans une séquence codante sans conséquence sur la
fonction du gène
• Si le polymorphisme touche la 3ème base du codon
• Allèle 1 CAG ATC TTA (site BglII AGATCT)
• Gln Ile Leu
• Allèle 2 CAA ATC TTA (site BglII absent)
• Gln Ile Leu
• Si le changement d’acide aminé n’a pas d’effet sur la
fonction
• Cas particulier : la mutation étudiée crée un
polymorphisme
1.1. RFLP bi-allèliques : localisation
EXEMPLE d’un polymorphisme multiallèlique
Le polymorphisme de l’apolipoprotéine E
Protéine:
E2 E3 E4
AA en 112 Cystéine Cystéine Arginine
AA en 158 Cystéine Arginine Arginine
ADN: Fragment de 292 pb (9 sites de coupure)
Hha I: GCG C
CGC = Arginine TGC = Cystéine
62 16 91 18 83 7 11 4
62 16 91 18 48 7 11 4
2 cys-cys
3 cys-arg
35
62 16 72 18 48 7 4
35
4 arg-arg
19 11
cys
cys
cys arg
arg arg
GCGC
GCGC
GCGC
GTGC
GTGC GTGC
Génotypage de l’apoE
 Amplification par PCR Dénaturation : 30 s à 95°C,
Hybridation : 30 s à 60°C Elongation : 1 min à 72°C)
 Digestion de l’ADN amplifié par Hha I GCGC (TGC
cystéine CGC Arginine)
Génotypage de l’apo E
91
83
72
48
35
2/2 3/3 4/4 4/2 2/3 4/3
62
(E2/E2)=91+83+62 (E4/E2)=91+83+72+62+48+35
(E3/E3)=91+62+48+35 (E2/E3)=91+83+62+48+35
(E4/E4)=72+62+48+35 (E4/E3)=91+72+62+48+35
2. Minisatellites: RFLP multi-allèliques
VNTR (variable number tandem repeats)
CTGGATTAGCTTAAGCGT
CTTAGTAGGATGGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT---
GGAGGTTCAGGTGATGGA
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGG
GGAGGTTCAGGTGATGGA
GGAGGTTCAGGTGAT---
ACCTGGGATTCTTCGATC
Minisatellite
PS3 porcin
allèle à 7
répétitions
• Répétitions en nombre variable d’une
séquence de 10 à 50 pb à un locus donné
• Une même séquence de minisatellite va se
retrouver à différents loci sur tout le génome
• Analyse locus par locus
• Analyse de la répartition d’un minisatellite
sur le génome entier
2. 1. Répartition des minisatellites
2.2. Minisatellites - mise en
évidence des allèles à un locus
• Le contexte autour du minisatellite est
spécifique d’un locus
• Analyse par Southern blot ou PCR
• La sonde ou les amorces s’hybrident autour
du minisatellite : locus-spécifiques
2.3. minisatellites : Southern blot
Allèle 1
Allèle 2
2 kb
3 kb
Digestion par l’enzyme
Southern blot avec une sonde ( ) adjacente au
minisatellite
= spécifique d’un LOCUS
1/1 2/2 1/2
3 kb
2 kb
2.3. minisatellites : PCR
Allèle 1
Allèle 2
1/1 2/2 1/2
PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite
= spécifique d’un LOCUS
Exemple
2.4. Minisatellites - mise en évidence des
allèles sur tout le génome
• Analyse par Southern blot uniquement (PCR
= locus spécifique)
• La sonde s’hybride sur le minisatellite
• Applications : médecine légale, tests de
paternité
- Chaque individu
a une empreinte
différente (sauf
les jumeaux
monozygotes) :
- Utilisation en
médecine légale
- Chaque bande
présente chez
un individu doit
l’être également
soit chez sa
mère soit chez
son père :
- test
d’exclusion de
paternité
(M = mother,
C = child,
F = father)
2.5. Minisatellites - empreinte génétique
2.6. Minisatellites - récapitulation
• Les minisatellites sont:
• Poly-allèliques : grand nombre d’allèles
différents à un locus donné (en fonction du
nombre de répétitions de la séquence)
• Multi-locus : une même séquence de
minisatellite va se trouver à différents
endroits dans le génome (à chaque fois avec
différents allèles possibles)
3. Microsatellites STR (short tandem repeats)
• 1 - 6pb répétées n fois (5 ≤ n ≤ 40)
AAAAAA… - mononucleotide
ATATAT… - dinucleotide
TAGTAGTAG… - trinucleotide
TAGTTAGTTAGT… - tetranucleotide
TAGGCTAGGCTAGGC… - penta nucleotide
• Ex : TGTGTGTGTG…..
• ≥ 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le
génome humain
• Présents sur tout le génome
• Mise en évidence par PCR exclusivement
• Migration en gel d’acrylamide (plus résolutif que
l’agarose)
3.1. microsatellites : PCR
Allèle 1
Allèle 2
1/1 2/2 1/2
PCR avec 2 amorces encadrant le microsatellite
= spécifique d’un LOCUS
3.1. microsatellites : PCR
4. Single Nucleotide polymorphism = SNP
Population
Général 94%
- Causés par mutagénèse chimique ou erreurs de réplication
- bi-allèliques
- ratio des allèles : 99,99 : 0,01 50:50
- Nb loci identifiés chez l’Homme >> 5 millions
- taux de mutation 1.109/génération
- en conséquence, peu de mutations nouvelles dans l’espèce
4. Single Nucleotide polymorphism = SNP
Population
Général 94%
Mise en évidence :
- idéal : le polymorphisme correspond à un RFLP
- PCR-SSCP
- Allèle-Specific Oligonucleotide (ASO)
Micro-arrays
- séquençage
- …
• est caractérisé par des allèles correspondant à chaque
variation possible de la séquence
• degré d’hétérozygotie d’un marqueur H=1 – (Spi2)
• Fonction du nombre et de la fréquence de chacun des
allèles
• Exemple : 3 allèles de fréquence 0,2 / 0,3 / 0,5
Hétérozygotie est de 1- (0,04+0,09 + 0,25) = 0,62
2 allèles de fréquence 0,2 / 0,8 : 1- (0,04 + 0,64)= 0,32
Un marqueur biallèlique ne pourra pas avoir une
hétérozygotie supérieure à 0,5 qui sera atteinte en cas
d’allèles de fréquence égale.
Marqueurs génétiques
II. Applications
1. Gestion de la variabilité génétique
2. Sélection assistée par marqueur génétique
3. Médecine légale
4. Diagnostic de maladies génétiques
- Diagnostic indirect par analyse de liaison
- Diagnostic direct
5. Cartographie et clonage positionnel
MERCI POURVOTRE
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  • 2. Définition – variation individuelle de la séquence nucléotidique – entraînant l’existence au même locus d’au moins 2 formes différentes de la séquence, appelés allèles – dont la fréquence est > à 1% dans la population – intra ou extra-génique – d’effet neutre • En dehors d’un gène • Dans une région non codante d’un gène (intron) • Dans une région codante mais sans altérer la signification (redondance du code génétique)
  • 3. Diversité des séquences humaines - Pour les 95 % non codants Des estimations donnent: 2 génomes humains diffèrent en moyenne par 1/100 à 1/500 nucléotides. Si on pouvait comparer entre l’ADN d’origine paternelle et l’ADN d’origine maternelle chez un individu on trouvait 10 milliard de différence correspondant à l’accumulation de mutations au cours de l’évolution humaine. La proportion totale de bases polymorphiques «Index d’hétérozygotie d’ADN» a été estimé à 1/270pb pour tout segment d’ADN du génome choisi au hasard.
  • 4. Diversité des séquences humaines -Pour les 5 % codants Les régions codantes sont soumises à une sélection plus importante. La présence de mutations dans ces régions est plus faible. Diversité nucléotidique π : Nombre de différences, rapporté à la longueur de la séquence examinée, entre 2 séquences prises au hasard dans la population. AGTCCTA…………..GGAAACTG…………TTTACGT…. AGTGCTA…………..GGTAACTG…………TTGACGT…. 7500 pb π = 3/7500 = 1/2500
  • 5. 1. RFLP bi-allèliques 2. Minisatellites 3. Microsatellites 4. SNP (single nucleotide polymorphism) I. Les Marqueurs polymorphes Comment toutes ces variations ont été détectées?
  • 6. 1. Polymorphisme de la longueur des fragments de restriction [RFLP: Restriction Fragment Length polymorphism] - Ce sont des variations individuelles de la séquence d’ADN révélées par des modifications de la carte de restriction. Mise en évidence par le Southern qui montre des différences obtenues avec une enzyme donnée et une sonde donnée. - Les enzymes de restrictions possèdent des séquences reconnues dans l’ADN, une mutation au niveau de cet ADN entraine la formation ou la perte de site de reconnaissance, ce qui entraine des modifications dans la taille d’un ou plusieurs fragments révélés par Southern. - De même si un segment d’ADN situé entre 2 sites de restriction était délété ou inséré, la taille du fragment de restriction sera différente.
  • 7. Les sites polymorphes Allèle 1 6.5 kb 1.5 kb Allèle 2 8 kb PAS DE SITE INTERNE 1/1 1/2 2/2 8 kb 6.5 kb
  • 8. Les sites polymorphes Allèle 1 4 kb 2.5 kb Allèle 2 8 kb SITE POLYMORPHE INTERNE 1/1 1/2 2/2 8 kb 4 kb 2.5 kb 6.5 kb
  • 9. Les sites polymorphes Allèle 1 4 kb 2.5 kb Allèle 2 SITE INTERNE NON POLYMORPHE SITE EXTERNE POLYMORPHE 1/1 1/2 2/2 8 kb 4 kb 2.5 kb 5.5 kb 2.5 kb 6.5 kb 5.5 kb
  • 10. Les sites polymorphes Allèle 1 1.5 kb 2.5 kb Allèle 2 SITE INTERNE NON POLYMORPHE SITE POLYMORPHE INTERNE 1/1 1/2 2/2 8 kb 4 kb 2.5 kb 4 kb 2.5 kb 6.5 kb 2.5 kb 1.5 kb
  • 11. • Dans toute séquence non codante (97% ADN) • Dans une séquence codante sans conséquence sur la fonction du gène • Si le polymorphisme touche la 3ème base du codon • Allèle 1 CAG ATC TTA (site BglII AGATCT) • Gln Ile Leu • Allèle 2 CAA ATC TTA (site BglII absent) • Gln Ile Leu • Si le changement d’acide aminé n’a pas d’effet sur la fonction • Cas particulier : la mutation étudiée crée un polymorphisme 1.1. RFLP bi-allèliques : localisation
  • 12. EXEMPLE d’un polymorphisme multiallèlique Le polymorphisme de l’apolipoprotéine E Protéine: E2 E3 E4 AA en 112 Cystéine Cystéine Arginine AA en 158 Cystéine Arginine Arginine ADN: Fragment de 292 pb (9 sites de coupure) Hha I: GCG C CGC = Arginine TGC = Cystéine
  • 13. 62 16 91 18 83 7 11 4 62 16 91 18 48 7 11 4 2 cys-cys 3 cys-arg 35 62 16 72 18 48 7 4 35 4 arg-arg 19 11 cys cys cys arg arg arg GCGC GCGC GCGC GTGC GTGC GTGC Génotypage de l’apoE  Amplification par PCR Dénaturation : 30 s à 95°C, Hybridation : 30 s à 60°C Elongation : 1 min à 72°C)  Digestion de l’ADN amplifié par Hha I GCGC (TGC cystéine CGC Arginine)
  • 14. Génotypage de l’apo E 91 83 72 48 35 2/2 3/3 4/4 4/2 2/3 4/3 62 (E2/E2)=91+83+62 (E4/E2)=91+83+72+62+48+35 (E3/E3)=91+62+48+35 (E2/E3)=91+83+62+48+35 (E4/E4)=72+62+48+35 (E4/E3)=91+72+62+48+35
  • 15. 2. Minisatellites: RFLP multi-allèliques VNTR (variable number tandem repeats) CTGGATTAGCTTAAGCGT CTTAGTAGGATGGATGGA GGAGGTTCAGGTGAT--- GGAGGTTCAGGTGATGGA GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGG GGAGGTTCAGGTGATGGA GGAGGTTCAGGTGAT--- ACCTGGGATTCTTCGATC Minisatellite PS3 porcin allèle à 7 répétitions
  • 16. • Répétitions en nombre variable d’une séquence de 10 à 50 pb à un locus donné • Une même séquence de minisatellite va se retrouver à différents loci sur tout le génome • Analyse locus par locus • Analyse de la répartition d’un minisatellite sur le génome entier 2. 1. Répartition des minisatellites
  • 17. 2.2. Minisatellites - mise en évidence des allèles à un locus • Le contexte autour du minisatellite est spécifique d’un locus • Analyse par Southern blot ou PCR • La sonde ou les amorces s’hybrident autour du minisatellite : locus-spécifiques
  • 18. 2.3. minisatellites : Southern blot Allèle 1 Allèle 2 2 kb 3 kb Digestion par l’enzyme Southern blot avec une sonde ( ) adjacente au minisatellite = spécifique d’un LOCUS 1/1 2/2 1/2 3 kb 2 kb
  • 19. 2.3. minisatellites : PCR Allèle 1 Allèle 2 1/1 2/2 1/2 PCR avec 2 amorces encadrant le minisatellite = spécifique d’un LOCUS
  • 21. 2.4. Minisatellites - mise en évidence des allèles sur tout le génome • Analyse par Southern blot uniquement (PCR = locus spécifique) • La sonde s’hybride sur le minisatellite • Applications : médecine légale, tests de paternité
  • 22. - Chaque individu a une empreinte différente (sauf les jumeaux monozygotes) : - Utilisation en médecine légale - Chaque bande présente chez un individu doit l’être également soit chez sa mère soit chez son père : - test d’exclusion de paternité (M = mother, C = child, F = father) 2.5. Minisatellites - empreinte génétique
  • 23. 2.6. Minisatellites - récapitulation • Les minisatellites sont: • Poly-allèliques : grand nombre d’allèles différents à un locus donné (en fonction du nombre de répétitions de la séquence) • Multi-locus : une même séquence de minisatellite va se trouver à différents endroits dans le génome (à chaque fois avec différents allèles possibles)
  • 24. 3. Microsatellites STR (short tandem repeats) • 1 - 6pb répétées n fois (5 ≤ n ≤ 40) AAAAAA… - mononucleotide ATATAT… - dinucleotide TAGTAGTAG… - trinucleotide TAGTTAGTTAGT… - tetranucleotide TAGGCTAGGCTAGGC… - penta nucleotide • Ex : TGTGTGTGTG….. • ≥ 50 000 microsatellites (TG)n dans tout le génome humain • Présents sur tout le génome • Mise en évidence par PCR exclusivement • Migration en gel d’acrylamide (plus résolutif que l’agarose)
  • 25. 3.1. microsatellites : PCR Allèle 1 Allèle 2 1/1 2/2 1/2 PCR avec 2 amorces encadrant le microsatellite = spécifique d’un LOCUS
  • 27. 4. Single Nucleotide polymorphism = SNP Population Général 94% - Causés par mutagénèse chimique ou erreurs de réplication - bi-allèliques - ratio des allèles : 99,99 : 0,01 50:50 - Nb loci identifiés chez l’Homme >> 5 millions - taux de mutation 1.109/génération - en conséquence, peu de mutations nouvelles dans l’espèce
  • 28. 4. Single Nucleotide polymorphism = SNP Population Général 94% Mise en évidence : - idéal : le polymorphisme correspond à un RFLP - PCR-SSCP - Allèle-Specific Oligonucleotide (ASO) Micro-arrays - séquençage - …
  • 29. • est caractérisé par des allèles correspondant à chaque variation possible de la séquence • degré d’hétérozygotie d’un marqueur H=1 – (Spi2) • Fonction du nombre et de la fréquence de chacun des allèles • Exemple : 3 allèles de fréquence 0,2 / 0,3 / 0,5 Hétérozygotie est de 1- (0,04+0,09 + 0,25) = 0,62 2 allèles de fréquence 0,2 / 0,8 : 1- (0,04 + 0,64)= 0,32 Un marqueur biallèlique ne pourra pas avoir une hétérozygotie supérieure à 0,5 qui sera atteinte en cas d’allèles de fréquence égale. Marqueurs génétiques
  • 30. II. Applications 1. Gestion de la variabilité génétique 2. Sélection assistée par marqueur génétique 3. Médecine légale 4. Diagnostic de maladies génétiques - Diagnostic indirect par analyse de liaison - Diagnostic direct 5. Cartographie et clonage positionnel