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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE POPULAIRE
                       Ministère de L'enseignement et de Recherche
                            Université Mohamed Khidher BISKRA
            Faculté des sciences exacte et des sciences de la nature et de la vie
                     Département des sciences de la nature et de la vie
                    1ère Année Master Biochimie et Biologie Moléculaire
                             Module : notion de gêné génétique
                                        groupe : 01
                                                                   Présenté par:

                                                       -AOUN DALLAL

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                                                      -Ben abbes kaltoume hanane

                                                       -BOUGHDIRI HIND
hargé de module :
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                                                       -Lebbal Moufida

                                                      -OULD AMMAR Soumia
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                                         Thème :

                              L’éléctrophorése et ses application
                                          sur les protéines
Plan de travail
   1/ Généralité sur l’éléctrophorése et les protéines

2/ Matériels et méthodes

 3/ Les applications de l’électrophorèse sur les protéines
Introduction :



     Comme il est possible de séparer les types cellulaires vivants
    qui constituent un tissu, il est possible de séparer les organites
          fonctionnels et les macromolécules d’une cellule.
Dans notre exposé, on va vous expliquer les méthodes qui permettent de
         séparer et analyser biochimiquement les protéines,
         alors comment réaliser la séparation des protéines ?
Historique:

ar S.E. Linder et H. Picton qui se sont inspirés des travaux d’Herman




, Tiselius introduit l’éléctrophorése pour séparer les protéines e


elm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'é


     •En   1959, Raymond introduit les gels de polyacrylamide
Définition:



             •L’électrophorèse en grec => transport
me l’une des méthodes d’analyse les plus avantageuses de la chim




èse verticale le déplacement de l’ion dans un champ électrique pour séparer
But:


    - séparer les protéines.

- déterminer les fractions protéiques.
Principe:




Figure n°1: schéma représente le Principe d’éléctrophorése verticale
Les montages:
:
en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme d
plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa su




t souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Du
structure des protéines




Figure°2: les différents structure des protéines
Matériels
1/ Appareillage:
Les produits chimiques et réactifs:

 Solvant usuels: acide acétique, méthanol,
 glycérol, isopropanol, 2-marcaptoéthanol, …etc.


   Sels et tampons : glycine,trishydroxyméthyl
   aminaminométhane (Tris).


Réactifs spécifiques : acrylamide, N, N'-méthylène
-bis acrylamide, N, N, N', N'-tétraméthyléthylène
-diamine (TEMED), dodécyl sulfate de sodium (SDS),
Blue de Coomassie R250…etc
Les gels d'electrphorese ;
Gel de polyacrélamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):




           Figure n°3 : structure de gel de polyacrélamide
Gel d’agarose:




ose formé par l’hydrogène non covalente et hydrophobe liens entre les polym
Préparation de l’échantillon



1-Extraction des protéines (sériques)
*on prend 1ml de l ’ extrait de protéine par une pipette ,on le met dans un eppendorf

    *on le placé dans un VORTEX ( 15
    min).
er dans une centrifugeuse ( 10 min) a 4°C.
ait transférer le surnageant dans un nouveau tube dans lequel on ajout 0.2ml de chlorofor


      *on agit c tube( 15 scd) –incuber à température ambiante( 3 min).
      *une 2 eme centrifugation (15 min).

     *on obtient un contenu en 3 phases (aqueuse-interphase et organique).
     *le surnageant sera jeté.
     *on ajout 0.3ml de l’éthanol.
     *agitation (15 scd)-incubation(3min).
     *3 eme centrifugation (05min).

        *Le surnageant sera réparti dans 2 tubes d’une façon équivalente.
        *ajouter 0.75ml de l’isopropanol dans chaque tube
tation (15scd)-incubation a t° ambiante (10min)-centrifugation (10min)-jeter le surnag

age par l’acétone froid (vortex 1min-centrifugation 10min –jeter l’acétone)

étition de lavage.

vrir les bouchons des tubes pour l’évaporation des résidus de l’acetone.
La préparation des gels :



st une matrice de séparation utilisée en électrophorèse de biomo

peuvent varier en composition.

ux types de gels : Un gel de séparation et un gel de concentration
1/Un gel de séparation :
arer 10 ml (par exp) d’une solution mère à 10 % de polyacrylamide (en sépar




                         Composant               Volume


     ddH20                           4,0 ml


     mélange d'acrylamide 30 %       3,3 ml


     1,5M Tris pH 8.8                2,5 ml


     10 % SDS                        0,1 ml


     10 % ammonium persulfate        0,1 ml


     TEMED                           0,004 ml
2/Un gel de concentration :
préparer 10 ml d'une solution mère à 5 % de polyacrylamide (sta


                                        Composant               Volume

          ddH20                                        4,0 ml

          mélange à 30 % d'acrylamide                  3,3 ml

          1,0M Tris pH 6.8                             2,5 ml

          10 % SDS                                     0,1 ml

          10 % ammonium persulfate                     0,1 ml

          TEMED                                        0,004 ml




 met le polyacrylamide dans la cuve.
 met le peigne dans le gel délicatement pour réaliser les puits.
rès polymérisation ; l’insertion de la plaque dans l’appareil de l’électrophorè
Elle nécessite une cuve
                        à électrophorèse et
                     une alimentation continue

 la moins coûteuse                            Le protocole de
                                     gel d’agarose =de polyacrélam
                        Gel
     la   plus aisée
                     d’agarose
 à une meilleure sensibilité               peu utilisée dans
 une meilleure résolution                le cas des protéines
des fractions protéiques.
                                                20/04/12
á PH discontinu
                          tampon du réservoir supérieur
                           contient un acide faible: Glycine
                          pH près du PH de réservoir inférieur
gel de concentration
                       PH du tampon du gel de concentration
                                      < 2
 gel de séparation           PH de gel de séparation

                         Tampon du réservoir du bas
                                     =
                         tampon du gel de séparation


                                             20/04/12
20/04/12
20/04/12
s séparation par électrophorèse en gel, les bandes obtenues peuven

isées par différentes techniques.Les protéines sont souvent révélées




                2 / C o m p t/ ig em u n o t r a n s f
                             3 a m
/ C o lo r a t io n
                   r a d i o a c «t  fw e s t e r n b l o t
                                   i
      B l et u ad e
       Ni r t
f lu o r e s c a m in e
   c o o mg e n ti e
    d’ ar as s



                                              20/04/12
immunotransfert « western blot »

   a- Saturation de la membrane (blocage) Fixation
des protéines de façon non spécifique sur la membrane




     b- Incubation avec Anticorps primaires
     c- Incubation avec Anticorps secondaires




                                        20/04/12
d- Détection



               Autoradiographie
               20/04/12
Applications 




En médecine :
 le Test d'électrophorèse des protéines est utilisés 
pour évaluer, et contrôler une grande variété de maladies
 et de conditions grâce à l'examen des quantités et des types  
de protéines dans un sang, d'urine, 
Identification des phénotypes moléculaires et 
des génotypes par électrophorèse de l'hémoglobine.
En génétique:
La variation génétique peut aussi être identifiée en examinant
 la variation au niveau des  et  la vérification des études
 d'expression des protéines in vivo et in vitro 

                                             20/04/12
En pharmacie : Permettant la découverte de nouveaux médicaments
 et la validation des cibles pour la conception de médicaments.
En biochimie : pour Fournit des informations sur la structure 
la taille moléculaire, le paramètre physico-chimique,  
la quantité et la pureté d'un échantillon de protéine.
En biotechnologie : L'industrie des biotechnologies a connu 
une croissance rapide ces dernières années en grande partie 
attribuable au développement et au succès de base de protéines
 thérapeutiques pour un large éventail de troubles.
 Similaires aux produits pharmaceutiques traditionnels, 
la caractérisation d'une protéine thérapeutique pour 
ses propriétés physico-chimiques, 
la surveillance du processus et l'émission de lots est essentielle. 


                                                     20/04/12
En immunologie, notamment pour confirmer
le diagnostic de certaines atteintes du système immunitaire.




                                           20/04/12
2- Exemple d’utilisation d’électrophorèse :
La séparation et l'identification de protéines 
par électrophorèse de liquides biologiques
 Des pathologies rares affectant la production 
des anticorps comme l'agammaglobulinémie,
absence de sécrétion des gammaglobulines 
et l'hypogamma globulinémie,
 sécrétion insuffisante des gammaglobulines, 
peuvent être détectées par électrophorèse 
des protéines sériques.
Dans le but d'identifier la nature de leur pathologie,
 on a soumis à l'électrophorèse le sérum de deux patients 
atteints de dysfonctionnements du système immunitaire.  
Outre le sérum des deux patients (pistes 2 et 3), 
on a également soumis à l'électrophorèse deux échantillons
 de sérum normal (pistes 1 et 5) ainsi qu'un échantillon 
d'immunoglobulines pour servir de référence (piste 4). 
Les résultats obtenus et le profil densitométrique 
des pistes sont présentés ci-dessous à droite.
                                            20/04/12
L'examen visuel des profils électrophorétiques complété
r l'analyse densitométrique permet d'identifier certaines anomalies : 
     L'individu 2 présente un sérum particulièrement concentré
n immunoglobulines mais les autres protéines sériques présentent
               une concentration inférieure à la normale.
ersement, le sérum de l'individu 3 est dépourvu de gamma globulines
             tandis que les autres bandes sont normales. 
    Dans le premier cas, il s'agit d'une hypergammaglobulinémie
  tandis que dans le second, il s'agit d'une agammaglobulinémie.

      Cinq pistes d'électrophorèse
                                          Profils densitométriques correspondants
                                                  20/04/12
Avantage : 
- la quantité de produit nécessaire est très petite
- des protéines ne différant que par un
 seul acide aminé peuvent être séparées
- des méthodes enzymatiques et immunologiques
 permettent la révélation des substances
- il est possible de quantifier les différentes fractions séparées 
- cette méthode est extrêmement simple, 
La simplicité et les performances de cette méthode lui valent 
d'être utilisée quotidiennement. 
                           Inconvénient :
-Les bandes de protéines sont larges (à cause du dépôt).
-On ne peut pas déterminer la masse moléculaire des protéines.
-Réfléchir sur la polarité de l'électrophorèse (en fonction du pH). 


                                                20/04/12
Conclusion :
La masse moléculaire et la composition des  sous-unités  d’une protéine,
 même présent en petites quantités, peuvent être déterminées par électrophorèse 
sur gel de polyacrylamide  SDS. Lors d’électrophorèse bidimensionnelle sur gel, 
les protéines sont séparées sous forme de taches par la focalisation isoélectrique 
dans une dimension suivie de l’électrophorèse sur gel  de polyacrylamide 
SDS dans la deuxième dimension. Cette séparation électro phorétique 
peut aussi être appliquée à des protéines  normalement insolubles dans l’eau.




                                                          20/04/12

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