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Dépistage de
CHU Saint Louis
                   la Primo-Infection VIH-1
    Paris                     &
                  Tests de diagnostic rapides

                                         J Pavie
                                       A Rachline
    Laboratoire de Microbiologie       E Laforgerie
  Service des Maladies infectieuses   W Rozenbaum
                                      C Delaugerre
      CHU Saint Louis de Paris
                                        JM Molina
              Afssaps                    F Simon
Cette présentation !

• QQ rappels et définitions

• Virologie et primo infection

• Tests rapides et primo infection


         Crédits diapos : Simon-Paris , Cunningham-Sydney , Tardy Lyon
Une forte incidence VIH-1 en
               France
~ 6 000 découvertes de séropositivité en 2008
~ ¼ sujets contaminés dans les 6 mois précèdant



         45%                       44%       44%        45%
                 42%     44%
   45%

                                                                   34%         36%


   30%

                                      19%                  18%
           16%     16%     15%                 15%
                                                                       14%        14%
   15%



    0%
         20032   20041   20042    20051     20052       20061     20062      20071
                               semestre de diagnostic

                       Homosexuel            Hétérosexuel


                                                        CNR du VIH et InVS, données du 30/06/07
Des définitions !

•   Analyse de dépistage = mise en évidence des anticorps anti-VIH
    (Ac VIH-1 et VIH-2) et préconisé actuellement de l’antigène p24
    (Ag p24 VIH-1 uniquement)


•   Test Enzyme Linked Immuno Assay ou ELISA (EIA)
    – EIA dite mixte : détecte les AC VIH-1 ET VIH-2.
    – EIA mixte combiné 4 génération : détecte à la fois les Ac VIH et l’ Ag
      p24.
    – Les EIA regroupent les échantillons pour diminuer le coût.
    – Automates de réalisation rapide et de grande qualité ( <320 mn)

•   Confirmation : Western Blots (WB) élimine les résultats
    faussement positifs du dépistage

•    Charge virale –ARN plasmatique: quantification de l’ARN viral
    dans le plasma si quantité > 20 copies /mL
Les moyens du diagnostic
•   ELISA le plus souvent (en UE) combinés ( de 4eme génération dans l’UE) :
    détectent Antigène VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2

•   Tests dit rapides sont des dispositifs unitaires de réalisation simple sans
    apport de matériel et ne nécessitant pas de chaine du froid

•   Western Blot confirment la présence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2

•   L’ARN plasmatique signe la présence d’un VIH réplicatif à partir des cellules
    infectées. Les tests dit de « charge virale » quantifie cette réplication en
    « copie » de virus par mL de plasma

•   L’ADN proviral ou ADN intégré correspond à la présence du provirus dans
    les cellules infectées

•   Les tests de résistance recherchent la présence de mutations du génome
    VIH sous la pression des antirétroviraux
Exemple d’automates EIA (VIH & hépatites et autres )
           EIA 4ème génération Ag + Ac




Architect Abbott                      Microplaques Behring-Siemens




                                                   1 à 2 € le test 4G
                                                  inclus maintenance




                   Vidas bioMérieux
Tests de diagnostic rapide (TDR) :
                    Utilisés depuis plus de 19 ans


                                               Test VIKIA VIH ½ bioMérieux
                                                               ,


Contrôles                                              Réaction positive :
 interne                                               Présence possible
des tests                                            d’anticorps anti VIH-1

                                       T

                              c        c       Test Deterrmine HIV 1-2, Inverness



                   C : bande contrôle de bon fonctionnement du test
                   T : bande de réactivité anti VIH

 0.5 à 8 € le test (salive)
   Pas de maintenance
la confirmation des infections par
 le Western Blot
                                          MW
                                          gp160    
                                          gp120    

   western blot VIH-1 avec les poids
                                            p68 
      moléculaires des principaux           p55 
                                            p52 

                 antigènes                  gp41   {
                                            p40    
      (New Lav blot 1, Biorad-Pasteur).
                                            p34    




                                            p24    




                                            p17    




  12-20 € le test
Pas de maintenance
Les matrices utilisées en dépistage
•   Sang total : sang non décanté avec globules
    rouges et plasma, en général sang capillaire ou
    veineux non centrifugé. Ne peut être conservé

•   Le papier filtre serait une alternative
     – Contrôle, biologie moléculaire…




•   Sérum ou plasma : recueil après centrifugation en
    milieu spécialisé = utilisable pour tous les autres
    tests, idéal pour conservation, traçabilité




•   « Salive » : recueil standardisé entre gencive et
    lèvre inférieur : liquide créviculaire
                                                          ?
Tests sur prélèvements
     de sang total /capillaire ou salive
• La réglementation Française en 2007 restreint
  l’utilisation des tests de dépistage du VIH à des
  prélèvements sériques ou plasmatiques.

• L’utilisation des tests sur prélèvements de sang total
  /capillaire est possible dans d’autres pays dans des
  structures associatives en utilisation en biologie
  délocalisée, de proximité voire au cabinet du médecin

•   Anecdotique en dehors de l’Afrique et des USA
Principes généraux des TDR
Immuno-filtration ou immuno-chromatographie
                                           Conjugé avec or colloidal
                ligne contrôle             +proteine A.
                                 Ligne
                                 du test
                                                           Prélèvement




   Ac anti anticorps humain      Or Colloidal           AC Humains non HIV
                                 Conjugé à la
   Antigene HIV-                  Proteine A            Ac HIV-1/2
   1/2
Marché mondial anarchique : > 80 tests,
   nombreux fabricants ,vendeurs
 et revendeurs (voir du même test !)
Des marquages FDA USA et CE UE différents
             (sauf OraQuick)
Risque de transmission en fonction
                 des stades de l’infection
                      1/25


                  1/1000




                                                 1/50 à 1/1000



                              1/1000
                             1/10 000




Primo-infection                 Phase asymptomatique             SIDA


                                             Galvin S, Cohen M Nat Rev Micro 2004
Faut il traiter une primo infection
                 VIH
Traitements de la primo infection
          (Prospective Randomized Trial Primo-SHM)

 Randomisation
du groupe traité
                     Randomisation du groupe non
                                traité




                                                     NON traite


                                                     traité
                       Arrêt du TTT

    inclusion
                   Durée de suivi en semaines
Diversité des VIH
                      Diversité
                HIV-1 4 groupes
    ?                                                   HIV-2
A                                        HIV-1 P
    HIV-1 O                     HIV-1N
B
                    HIV-1M                K
        A
                                         J                             H
                                                       A
        B                               (I)                           G
                                                       B
            C                       H                      C         F
                D               G                              D E
                    (E)     F       CRF02
                      virus
CRF01-AE*                           Plus de 40 formes recombinantes ouCRFs
                    mosaïques

                 50% d’infection par des sous types B
                 48% par non B , 2% par HIV-2, HIV-O
Conséquences diagnostiques de la
     variabilité des souches
Tous les tests sont construits sur la base d’une reconnaissance des
Infections VIH par souches occidentales HIV-1 M sous type B
(et de VIH-2 sous-type A en sérologie)


                  performances altérées des tests sérologique et
                  moléculaire dans le passé avec les sous-types
                  non-B (séroconversion) et groupe O non détecté

                  TME, AES


                   lors de la primo infection amplifié par la faibel
                   affinité des anticorps et la varaibilité
                   antigénique p24

                   Surveillance moléculaire des génotypes de résistance
Valeurs prédictives
• la sensibilité d'un test est sa capacité de donner un
  résultat positif lorsque l’infection est présente.
• la spécificité est la capacité d'un test de donner un
  résultat négatif lorsque l’infection n'est pas présente.

La valeur prédictive positive est la probabilité que le virus
   soit présent lorsque le test est positif.
La valeur prédictive négative est la probabilité que le virus
   ne soit pas présent lorsque le test est négatif.
 La valeur prédictive est fonction de la sensibilité et de la
   spécificité du test ainsi que de la prévalence de la
   condition à l'étude
Sensibilité , spécificité, valeur prédictive
•   a représente le nombre d'individus malades avec un test positif (les vrais
    positifs),
•   b représente le nombre d'individus non-malades avec un test positif (les
    faux positifs),
•   c représente le nombre d'individus malades avec un test négatif (les faux
    négatifs),
•   d représente le nombre d'individus non-malades avec un test négatif (les
    vrais négatifs)
                                        malade Non malade

                            Test +       a            b
                            Test -       c             d
          sensibilité = a / (a + c)                 VPP = a / (a + b)
          spécificité = d / (d + b                  VPN = d / (c + d)
•La Primo Infection
       VIH-1
Cinétiques des marqueurs de
                                      l’infection
                            symptomes                                      symptomes
                                                        ADN proviral

                                                                       Anticorps anti HIV




                                                                         Charge virale
                                                                         plasmatique
                                         Antigène p24
Limite de détection
    des tests




                      semaines- années


                                                                   D’après Cunningham et al
Positivité
                                            Cinétiques des anticorps lors
ARN AgP24
         EIA 4G EIA 3G TDR sérum         des différentes phases de l’infection
                           TDR sang

                                                                          ARN
                                            Anticorps anti Enveloppe


                                                                           Ag p24

                                                                            p34




                                                                       AC -p24



 12     3    4    5     6                               Années
   Phases précoces                    Infection chronique
ARN         Antigène P24              ANTICORPS                     WESTERN -BLOT

                     Délai en                                           EIA             TDR              P24              P34
                  jours après
                   l’infection
   STADE
     1              6-10 j             +                -                -                -               -                -
     2             11-15 j            ++               ++                -                -               -                -
     3              16-21j            ++                +               +/-               -               -                -
     4             22-30 j             +               +/-               +               +/-             +/-               -
     5             30-180 j            +                -               ++               +/-              +               +/-
     6              >180 j            +/-               -               ++                +              ++               +


              Tableau 1 : cinétique et durée d’apparition des marqueurs précoces d’infection par VIH-1


     ARN : charge virale ; EIA : Elisa de 4eme génération ; TDR : test rapide
      P24 et p34 : anticorps dirigés contre les protéines gag p24 ou pol p34

Adapté de Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors: implications for diagnosis and staging of primary HIV infection.
Fiebig EW, Wright DJ, Rawal BD, Garrett PE, Schumacher RT, Peddada L, Heldebrant C, Smith R, Conrad A, Kleinman SH, Busch MP. AIDS.
2003 Sep 5;17(13):1871-9.
Western blot séquentiels
          Séroconversion non traitée




              Semaines post infection

dynamique longue pour « compléter » un western blot

                                        D’Après Cunningham et al
Réactivité et séquence d’apparition des anticorps anti VIH-1




               J0    J20   J21   J23    J25   J30   J35   J50
Caucasien , 23 ans ,infection VIH en Somalie / Génotype A Séroconversion lente ARN
                                       négatif




               Délai plus marqué d’appartion des bandes
     de réactivité au WB lors de sprimo infection par variant non B
Blocage d’apparition des anticorps lors des TPE
Cinétique des
 marqueurs
sensibilité de
 détection




                  Stade précoce    Infection établie   Stade tardif


         P24 Ag
4 & 3 gen ELISA
          TDR

           1S         2S      6S   6M          5 Ans   7-10 Ans


                                                                Adapté de Cunningham et al
Les test rapides et la primo-
            infection

– Incidence et dépistage
– Les TDR 2009
– Evaluations Afssaps des TDR sur sérum
– Evaluation St Louis des TDR sur sang total
– En pratique….
Incidence du VIH et bénéfice du test ELISA 4 Génération
Incidence du VIH Laboratoire St Vincent Hospital , Sydney
Les tests marqués CE sérum et sang total – salive en 2009
                           disponible en France

                NOM                              Fabricant                      Distributeur   Matrices
     •     INSTI HIV ½                        Biolytical (Ca)                      Servibio    ST, S, P
          VIKIA HIV 1/2                         Biomerieux                      Biomerieux     ST, S, P


      Determine HIV 1-2                     Unipath Ltd (UK)                     Inverness*    ST, S, P
           Core HIV 1/2                    Core Diagn. (UK)                         Ivagen         S
   Immunoflow HIV1-HIV2                    Core Diagn. (UK)                       Fumouze          S
  ImmunoComb II HIV1+2                      Orgenics Ltd (Is)                    Inverness       S, P
         Bispot
   Doublecheck II HIV 1/2                   Orgenics Ltd (Is)                    Inverness       S, P
         Retroscreen HIV                     Qualpro Diagn.                        All Diag      S, P
                                                  (In)
       Oraquick Advance                         Orasure (US)                       Orgentec    Sal, ST, P

     Determine Combo                        Unipath Ldt (UK)                      Inverness    ST, S, P

 *Suite à la faillite d’Ivagen, la distribution est directement assurée par Core Diagn.



     Tableau 2 : Principaux tests rapides commercialisés en France avec marquage CE
pour une utilisation sur sang total (ST) et sur serum (S) , plasma (P), liquide craviculaire (Sal)
Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps
sur serum en 2008 hors primo infection
            HIV positive sera (n=100)
                                                    HIV
                 HIV-1                   HIV-2   negative
                                         (n=5)     sera
          Group M                                 (n=50)
Subtype B   Non-B    Samples   Group O
 (n=46)   subtypes     with     (n=2)
           (n=41) indetermi
                     nate WB
                      (n=6)



   0     1 subtype     0          2       0         1
             A                  Core             Determin
            Core               HIV1&2            HIV 1/2
          HIV1&2
         Immunoflo
              w
         Retroscreen
             HIV
Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps sur serum
            sur panel de séro conversion
        Sample   Timing                      test(s)
                                             Negatifs
Panel
9079      10     13/12/99                  Tous négatifs
9079      11     18/12/99   Determine, DoubleCheck, ImmunoComb, INSTI,
                                               VIKIA
9079      12     20/12/99              ImmunoComb, VIKIA
9079      13     26/12/99                  Tous positifs
9079      14     28/12/99                      Core
9079      15     02/01/00                      Core




9032      8      30/07/98                  Tous négatifs
9032      9      04/08/98   Determine, DoubleCheck, ImmunoComb, VIKIA

9032      10     11/08/98                 ImmunoComb
9032      11     13/08/98                  Tous positifs

9032      12     24/08/98                      Core
Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps
                 sur serum en 2008


• Taux global de reconnaissance des TDR

               53 à 76% selon la trousse


• Résultats lors des contrôles Afssaps (2005-
  2007)
   –   TDR : 30-68%
   –   Test 3e génération : 70%
   –   Test 4e génération : 74-96%
Ré-évaluation des 4 tests CE Sur sang total et du test «
          salive » et du Determine « 4eme génération » en cours à
              St Louis (JM Molina- W Rozembaum – F Simon) )


         CPrincipe detotypeine HIV-1/2
         Clickhere to typepage title
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                             Si patient HIVpositif
                                           2
 Fenêtre contrôle
 Anticorps anti-HIV1/2            barres
                             Ac-AgSe-Ac
 Fenêtre patient           Ag-Ac-AgSe
   Ag HIV-1/HIV-2
                             Ac-AgSe
  Zone conjugué
  A H
   g IV-Sélénium
                             Ac : sérumpatient
                                                                                    Vikia bioMérieux
Determine Inverness
                                                     OraQuick sang et salive




                                                         Insti Biolytical


                         4 tests marqués CE pour l’utilisation sur sang total, un pour la salive
                                                                               Clearview Inverness en attente
- ETUDE DE LA SENSIBILITE DE 4 TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE DE
    L’INFECTION PAR LE VIH SUR SANG CAPILLAIRE ET SALIVE



• Objectifs
• Estimer la sensibilité et praticabilité des TDR en
  pratique réelle avec 200 patients infectés par VIH1 ou
  VIH2 et représentant la diversité des situations cliniques
  et virologiques et de 20 patients séronégatifs « contrôle »
• Etudier la des TDR en situation hors laboratoire, par un
  personnel médical non biologiste
Sensibilité de 4 tests de diagnostic rapide marqués
CE sur sang capillaire et salive en situation de soins

 – Etude Prospective biomédicale par Afssaps / CPP CHU St -
   Louis

 – 200 volontaires VIH + & 20 VIH- (blind reading)

 - Prélèvements capillaires salivaires et veineux

 - Tous les tests marqués CE en décembre 08 pour
   salive et sang total

 – Résultat lus comme positif, douteux, negatif, ou
   invalide contrôle interne du test non lisible )

 – Les tests négatifs , ou invalides ont été retestés sur
   le serum congelé
Resultats            - patients VIH+
n =200            Oraquick Oraquick     Vikia    Determine   Determine    INSTI
                  Oral fluid Blood      blood      Blood      Ag +Ac      Blood
                     Ac       Ac                    Ac        4th blood     Ac
Negatif              27         11        3         10           7         2

Douteux              10         6         1         1            7         4

Invalide              0         0         0         4           33         2

Positif             163        183       196       185          153       192

Sensibilité       86.5% *    94.5%     98.5%      94.9%       95.8%       99%
                  * p 0.02

- 60 tests ont été lus comme négatifs particulièrement avec Oraquick salive
- u moins un négatif pour 36/200 patients, soit 20B, 13 non B , 2HIV-2, 1 HIV0
- taux élevé d’invalides avec le Determine 4th
- Aucune détection d’ag p24 Ag y compris lors des primo infection y compris en
présence confirmée de p24 sur sérum à 380pg/ml
7 prélèvements avec au moins deux TDR
                       négatifs sur sang total

     I D ( n = 36)      Genotype      Oraquick    Vikia     Determine    INSTI     Determine
   (Chronic stage                       sang                                        4th GEN
or primary infection)
         50              (HIV- 0)     negative      +        negative      +       doubtful
 66 (A, TTT, CV<25)         B         negative   doubtful    negative   doubtful   Negative

67 (primo infection)*       B         negative   negative    negative   negative   negative

70 (A, TTT ,CV <25)         B         negative   negative    negative   doubtful   negative
73 (primo infection)        F         negative   negative    negative     +/-      negative
128 (A, TTT ,CV <25)    Non typable   negative      +           +       negative      +
184 ( primo infection       B            +          +       negative       +       negative
   il y a 5 mois)



 * Ag P24 = 380 pg/mL

              Résultats nettement améliorée sur les sérum correspondant
Résultats comparés
                            tous les TDR positifs   > 1 test negatif
                                   n=164                n=36


Mediane âge                         41                   44.5
Genre féminin (n,%)              28 (17%)             6 (16.6%)
Stade C CDC (n,%)               37 (22.5%)           11( 30.5%)
Caucasien                       93 (56.7%)           26 (72.2%)
Afrique sub-sahara              53 (32.3%)            8 (22.2%)
Autres                           18 (11%)              2(5.6%)
infection HBV-HCV (n,%)          14 (8.5%)            3 (8.3%)
HAART (n,%)                     108 (65%)            29 (80.5%)
Médiane date d’ infection          2002                 2001
Médiane CD4                         416                  500
HIV VL <200 cp/ml (n,%)         86 (52.4%)           29 (80.5%)
HIV-1 B subtype (n,%)          106 (64.3%)           20 (55.5 %)
Synthèse des résultats

• Oraquick Oral = manque de sensibilité (p = 0.02).
• Important nombre de faux négatif (> 5%) en sang
  capillaire
• Incapable de reconnaitre les patients en primo
  infection
• Y compris pour deux des TDR, plus de 4 mois
  après la primo infection
• Sensibilité nettement améliorée lors du passage
  au sérum
32 PATIENTS ag p24 + : 10 PI ; 22 CHRONIQUES
     Détection de l’ag P24 sur le sérum par Determine 4G


 AgP24        > 400      400-100       100-50          50-5
 (pg/ml)

Référence       6            4             5             17
 EIA P24
  VIDAS
Determine       4            3             1               0
 4eme G
    Ag
 POSITIF
                                        JC Tardy , Lyon 2009
exemple        J0 CV 108.000.000 copies/ml ; CRF02


       TDR      TDR       EIA     EIA     P24        WB
          AC      Ag     Ag+AC     AC
 J0       0       +       13       0     >400         0

+2j       0       0       11       7     >400        ND

+6j       +       0        8      18       79        ND

+13j      +       0       7,4     20       13        Env


                                   JC Tardy , Lyon 2009
Nouvelle génération de TDR
                    &
             Primo –infection

• Le premier 4th génération Determine 4G
  doit s’améliorer en terme de sensibilité de
  détection de l’ag P 24 et de validation
• D’autres compétiteurs en course
• Mais le sang total restera toujours une
  matrice « difficile » et de sensibilité
  inférieure au sérum
Limites des TDR

• Difficulté d’évaluation sur sang total et salive
  des primo infections
• Sensibilité moindre (primo-infection) que les
  tests Elisa donc risque de faux-négatifs y
  compris dans les mois suivants la
  séroconverion en EIA
• fréquence des faux positifs
• Lecture subjective
• Archivage difficile (photo ? )
• Négligence des autres IST, absence de TDR
  pour HBV marqué CE obligeant à EIA, Σ
• coûts
Quand rendre un TDR négatif
     par rapport à un risque
Un TDR négatif 3 mois après
 l’exposition supposée signera
 l’absence d’infection pour ce risque

Ce délai très court (trop ??) est lié à la
 moindre sensibilité des TDR en primo
 infection et à l’incidence des VIH dans
 notre pays couplée à la diversité
 génotypiques des souches en circulation
Aids, test at home for HIV, € 21,95 a reliable, fast and discret test
TDR Sang total -                               TDR Sang total + ou +/-


          HIV négatif                                     Nouveau prélèvement
 Sauf exposition VIH dans les 3
   mois précédents ou situations
d’immunosuppression profonde ou
         de variants rares
                                                         Recherche Ac ant VIH-1
                                               et VIH-2 et d’ Ag P24 par un test Elisa 4ème
                                              génération (EIA) et par un Western Blot (WB)

  HIV positif                EIA +
                                             EIA –                      EIA +
 EIA + & WB +                WB +
                                             WB + ou -                  WB +/- ou -
  Infection VIH
    confirmée
A différencier entre                                                  Primo-infection
  VIH-1 et VIH-2              - réaction non spécifique
                                                                    Probable ou VIH-2
                                   - Erreur d’identification



                                         Nouveau contrôle sérologique
                            et explorations complémentaires = ARN, suspicion variants


  Algorithme simplifié de dépistage TDR (Adultes et enfants de plus de 18 mois)
Les TDR et la HAS :
Vers de nouvelles stratégies de dépistage
 Pour améliorer l’accès aux structures
 traditionnelles d’offre de dépistage (CDAG,
 CIDDIST, etc.) ou dans des structures
 alternatives
 Vers les populations hors institutions,
 marginalisées, sans droit sécurité sociale,
 etc.)

 Proposé sur sang total ou sur salive par des
 professionnels de santé et des personnes
 habilitées. Dans tous les cas, le recours aux TDR
 doit s’inscrire dans le cadre d’une démarche
 structurée d’évaluation
TDR octobre 2009
Les TDR actuels marqués CE seront considérés pour
les meilleurs d’entre eux comme équivalents en terme de
sensibilité aux des tests ELISA de troisième
génération –

Ils sont difficilement évaluable sur sang total /liquide
crévicualaire pour les primo infections

-Marquage CE du ressort du fabricant :   surveiller les TDR sur
sang total : soutien des patients

-Le test TDR avec détection antigène p24 et anticorps ne reconnait
pas ou peu l’ag p24 non B et reste difficilement évaluable pour les
primo infections sur sang total
Le TDR 2009 : en « creux » par
    rapport aux Elisa mais reste
    d’intérêt si bonne utilisation
• Les TDR peuvent être très utiles en phase
  chronique de l’infection
• Tous patients en phase chronique non connu et
  dépisté par un TDR : un bénéfice pour lui et
  pour tous
• Le TDR négatif en groupe de forte incidence doit
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Primo-infection et tests rapides - François Simon - Rencontre du Crips/Vih.org

  • 1. Dépistage de CHU Saint Louis la Primo-Infection VIH-1 Paris & Tests de diagnostic rapides J Pavie A Rachline Laboratoire de Microbiologie E Laforgerie Service des Maladies infectieuses W Rozenbaum C Delaugerre CHU Saint Louis de Paris JM Molina Afssaps F Simon
  • 2. Cette présentation ! • QQ rappels et définitions • Virologie et primo infection • Tests rapides et primo infection Crédits diapos : Simon-Paris , Cunningham-Sydney , Tardy Lyon
  • 3. Une forte incidence VIH-1 en France ~ 6 000 découvertes de séropositivité en 2008 ~ ¼ sujets contaminés dans les 6 mois précèdant 45% 44% 44% 45% 42% 44% 45% 34% 36% 30% 19% 18% 16% 16% 15% 15% 14% 14% 15% 0% 20032 20041 20042 20051 20052 20061 20062 20071 semestre de diagnostic Homosexuel Hétérosexuel CNR du VIH et InVS, données du 30/06/07
  • 4. Des définitions ! • Analyse de dépistage = mise en évidence des anticorps anti-VIH (Ac VIH-1 et VIH-2) et préconisé actuellement de l’antigène p24 (Ag p24 VIH-1 uniquement) • Test Enzyme Linked Immuno Assay ou ELISA (EIA) – EIA dite mixte : détecte les AC VIH-1 ET VIH-2. – EIA mixte combiné 4 génération : détecte à la fois les Ac VIH et l’ Ag p24. – Les EIA regroupent les échantillons pour diminuer le coût. – Automates de réalisation rapide et de grande qualité ( <320 mn) • Confirmation : Western Blots (WB) élimine les résultats faussement positifs du dépistage • Charge virale –ARN plasmatique: quantification de l’ARN viral dans le plasma si quantité > 20 copies /mL
  • 5. Les moyens du diagnostic • ELISA le plus souvent (en UE) combinés ( de 4eme génération dans l’UE) : détectent Antigène VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2 • Tests dit rapides sont des dispositifs unitaires de réalisation simple sans apport de matériel et ne nécessitant pas de chaine du froid • Western Blot confirment la présence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 • L’ARN plasmatique signe la présence d’un VIH réplicatif à partir des cellules infectées. Les tests dit de « charge virale » quantifie cette réplication en « copie » de virus par mL de plasma • L’ADN proviral ou ADN intégré correspond à la présence du provirus dans les cellules infectées • Les tests de résistance recherchent la présence de mutations du génome VIH sous la pression des antirétroviraux
  • 6. Exemple d’automates EIA (VIH & hépatites et autres ) EIA 4ème génération Ag + Ac Architect Abbott Microplaques Behring-Siemens 1 à 2 € le test 4G inclus maintenance Vidas bioMérieux
  • 7. Tests de diagnostic rapide (TDR) : Utilisés depuis plus de 19 ans Test VIKIA VIH ½ bioMérieux , Contrôles Réaction positive : interne Présence possible des tests d’anticorps anti VIH-1 T c c Test Deterrmine HIV 1-2, Inverness C : bande contrôle de bon fonctionnement du test T : bande de réactivité anti VIH 0.5 à 8 € le test (salive) Pas de maintenance
  • 8. la confirmation des infections par le Western Blot MW gp160  gp120  western blot VIH-1 avec les poids p68  moléculaires des principaux p55  p52  antigènes gp41 { p40  (New Lav blot 1, Biorad-Pasteur). p34  p24  p17  12-20 € le test Pas de maintenance
  • 9. Les matrices utilisées en dépistage • Sang total : sang non décanté avec globules rouges et plasma, en général sang capillaire ou veineux non centrifugé. Ne peut être conservé • Le papier filtre serait une alternative – Contrôle, biologie moléculaire… • Sérum ou plasma : recueil après centrifugation en milieu spécialisé = utilisable pour tous les autres tests, idéal pour conservation, traçabilité • « Salive » : recueil standardisé entre gencive et lèvre inférieur : liquide créviculaire ?
  • 10. Tests sur prélèvements de sang total /capillaire ou salive • La réglementation Française en 2007 restreint l’utilisation des tests de dépistage du VIH à des prélèvements sériques ou plasmatiques. • L’utilisation des tests sur prélèvements de sang total /capillaire est possible dans d’autres pays dans des structures associatives en utilisation en biologie délocalisée, de proximité voire au cabinet du médecin • Anecdotique en dehors de l’Afrique et des USA
  • 11. Principes généraux des TDR Immuno-filtration ou immuno-chromatographie Conjugé avec or colloidal ligne contrôle +proteine A. Ligne du test Prélèvement Ac anti anticorps humain Or Colloidal AC Humains non HIV Conjugé à la Antigene HIV- Proteine A Ac HIV-1/2 1/2
  • 12. Marché mondial anarchique : > 80 tests, nombreux fabricants ,vendeurs et revendeurs (voir du même test !)
  • 13. Des marquages FDA USA et CE UE différents (sauf OraQuick)
  • 14. Risque de transmission en fonction des stades de l’infection 1/25 1/1000 1/50 à 1/1000 1/1000 1/10 000 Primo-infection Phase asymptomatique SIDA Galvin S, Cohen M Nat Rev Micro 2004
  • 15. Faut il traiter une primo infection VIH
  • 16. Traitements de la primo infection (Prospective Randomized Trial Primo-SHM) Randomisation du groupe traité Randomisation du groupe non traité NON traite traité Arrêt du TTT inclusion Durée de suivi en semaines
  • 17. Diversité des VIH Diversité HIV-1 4 groupes ? HIV-2 A HIV-1 P HIV-1 O HIV-1N B HIV-1M K A J H A B (I) G B C H C F D G D E (E) F CRF02 virus CRF01-AE* Plus de 40 formes recombinantes ouCRFs mosaïques 50% d’infection par des sous types B 48% par non B , 2% par HIV-2, HIV-O
  • 18. Conséquences diagnostiques de la variabilité des souches Tous les tests sont construits sur la base d’une reconnaissance des Infections VIH par souches occidentales HIV-1 M sous type B (et de VIH-2 sous-type A en sérologie) performances altérées des tests sérologique et moléculaire dans le passé avec les sous-types non-B (séroconversion) et groupe O non détecté TME, AES lors de la primo infection amplifié par la faibel affinité des anticorps et la varaibilité antigénique p24 Surveillance moléculaire des génotypes de résistance
  • 19. Valeurs prédictives • la sensibilité d'un test est sa capacité de donner un résultat positif lorsque l’infection est présente. • la spécificité est la capacité d'un test de donner un résultat négatif lorsque l’infection n'est pas présente. La valeur prédictive positive est la probabilité que le virus soit présent lorsque le test est positif. La valeur prédictive négative est la probabilité que le virus ne soit pas présent lorsque le test est négatif. La valeur prédictive est fonction de la sensibilité et de la spécificité du test ainsi que de la prévalence de la condition à l'étude
  • 20. Sensibilité , spécificité, valeur prédictive • a représente le nombre d'individus malades avec un test positif (les vrais positifs), • b représente le nombre d'individus non-malades avec un test positif (les faux positifs), • c représente le nombre d'individus malades avec un test négatif (les faux négatifs), • d représente le nombre d'individus non-malades avec un test négatif (les vrais négatifs) malade Non malade Test + a b Test - c d sensibilité = a / (a + c) VPP = a / (a + b) spécificité = d / (d + b VPN = d / (c + d)
  • 22. Cinétiques des marqueurs de l’infection symptomes symptomes ADN proviral Anticorps anti HIV Charge virale plasmatique Antigène p24 Limite de détection des tests semaines- années D’après Cunningham et al
  • 23. Positivité Cinétiques des anticorps lors ARN AgP24 EIA 4G EIA 3G TDR sérum des différentes phases de l’infection TDR sang ARN Anticorps anti Enveloppe Ag p24 p34 AC -p24 12 3 4 5 6 Années Phases précoces Infection chronique
  • 24. ARN Antigène P24 ANTICORPS WESTERN -BLOT Délai en EIA TDR P24 P34 jours après l’infection STADE 1 6-10 j + - - - - - 2 11-15 j ++ ++ - - - - 3 16-21j ++ + +/- - - - 4 22-30 j + +/- + +/- +/- - 5 30-180 j + - ++ +/- + +/- 6 >180 j +/- - ++ + ++ + Tableau 1 : cinétique et durée d’apparition des marqueurs précoces d’infection par VIH-1 ARN : charge virale ; EIA : Elisa de 4eme génération ; TDR : test rapide P24 et p34 : anticorps dirigés contre les protéines gag p24 ou pol p34 Adapté de Dynamics of HIV viremia and antibody seroconversion in plasma donors: implications for diagnosis and staging of primary HIV infection. Fiebig EW, Wright DJ, Rawal BD, Garrett PE, Schumacher RT, Peddada L, Heldebrant C, Smith R, Conrad A, Kleinman SH, Busch MP. AIDS. 2003 Sep 5;17(13):1871-9.
  • 25. Western blot séquentiels Séroconversion non traitée Semaines post infection dynamique longue pour « compléter » un western blot D’Après Cunningham et al
  • 26. Réactivité et séquence d’apparition des anticorps anti VIH-1 J0 J20 J21 J23 J25 J30 J35 J50
  • 27. Caucasien , 23 ans ,infection VIH en Somalie / Génotype A Séroconversion lente ARN négatif Délai plus marqué d’appartion des bandes de réactivité au WB lors de sprimo infection par variant non B
  • 28. Blocage d’apparition des anticorps lors des TPE
  • 29. Cinétique des marqueurs sensibilité de détection Stade précoce Infection établie Stade tardif P24 Ag 4 & 3 gen ELISA TDR 1S 2S 6S 6M 5 Ans 7-10 Ans Adapté de Cunningham et al
  • 30. Les test rapides et la primo- infection – Incidence et dépistage – Les TDR 2009 – Evaluations Afssaps des TDR sur sérum – Evaluation St Louis des TDR sur sang total – En pratique….
  • 31. Incidence du VIH et bénéfice du test ELISA 4 Génération
  • 32. Incidence du VIH Laboratoire St Vincent Hospital , Sydney
  • 33. Les tests marqués CE sérum et sang total – salive en 2009 disponible en France NOM Fabricant Distributeur Matrices • INSTI HIV ½ Biolytical (Ca) Servibio ST, S, P VIKIA HIV 1/2 Biomerieux Biomerieux ST, S, P Determine HIV 1-2 Unipath Ltd (UK) Inverness* ST, S, P Core HIV 1/2 Core Diagn. (UK) Ivagen S Immunoflow HIV1-HIV2 Core Diagn. (UK) Fumouze S ImmunoComb II HIV1+2 Orgenics Ltd (Is) Inverness S, P Bispot Doublecheck II HIV 1/2 Orgenics Ltd (Is) Inverness S, P Retroscreen HIV Qualpro Diagn. All Diag S, P (In) Oraquick Advance Orasure (US) Orgentec Sal, ST, P Determine Combo Unipath Ldt (UK) Inverness ST, S, P *Suite à la faillite d’Ivagen, la distribution est directement assurée par Core Diagn. Tableau 2 : Principaux tests rapides commercialisés en France avec marquage CE pour une utilisation sur sang total (ST) et sur serum (S) , plasma (P), liquide craviculaire (Sal)
  • 34. Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps sur serum en 2008 hors primo infection HIV positive sera (n=100) HIV HIV-1 HIV-2 negative (n=5) sera Group M (n=50) Subtype B Non-B Samples Group O (n=46) subtypes with (n=2) (n=41) indetermi nate WB (n=6) 0 1 subtype 0 2 0 1 A Core Determin Core HIV1&2 HIV 1/2 HIV1&2 Immunoflo w Retroscreen HIV
  • 35. Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps sur serum sur panel de séro conversion Sample Timing test(s) Negatifs Panel 9079 10 13/12/99 Tous négatifs 9079 11 18/12/99 Determine, DoubleCheck, ImmunoComb, INSTI, VIKIA 9079 12 20/12/99 ImmunoComb, VIKIA 9079 13 26/12/99 Tous positifs 9079 14 28/12/99 Core 9079 15 02/01/00 Core 9032 8 30/07/98 Tous négatifs 9032 9 04/08/98 Determine, DoubleCheck, ImmunoComb, VIKIA 9032 10 11/08/98 ImmunoComb 9032 11 13/08/98 Tous positifs 9032 12 24/08/98 Core
  • 36. Etude des 8 TDR marqués CE - Affsaps sur serum en 2008 • Taux global de reconnaissance des TDR 53 à 76% selon la trousse • Résultats lors des contrôles Afssaps (2005- 2007) – TDR : 30-68% – Test 3e génération : 70% – Test 4e génération : 74-96%
  • 37. Ré-évaluation des 4 tests CE Sur sang total et du test « salive » et du Determine « 4eme génération » en cours à St Louis (JM Molina- W Rozembaum – F Simon) ) CPrincipe detotypeine HIV-1/2 Clickhere to typepage title lick here Determ page title Si patient HIVpositif 2 Fenêtre contrôle Anticorps anti-HIV1/2 barres Ac-AgSe-Ac Fenêtre patient Ag-Ac-AgSe Ag HIV-1/HIV-2 Ac-AgSe Zone conjugué A H g IV-Sélénium Ac : sérumpatient Vikia bioMérieux Determine Inverness OraQuick sang et salive Insti Biolytical 4 tests marqués CE pour l’utilisation sur sang total, un pour la salive Clearview Inverness en attente
  • 38. - ETUDE DE LA SENSIBILITE DE 4 TESTS DE DIAGNOSTIC RAPIDE DE L’INFECTION PAR LE VIH SUR SANG CAPILLAIRE ET SALIVE • Objectifs • Estimer la sensibilité et praticabilité des TDR en pratique réelle avec 200 patients infectés par VIH1 ou VIH2 et représentant la diversité des situations cliniques et virologiques et de 20 patients séronégatifs « contrôle » • Etudier la des TDR en situation hors laboratoire, par un personnel médical non biologiste
  • 39. Sensibilité de 4 tests de diagnostic rapide marqués CE sur sang capillaire et salive en situation de soins – Etude Prospective biomédicale par Afssaps / CPP CHU St - Louis – 200 volontaires VIH + & 20 VIH- (blind reading) - Prélèvements capillaires salivaires et veineux - Tous les tests marqués CE en décembre 08 pour salive et sang total – Résultat lus comme positif, douteux, negatif, ou invalide contrôle interne du test non lisible ) – Les tests négatifs , ou invalides ont été retestés sur le serum congelé
  • 40. Resultats - patients VIH+ n =200 Oraquick Oraquick Vikia Determine Determine INSTI Oral fluid Blood blood Blood Ag +Ac Blood Ac Ac Ac 4th blood Ac Negatif 27 11 3 10 7 2 Douteux 10 6 1 1 7 4 Invalide 0 0 0 4 33 2 Positif 163 183 196 185 153 192 Sensibilité 86.5% * 94.5% 98.5% 94.9% 95.8% 99% * p 0.02 - 60 tests ont été lus comme négatifs particulièrement avec Oraquick salive - u moins un négatif pour 36/200 patients, soit 20B, 13 non B , 2HIV-2, 1 HIV0 - taux élevé d’invalides avec le Determine 4th - Aucune détection d’ag p24 Ag y compris lors des primo infection y compris en présence confirmée de p24 sur sérum à 380pg/ml
  • 41. 7 prélèvements avec au moins deux TDR négatifs sur sang total I D ( n = 36) Genotype Oraquick Vikia Determine INSTI Determine (Chronic stage sang 4th GEN or primary infection) 50 (HIV- 0) negative + negative + doubtful 66 (A, TTT, CV<25) B negative doubtful negative doubtful Negative 67 (primo infection)* B negative negative negative negative negative 70 (A, TTT ,CV <25) B negative negative negative doubtful negative 73 (primo infection) F negative negative negative +/- negative 128 (A, TTT ,CV <25) Non typable negative + + negative + 184 ( primo infection B + + negative + negative il y a 5 mois) * Ag P24 = 380 pg/mL Résultats nettement améliorée sur les sérum correspondant
  • 42. Résultats comparés tous les TDR positifs > 1 test negatif n=164 n=36 Mediane âge 41 44.5 Genre féminin (n,%) 28 (17%) 6 (16.6%) Stade C CDC (n,%) 37 (22.5%) 11( 30.5%) Caucasien 93 (56.7%) 26 (72.2%) Afrique sub-sahara 53 (32.3%) 8 (22.2%) Autres 18 (11%) 2(5.6%) infection HBV-HCV (n,%) 14 (8.5%) 3 (8.3%) HAART (n,%) 108 (65%) 29 (80.5%) Médiane date d’ infection 2002 2001 Médiane CD4 416 500 HIV VL <200 cp/ml (n,%) 86 (52.4%) 29 (80.5%) HIV-1 B subtype (n,%) 106 (64.3%) 20 (55.5 %)
  • 43. Synthèse des résultats • Oraquick Oral = manque de sensibilité (p = 0.02). • Important nombre de faux négatif (> 5%) en sang capillaire • Incapable de reconnaitre les patients en primo infection • Y compris pour deux des TDR, plus de 4 mois après la primo infection • Sensibilité nettement améliorée lors du passage au sérum
  • 44. 32 PATIENTS ag p24 + : 10 PI ; 22 CHRONIQUES Détection de l’ag P24 sur le sérum par Determine 4G AgP24 > 400 400-100 100-50 50-5 (pg/ml) Référence 6 4 5 17 EIA P24 VIDAS Determine 4 3 1 0 4eme G Ag POSITIF JC Tardy , Lyon 2009
  • 45. exemple J0 CV 108.000.000 copies/ml ; CRF02 TDR TDR EIA EIA P24 WB AC Ag Ag+AC AC J0 0 + 13 0 >400 0 +2j 0 0 11 7 >400 ND +6j + 0 8 18 79 ND +13j + 0 7,4 20 13 Env JC Tardy , Lyon 2009
  • 46. Nouvelle génération de TDR & Primo –infection • Le premier 4th génération Determine 4G doit s’améliorer en terme de sensibilité de détection de l’ag P 24 et de validation • D’autres compétiteurs en course • Mais le sang total restera toujours une matrice « difficile » et de sensibilité inférieure au sérum
  • 47. Limites des TDR • Difficulté d’évaluation sur sang total et salive des primo infections • Sensibilité moindre (primo-infection) que les tests Elisa donc risque de faux-négatifs y compris dans les mois suivants la séroconverion en EIA • fréquence des faux positifs • Lecture subjective • Archivage difficile (photo ? ) • Négligence des autres IST, absence de TDR pour HBV marqué CE obligeant à EIA, Σ • coûts
  • 48. Quand rendre un TDR négatif par rapport à un risque Un TDR négatif 3 mois après l’exposition supposée signera l’absence d’infection pour ce risque Ce délai très court (trop ??) est lié à la moindre sensibilité des TDR en primo infection et à l’incidence des VIH dans notre pays couplée à la diversité génotypiques des souches en circulation
  • 49. Aids, test at home for HIV, € 21,95 a reliable, fast and discret test
  • 50. TDR Sang total - TDR Sang total + ou +/- HIV négatif Nouveau prélèvement Sauf exposition VIH dans les 3 mois précédents ou situations d’immunosuppression profonde ou de variants rares Recherche Ac ant VIH-1 et VIH-2 et d’ Ag P24 par un test Elisa 4ème génération (EIA) et par un Western Blot (WB) HIV positif EIA + EIA – EIA + EIA + & WB + WB + WB + ou - WB +/- ou - Infection VIH confirmée A différencier entre Primo-infection VIH-1 et VIH-2 - réaction non spécifique Probable ou VIH-2 - Erreur d’identification Nouveau contrôle sérologique et explorations complémentaires = ARN, suspicion variants Algorithme simplifié de dépistage TDR (Adultes et enfants de plus de 18 mois)
  • 51. Les TDR et la HAS : Vers de nouvelles stratégies de dépistage Pour améliorer l’accès aux structures traditionnelles d’offre de dépistage (CDAG, CIDDIST, etc.) ou dans des structures alternatives Vers les populations hors institutions, marginalisées, sans droit sécurité sociale, etc.) Proposé sur sang total ou sur salive par des professionnels de santé et des personnes habilitées. Dans tous les cas, le recours aux TDR doit s’inscrire dans le cadre d’une démarche structurée d’évaluation
  • 52. TDR octobre 2009 Les TDR actuels marqués CE seront considérés pour les meilleurs d’entre eux comme équivalents en terme de sensibilité aux des tests ELISA de troisième génération – Ils sont difficilement évaluable sur sang total /liquide crévicualaire pour les primo infections -Marquage CE du ressort du fabricant : surveiller les TDR sur sang total : soutien des patients -Le test TDR avec détection antigène p24 et anticorps ne reconnait pas ou peu l’ag p24 non B et reste difficilement évaluable pour les primo infections sur sang total
  • 53. Le TDR 2009 : en « creux » par rapport aux Elisa mais reste d’intérêt si bonne utilisation • Les TDR peuvent être très utiles en phase chronique de l’infection • Tous patients en phase chronique non connu et dépisté par un TDR : un bénéfice pour lui et pour tous • Le TDR négatif en groupe de forte incidence doit être interprété avec délicatesse • Vont s’améliorer avec l’arrivé des test « big manufacturer »
  • 54. QUIZ