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Travaux Pratiques

Tests de chimiosensibilité in vitro :
     un test de phénotypage

           Milijaona Randrianarivelojosia
                   milijaon@pasteur.mg

          Avec le concours de Dr Marie Ange Rason
            et de M. Herilalaina Andrianantenaina
…, il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance de
Plasmodium sp aux antipaludiques, notamment dans les
pays d’endémie.

                P. falciparum           P. vivax



                       peuvent être résistant
                           aux drogues

                  P. malariae           P. ovale
Evaluation de la sensibilité de
        P. falciparum aux antipaludiques

                                                    Test de
                                                chimiosensibilité


                 Echantillon
                               Tests in vitro
                  de sang

                                                  Génotypage
                                                 (marqueurs de
                                                   résistance)

 Test in vivo
(traitement et
     suivi)
Evaluation de l’efficacité des traitements




                   Test in vivo
                  (traitement et
                       suivi)
Evaluation de l’efficacité thérapeutique des
               antipaludiques


Protocoles d’étude
- WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17
- WHO/MAL96.1077                                  Augmentation
                                                 de taux d’échec:
                                                    Alerte !
Médicaments
- molécules préconisées par la politique nationale
- molécules autorisées sur le marché et utilisées dans un pays

Dosage de taux plasmatique des médicaments
et/ou des métabolites
Evaluation de la chimiosensibilité de
       P. falciparum in vitro


                                          Test de
                                      chimiosensibilité


       Echantillon
                     Tests in vitro
        de sang

                                        Génotypage
                                       (marqueurs de
                                         résistance)
Test de chimiosensibilité in vitro

                      Examen microscopique
                      OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001
    Phénotype
   résistant + :
                      Colorimétrique (Elisa)
    Alarme !
                      Moreno et al, 2001 : LDH
                      Noedl et al, 2002 : HRPII


                      Méthode isotopique
                      Desjardins et al, 1979; Le Bras & Deloron, 1983

Mise en culture des
 parasites viables
                      Cytométrie en flux
                      Pattanapanyasat et al, 1997
Quand aura « facilement » les anticorps, …




                                                                       Min




                                             Concentration de drogue
                                                                       Max


des tests seront faisables dans des structures hospitalières (périphériques)
Différentes étapes du test de chimiosensibilité
                  in vitro (1)


                            Réception des
                            prélèvements




                        Plaques de culture à fond
                         plat prémédicamentées
Différentes étapes du test de chimiosensibilité in
                    vitro (2)

                            Milieu de culture
                     RPMI ; Sérum humain AB+ (ou
                     albumax); Hypoxanthine-3H


                         Suspension parasitaire
                      Lavage du culot de globules
                      rouges parasités (GRP) ;
                      préparation et distribution de la
                      suspension de GRP sous la
                      hotte
Différentes étapes du test de
chimiosensibilité in vitro (3)




                  Mise en culture
            Incubation pendant 42h à
            37°C; atmosphère humide; en
            microaérophilie
            Congélation et décongélation
            des plaques de culture
Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiée
                 dans l’ADN du parasite


Hypoxanthine-3H




      +




  ADN plasmodial
   (au début du            ADN plasmodial
       test)                 marqué au
                              tritium
Différentes étapes du test de chimiosensibilité
                 in vitro (4)


                               Collecte du contenu
                               des puits sur un
                               filtre en fibre de
                               verre
Différentes étapes du test de chimiosensibilité in
                    vitro (5)
                   Comptage de la radioactivité
                   (cpm) à l’aide du Microbeta




                   Calcul des CI50 (concentration
                   inhibitrice 50%) et des CI90
                   des antipaludiques
Comptage de radioactivité après un test
                  d’antipaludogramme : illustration
                      Chloroquine         Amodiaquine           Mefloquine            Quinine
   Faible
concentration
                A   3019   3126   3174   3221   3053   3288   2593   2464   3185   2963   3017   3174
                B   2582   2951   2315    875   1006    870   2472   2446   2484   2570   2772   2608
                C   1737   1767   1685    102    100    110   1678   1552   1557   1526   1716   1732
                D    482    415    595    120    106    101    702    651    541    695    762    795
                E    164    138    192    82     77     85     112    122    119    218    327    276
                F    96     133    94     90     73     75     66     72     87     110    155    131
                G    90     108   3040    78     104   3340    105    76    3552    111    122   2943
    Forte
concentration
                H    103    100   3276    101    114   3045    77     104   3187    113    135   3017


                           Cellules colorées en jaune = témoin (i.e. puits sans
                                             antipaludiques)
Pfcrt, marqueur de résistance P. falciparum
             à la chloroquine


                      MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org)




                                (Fidock et al, 2000)
Pfdhfr, marqueur de résistance de P. falciparum
             à la pyriméthamine



                              59
                                   51
                 Drug/substrate


                     108
                 NADP

                        164




                                    pfDHFR
Détections des mutations des
             marqueurs de résistance


 Génotype
                        PCR/séquençage
 mutant + :
 Alarme !
                        PCR nichée mutation spécifique

                        Utilisation des sondes

Amplification
  par PCR               PCR/RFLP


                (Ranford-Cartwright et al, 2002)
Stratégie de surveillance (1)



Analyse des rapports émanant des structures de santé de
base, de district, provinciales …

Suivi de cohortes (sites sentinelles)

Mise en place de réseau (national, régional, …)

…
Stratégie de surveillance (2)




    (Randrianarivelojosia et al, 2002)
Pratique de radioprotection
    et utilisation de produits tritiés


                 Exemple du GRP de l’IPM


                                   par


                          Marie Ange Rason
                           mieange@pasteur.mg


Avec le concours de Dr Milijaona Randrianarivelojosia et de Madagascar-INSTN
Pourquoi la technique isotopique ?

Paludisme : problème de santé publique ; avec risque
de résistance des parasites, notamment de P.
falciparum, aux drogues


Intérêt en santé publique : surveiller la sensibilité
ou résistance de l’agent causal du paludisme aux
drogues
Surveillance de la chimiosensibilité des
parasite du paludisme à Madagascar

Collaboration entre Ministère de la Santé et du Planning
Familial et l’Institut Pasteur de Madagascar

Avec une standardisation de la technique

But : doter Madagascar (et la sous région de l’Océan
Indien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité des
antipaludiques
Surveillance de la sensibilité du parasite


Tests in vitro
Détection des mutations au niveau des marqueurs
génétiques de la résistance qui implique une
amplification par PCR des gènes d’intérêt (technique
isotopique ou non-isotopique)

Antipaludogramme utilisant le technique de marquage
isotopique avec l’hypoxanthine tritiée pour l’étude de la
sensibilité de Plasmodium falciparum aux antipaludiques
Source de rayonnement utilisée

Hypoxanthine tritiée

Source non scellée, aqueuse, rayonnements β-

Faible activité

Période longue (12,4 ans)

Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dans
l’ADN pendant la phase de division des cellules.
Mise en culture des parasites

Mise en culture pendant 48 heures de sang parasité
(parasites viables dans un échantillon de sang veineux)
dans du milieu de culture + hypoxanthine tritiée, et en
présence de différentes concentrations d’antipaludiques,

Paramètre utilisée pour classer selon la sensibilité : CI
50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibe
à 50% la croissance du parasite.
IPM : Pratique de la radioprotection

Deux personnes compétentes en radioprotection

Gestion des produits et des déchets ; protections
individuelles et collectives

Procédures disponibles ; répartition de taches (et
seules les personnes autorisées peuvent
manipuler l’hypoxanthine tritiée)
Moyens de protection

Individuelle : Port des gants et blouse est obligatoire,
masque lors de la dilution des déchets liquides

Collective : Hotte à flux laminaire pour la culture, hotte
de chimie pour la collecte, salle spéciale pour la
radioactivité, matériels à usage unique, pipette
automatique, microplaques, papier aluminium et
absorbant, balisage des portes d’entrées, poubelles
spéciales, plateaux récupérateurs.
Gestions des déchets radioactifs à l’IPM


Liquides : Stockage dans des bidons plastiques dans la
salle radioactive en attente des contrôles par Madagascar-
INSTN avant le rejet

Solides : Compacter et stocker dans des fûts métalliques
qui sont supportés par des bois carrés, dans une fosse
bétonnée dans l’enceinte de l’IPM.
Autorisation, contrôle, inspection, rigueur
Limitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale)
utilisée = 6,4.108 < 1,2.1010 Bq (LAI)

Contrôle régulier de surface (détection de contamination
des plans de travail)

Autorisation d’utilisation délivrée par Madagascar-INSTN
(et nous avons eu un projet IAEA)

Inspection fréquente/collaboration des officiers de
radioprotection de l’INSTN-Madagascar

Suivi médical (annuel) du personnel

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Anti-paludogramme - Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage

  • 1. Travaux Pratiques Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage Milijaona Randrianarivelojosia milijaon@pasteur.mg Avec le concours de Dr Marie Ange Rason et de M. Herilalaina Andrianantenaina
  • 2. …, il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance de Plasmodium sp aux antipaludiques, notamment dans les pays d’endémie. P. falciparum P. vivax peuvent être résistant aux drogues P. malariae P. ovale
  • 3. Evaluation de la sensibilité de P. falciparum aux antipaludiques Test de chimiosensibilité Echantillon Tests in vitro de sang Génotypage (marqueurs de résistance) Test in vivo (traitement et suivi)
  • 4. Evaluation de l’efficacité des traitements Test in vivo (traitement et suivi)
  • 5. Evaluation de l’efficacité thérapeutique des antipaludiques Protocoles d’étude - WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17 - WHO/MAL96.1077 Augmentation de taux d’échec: Alerte ! Médicaments - molécules préconisées par la politique nationale - molécules autorisées sur le marché et utilisées dans un pays Dosage de taux plasmatique des médicaments et/ou des métabolites
  • 6. Evaluation de la chimiosensibilité de P. falciparum in vitro Test de chimiosensibilité Echantillon Tests in vitro de sang Génotypage (marqueurs de résistance)
  • 7. Test de chimiosensibilité in vitro Examen microscopique OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001 Phénotype résistant + : Colorimétrique (Elisa) Alarme ! Moreno et al, 2001 : LDH Noedl et al, 2002 : HRPII Méthode isotopique Desjardins et al, 1979; Le Bras & Deloron, 1983 Mise en culture des parasites viables Cytométrie en flux Pattanapanyasat et al, 1997
  • 8. Quand aura « facilement » les anticorps, … Min Concentration de drogue Max des tests seront faisables dans des structures hospitalières (périphériques)
  • 9. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (1) Réception des prélèvements Plaques de culture à fond plat prémédicamentées
  • 10. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (2) Milieu de culture RPMI ; Sérum humain AB+ (ou albumax); Hypoxanthine-3H Suspension parasitaire Lavage du culot de globules rouges parasités (GRP) ; préparation et distribution de la suspension de GRP sous la hotte
  • 11. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (3) Mise en culture Incubation pendant 42h à 37°C; atmosphère humide; en microaérophilie Congélation et décongélation des plaques de culture
  • 12. Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiée dans l’ADN du parasite Hypoxanthine-3H + ADN plasmodial (au début du ADN plasmodial test) marqué au tritium
  • 13. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (4) Collecte du contenu des puits sur un filtre en fibre de verre
  • 14. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in vitro (5) Comptage de la radioactivité (cpm) à l’aide du Microbeta Calcul des CI50 (concentration inhibitrice 50%) et des CI90 des antipaludiques
  • 15. Comptage de radioactivité après un test d’antipaludogramme : illustration Chloroquine Amodiaquine Mefloquine Quinine Faible concentration A 3019 3126 3174 3221 3053 3288 2593 2464 3185 2963 3017 3174 B 2582 2951 2315 875 1006 870 2472 2446 2484 2570 2772 2608 C 1737 1767 1685 102 100 110 1678 1552 1557 1526 1716 1732 D 482 415 595 120 106 101 702 651 541 695 762 795 E 164 138 192 82 77 85 112 122 119 218 327 276 F 96 133 94 90 73 75 66 72 87 110 155 131 G 90 108 3040 78 104 3340 105 76 3552 111 122 2943 Forte concentration H 103 100 3276 101 114 3045 77 104 3187 113 135 3017 Cellules colorées en jaune = témoin (i.e. puits sans antipaludiques)
  • 16. Pfcrt, marqueur de résistance P. falciparum à la chloroquine MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org) (Fidock et al, 2000)
  • 17. Pfdhfr, marqueur de résistance de P. falciparum à la pyriméthamine 59 51 Drug/substrate 108 NADP 164 pfDHFR
  • 18. Détections des mutations des marqueurs de résistance Génotype PCR/séquençage mutant + : Alarme ! PCR nichée mutation spécifique Utilisation des sondes Amplification par PCR PCR/RFLP (Ranford-Cartwright et al, 2002)
  • 19. Stratégie de surveillance (1) Analyse des rapports émanant des structures de santé de base, de district, provinciales … Suivi de cohortes (sites sentinelles) Mise en place de réseau (national, régional, …) …
  • 20. Stratégie de surveillance (2) (Randrianarivelojosia et al, 2002)
  • 21. Pratique de radioprotection et utilisation de produits tritiés Exemple du GRP de l’IPM par Marie Ange Rason mieange@pasteur.mg Avec le concours de Dr Milijaona Randrianarivelojosia et de Madagascar-INSTN
  • 22. Pourquoi la technique isotopique ? Paludisme : problème de santé publique ; avec risque de résistance des parasites, notamment de P. falciparum, aux drogues Intérêt en santé publique : surveiller la sensibilité ou résistance de l’agent causal du paludisme aux drogues
  • 23. Surveillance de la chimiosensibilité des parasite du paludisme à Madagascar Collaboration entre Ministère de la Santé et du Planning Familial et l’Institut Pasteur de Madagascar Avec une standardisation de la technique But : doter Madagascar (et la sous région de l’Océan Indien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité des antipaludiques
  • 24. Surveillance de la sensibilité du parasite Tests in vitro Détection des mutations au niveau des marqueurs génétiques de la résistance qui implique une amplification par PCR des gènes d’intérêt (technique isotopique ou non-isotopique) Antipaludogramme utilisant le technique de marquage isotopique avec l’hypoxanthine tritiée pour l’étude de la sensibilité de Plasmodium falciparum aux antipaludiques
  • 25. Source de rayonnement utilisée Hypoxanthine tritiée Source non scellée, aqueuse, rayonnements β- Faible activité Période longue (12,4 ans) Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dans l’ADN pendant la phase de division des cellules.
  • 26. Mise en culture des parasites Mise en culture pendant 48 heures de sang parasité (parasites viables dans un échantillon de sang veineux) dans du milieu de culture + hypoxanthine tritiée, et en présence de différentes concentrations d’antipaludiques, Paramètre utilisée pour classer selon la sensibilité : CI 50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibe à 50% la croissance du parasite.
  • 27. IPM : Pratique de la radioprotection Deux personnes compétentes en radioprotection Gestion des produits et des déchets ; protections individuelles et collectives Procédures disponibles ; répartition de taches (et seules les personnes autorisées peuvent manipuler l’hypoxanthine tritiée)
  • 28. Moyens de protection Individuelle : Port des gants et blouse est obligatoire, masque lors de la dilution des déchets liquides Collective : Hotte à flux laminaire pour la culture, hotte de chimie pour la collecte, salle spéciale pour la radioactivité, matériels à usage unique, pipette automatique, microplaques, papier aluminium et absorbant, balisage des portes d’entrées, poubelles spéciales, plateaux récupérateurs.
  • 29. Gestions des déchets radioactifs à l’IPM Liquides : Stockage dans des bidons plastiques dans la salle radioactive en attente des contrôles par Madagascar- INSTN avant le rejet Solides : Compacter et stocker dans des fûts métalliques qui sont supportés par des bois carrés, dans une fosse bétonnée dans l’enceinte de l’IPM.
  • 30. Autorisation, contrôle, inspection, rigueur Limitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale) utilisée = 6,4.108 < 1,2.1010 Bq (LAI) Contrôle régulier de surface (détection de contamination des plans de travail) Autorisation d’utilisation délivrée par Madagascar-INSTN (et nous avons eu un projet IAEA) Inspection fréquente/collaboration des officiers de radioprotection de l’INSTN-Madagascar Suivi médical (annuel) du personnel