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Virus de l'hépatite A et E
                  Virus et marqueurs diagnostiques




                                  Vincent THIBAULT
                                Laboratoire de Virologie

         Groupe Hospitalier
          Pitié-Salpêtrière
Assistance Publique Hôpitaux de Paris
   V.Thibault DU_janv.-11 1
Hépatites virales
                           mode de transmission préférentiel


      parentéral                                        féco-oral


    B                              non A, non B                     A
 1965            D                                                  1972

   Vaccin
               1977
                            C                             E         Vaccin

                           1990                          1991
                                                         (Vaccin)
                                   F, G, TTV, autres…
V.Thibault DU_janv.-11 2
V.Thibault DU_janv.-11 3
Historique VHA
     Avant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos)
     1745 : Cockayne, hépatites épidémiques
     1908 : McDonald, "notion de virus…"
     Reproduction de la maladie 1942 :
            Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum
     Entité clinique :
                                                                       1995 : Vaccin
           17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA    "infectious"-VHB recommandations
                                                                            1996 : "serum")

           Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…)
     Visualisation : 1973 (Feinstone)
                                                                          1999 : recommandations
     Développement de la sérologie : épidémiologie
     1979 : culture (Provost et Hilleman)
     1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques
     1991… : Vaccination
     2006 : Déclaration obligatoire
V.Thibault DU_janv.-11 4
Virus de l'hépatite A




V.Thibault DU_janv.-11 5
Virus de l’Hépatite A


                                               •   Famille : Picornaviridae
                                     Capside        (entérovirus type 72)
                                               •   Genre : hépatovirus
                                               •   Taille 27-32 nm
27-32nm
                                     ARN (+)   •   Non enveloppé
                                               •   Structure icosaèdrique
                                               •   ARN simple brin,
                                     Vpg
                                                    •   polarité positive
                                                    •   lié de façon covalente à
                                                        une protéine Vpg




 V.Thibault DU_janv.-11 6
P1 prot. Capside                   P2                           P3

         0                      Structurales                               Non structurales
                                                                                                              7478


                       1B        1C       1D         2A   2B          2C       3 3C (PRO)        3D (POL)       AAA
                                                                              A-B
  Vpg          1A
2.5kDa     IRES
                                                                                 3
         Traduction                                  2A                         A-B
         (eIF-4G)                                                                                               poly-
                       VP2       VP3       VP1            2B           2C          3C (PRO)       3D (POL)
                                                                                                              protéine
             VP4                                                                                              2 227 AA


                                                           ?                      Vpg
                                                                                    Protéase
                                                                    Liaison NTP
                                                                      Hélicase                      ARN
                    VP0                                                                          Polymérase

                      VP2        VP3           VP1                             Réplication
             VP4                                          2A


                      VP2        VP3           VP1                          X5 – X12
             VP4          Protéines de surface            2A          Maturation finale
                             immunogénicité
 V.Thibault DU_janv.-11 7
Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules
            Attachement

                             Libération                          Réplication
                             du génome

 Espace                                                                                              +
 de Disse                                                                                            -
                      ir e


                                                Traduction
               cellula



                                                Synthèse                                         +
                                            de la polyprotéine
                                                                                                     -
             rane




                                        P3
           Memb




                                              Maturation
                                       P2                                              Réticulum
                                                                                     endoplasmique
                                  P1
                                                                       Empaquetage




                                                                             Canalicule
                                                                   Relargage  biliaire


V.Thibault DU_janv.-11 8
Hepatitis A Virus Suppresses RIG-I Mediated IRF-3 Activation To
                Block Induction of Beta Interferon




                                                      *

                *




Seth et al. Cell Research (2006)16: 141-147
Fensterl et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2005, p. 10968–10977
Yang et al. (2007) PNAS 104 :7253-7258
V.Thibault DU_janv.-11 9
VHA : physiopathologie

                                       Absence d'effet cytopathique direct :
                                       cytolyse résultant du processus immun de
                                       défense de l'hôte,
                                             médiation cellulaire
                                             médiation humorale




V.Thibault DU_janv.-11 10
Propriétés Physiques du VHA
                       Agents                     Stabilité
                       Chaleur
        Autoclavage (121°C, 20')   Inactivation
        100°C                      Inactivation
        60°C                       Stable 1 heure
        température ambiante       Stable 1 mois (selles, eaux, sols)
                                   Plusieurs jours sur surface sèche
                                   4 h. Sur les mains
        4°C                        Stable plusieurs mois
        Congelé                    Stable des mois ou années
                    Acide-base     pH 1 : stable 5 h.
                                   PH 3-11 : stable au moins 30'
                            U.V.   Inactivation
                     Chimiques
        Chlore, ozone,             Inactivation
        glutaraldéhyde, iode
        Alcool 70°                 3' : inactivation partielle

V.Thibault DU_janv.-11 11
VHA et agents physiques ou chimiques




                            http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a




V.Thibault DU_janv.-11 12
Variabilité génétique
                           P1 prot. Capside             P2                         P3

         0                     Structurales                       Non structurales
                                                                                                   7478


                      1B        1C       1D   2A   2B        2C       3 3C (PRO)        3D (POL)     AAA
                                                                     A-B
  Vpg          1A
2.5kDa
                         Comparaison nucléotidique
                             ⌦7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII
                                 ⌦Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)
                                 ⌦Singes : IV, V, VI
                         Sérotype unique
                             ⌦Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3
                             ⌦Tests immunologiques
                             ⌦Vaccination (HM175, CR326)
                                 ⌦virus inactivé cultivé sur MRC-5

 V.Thibault DU_janv.-11 13
Génotypes et
         phylogénie
    VP1/P2A
    Génotypes : >15% variations
    Sous types : 7.5% variations




     D'après Nainan et al. 2006
     Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79




    IV Nonhuman primate, Philippines
    V Nonhuman primate, Kenya
    VI Nonhuman primate, Indonesia




Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates
in the VP1/P2B region (315-bp fragment).
     V.Thibault DU_janv.-11 14
Répartition mondiale des génotypes




Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge.
Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.


                                  Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.
 V.Thibault DU_janv.-11 15
Application à l'étude
     de diffusion de                       I
    certaines souches



     Diffusion du génotype IIA en
     France à partir d'une origine
               Africaine

                                           II




Diversité génétique d’un génotype rare
du virus de l’hépatite A                   III
Pathologie Biologie, In Press, Available
online 6 September 2010
D. Desbois et al.
  V.Thibault DU_janv.-11 16
VHA : Paramètres Biologiques
Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination
IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)

                                                          protection contre réinfection
                                 Ag foie                                   IgG
                                Symptomes
                                     Ictère


                            VHA Selles
                                                                IgM
                                VHA Sang




 0         1       2        3    4       5    6   7   8   9    10      24
                                                              Semaines
V.Thibault DU_janv.-11 17
IgM HAV uniquement à bon escient !



                                      1%
                                     11 %
                                     82 %

                                 Faux positifs
                                            Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887


     Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales +        Ig M HAV
      ⌦32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)

     Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant
     l'injection…

     NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË

V.Thibault DU_janv.-11 18
Marqueurs biochimiques

                     Diagnostic                   ⌦ Transaminases (ALAT, ASAT)
                                                  ⌦ Bilirubine
                                                  ⌦ Phosphatase alcaline
                                                  ⌦ Facteurs de coagulation


    Sérologie +++

          IgM anti VHA : infection récente

          IgG anti VHA : infection passée ou vaccination

          IgM et IgG anti VHA
    Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]
          Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)
          Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante
          (109v./mL), épidémiologie
                                                             Salive :
                                                                 IgG (ELISA)

V.Thibault DU_janv.-11 19                                        Génome viral (RT-PCR)
Quantification de la virémie ?




                                   Limite de
                                   quantification



                                                                11 Hépatites A

                                                                  Normann et al.,
                                                    Journal of Medical Virology 72:10–16 (2004)

 Hépatite fulminante            Evolution bénigne
                                                     Fujiwara K et al.
50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT)                    J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7.
           Hépatite fulminante :                     Hepatitis A viral load in relation to
                -virémie (p=0.03) *                  severity of the infection.
                -bilirubine -(p=0.04) *                     11 patients with fulminant hepatitis
                -age (p=0.09)                               10 with severe acute hepatitis
                -génotype non IA (p=0.09)                   70 with self-limited acute hepatitis
Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003)
    V.Thibault DU_janv.-11 20
Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques




          6-7         5-6       2-5 Log particules/mL

Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 jours                       Suivi de 27 patients
        dont 2 avec rechute (1-2 mois)

                                                          High and Persistent Excretion of Hepatitis A
    Duration of viremia in hepatitis A virus
                                                              Virus in Immunocompetent Patients
                   infection
                                                                           Tjon et al.
  Bower et al. Journal of Infectious Diseases
                                                        Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006)
                    2000;182:12–7
    V.Thibault DU_janv.-11 21
Hépatite A : le vaccin
                                   virus inactivé
     AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie
      ⌦ Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-
           5 , inactivé
     HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue
     HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue
      ⌦ Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines
           diploïdes MRC5

    Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à
    12 mois plus tard.
    La      persistance     des   anticorps   anti-VHA   après    vaccination     n'est
    actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance
    des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans
    après primo-immunisation.
            Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis
                                                    Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17
V.Thibault DU_janv.-11 22
Difficultés diagnostiques
                                     En routine
                            Adresser prélèvements
                                       au
                      Centre national de référence du VHA

                                       Pr E Dussaix
                                Laboratoire de virologie
                                  Hôpital Paul Brousse
                             12-14 av Paul Vaillant Couturier
                                  94804 Villejuif cedex
                                   Tel : 01 45 59 37 21

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste
 V.Thibault DU_janv.-11 23
SRAS ?




                            Hépatite E ?            Grippe




V.Thibault DU_janv.-11 24
Historique VHE
           Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites
             ⌦1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le
              VHA, épidémie particulière. "NANBH"
           Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :
                 Inde : prévalence de l’hépatite A importante
                 Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau
           1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire
           immunisé contre VHA (Balayan)
                 Hépatite à J36
                 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)
                 Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)
                 Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)
           1990 : Reyes et al. clonage et séquençage  "VHE"
           1991 : Tam et al. VHE
           2000 : Panda et al. cDNA infectieux
V.Thibault DU_janv.-11 25
Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple)




    Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010

V.Thibault DU_janv.-11 26
VHE                     Virus non enveloppé
                                              Sphérique (SRV)
     Famille : Hepeviridae                   Surface irrégulière
     Genre : Hepevirus                        Capside 27-34 nm
                                            Symétrie icosaédrique



                                               ARN simple brin
                                                 hélice droite
                                                   polarité +
                                                     7,5kb
                                              poly-A extrémité 3’



                                          Stabilité
                             Au laboratoire : instable(-70 à +8°C)
                                  Décongélation/congélation
                                   Tractus GI : stable (pH)
V.Thibault DU_janv.-11 27
Organisation génomique
                         Non structurales                Structurales

                                              7 200 nt               ARN polarité +
                                                                                       3’NC
5’ NC   28                                          5109                      7124
                                                                                      Poly-A

                                                            ORF3
        MeT      Y       Pro    P   X   Hel       RdRp               ORF2

 Génotypes 1-3
                                                              Protéines
                                                                             DIAGNOSTIC
                                                            immunogènes

Hétérogénéité génétique
  Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés
  en 24 sous groupes dont homologues animaux
  Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2
  Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype
        ⌦       Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre
                les différents types ?)
        ⌦       Vaccin : ORF 2 recombinante
 V.Thibault DU_janv.-11 28
Similarités des souches humaines et animales
Bilic et al. Journal of General Virology
          (2009), 90, 863–873


 Sporadique




  Epidémique


                                 humaines               aviaires
                                            Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV
                                            and nine mammalian HEV isolates, based on
                                            the complete genome region
  V.Thibault DU_janv.-11 32
Evolution VHE
Anthropotropic




        enzootic




 536 to 1344 years ago

                             Purdy MA, Khudyakov YE. Evolutionary history and population
 V.Thibault DU_janv.-11 33   dynamics of hepatitis e virus. PLoS One. 2010 Dec 17;5(12):e14376.
V.Thibault DU_janv.-11 35
Culture et Modèles animaux
• Culture
          Difficile
         Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)
         Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)
         Cellule embryonnaire

• Modèles animaux
          Primates : reproduction de la pathologie humaine
         Volontaires...
         VHE du porc, du poulet
         Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...
        Lapin… Ma H et al.    Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1
     and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160

 V.Thibault DU_janv.-11 36
Résistance thermique du VHE…



                                 VHE dans des suspensions fécales :
                                      Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min;
                                      56 °C 30 min maintien de l'infectiosité
                                                  Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007




                                                    Colson et al. JID 2010:202
V.Thibault DU_janv.-11 37
VHE et contamination des eaux

   Presence of hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) in
                           urban wastewater




   Prédominance du génotype 3




J. Rodriguez-Manzano et al. Excretion patterns of HAV and HEV infections
in Eastern Spain Journal of Water and Health 08.2 2010

V.Thibault DU_janv.-11 38
VHE : Paramètres Biologiques
Khuroo MS, Khuroo MS.
Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitis
E in a population that had recorded first epidemic
                                                             Titre peu élevé
30 years before and has been under surveillance      protection contre réinfection ?
since then.
Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9                                        IgG
                                 Symptomes

                                     Ictère


                             VHE Selles
                                                               IgM
                                VHE Sang




  0        10 20 30 40 50 60 70 80 90 100                                 200
                                      Jours
 V.Thibault DU_janv.-11 39
Virémie et excrétion fécale




                       Virémie                                            Selles
Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë
Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082
                                             Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal shedding
                                             and its relationship with transaminases and antibody
                                             response in patients with sporadic acute hepatitis E.
   V.Thibault DU_janv.-11 40                 Virol J. 2010 Sep 6;7:213
HEV – virémie-                                       selle


   transmission
                                      serum
                                              salive




Concentré de plaquettes à J0
Transfusé à un homme de
64 ans traité pour Lymphome
non-Hodgkinien      par   GM                                   IgG
autologue


                                                               IgM




Matsubayashi K, et al. Transfusion.
2008 Jul;48(7):1368-75.

  V.Thibault DU_janv.-11 41
Immunodépression, hépatite chronique et
                  stratégie diagnostique




       Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,
                              La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !
                               (ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)

Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748
  V.Thibault DU_janv.-11 42
Stratégie Diagnostique
    Marqueurs non biologiques
          circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)
                A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)

          clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez
          l'immunocompétent ! ) – Portage prolongé en cas d'immunodépression

    Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion
          Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)
          Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)

    Marqueurs sérologiques spécifiques
          IgM anti-HEV
          IgG anti-HEV (+++)
          RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)
                ATTENTION : spécificité - performances
V.Thibault DU_janv.-11 43
Incidence des cas d'hépatite E en France :
                 un gradient Nord-Sud
Renou et al. 2008 Aliment Pharmacol Ther 27, 1086–1093




                                                         Nicand et al. Pathol Biol. 2009 Mar;57(2):203-11




   V.Thibault DU_janv.-11 44
Performance des tests
                                        Panels
                                        50 sérums ARN HEV (+), G3
                                        406 sérums IgG ARN HEV (-)
                                                              IgM anti-HEV

                                         Microplaque          Microplaque          Test rapide
                                           Adaltis           MP Diagnostics       MP Diagnostics
                     anti-HEV IgG

                                       positif     négatif   positif    négatif   positif   négatif

                      Positif (n=41)     40          1         39             2     37           4
                     Negatif (n=9)       5           4         5              4     4            5
                      Total (n=50)       45          5         44             6     41           9
                     Sensibilité              90                       88                   82
                     Spécificité              100                      99.5                 100
                     VPP                      100                      95.7                 100
                     VPN                      98.8                     98.5                 97.8


        Legrand-Abravanel CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, May 2009, p. 772–774

V.Thibault DU_janv.-11 46
Stratégie Diagnostique
                         Se donner les moyens de faire le diagnostic

      Diagnostic Indirect              Diagnostic Direct
Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur
          IgM anti VHE             prélèvements sang et selles
          IgG anti VHE


 Diagnostic       IgG         IgM RT-PCR

  Certain          ++         ++     +

 Probable       - ou +         -     +

 Douteux          +++          -     -

 Immunité
                    +          -     -
 ancienne

                                              Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers
                                              in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560
  V.Thibault DU_janv.-11 47
VHE et traitement



         Efficacité du PEG-IFN
         Efficacité de la ribavirine chez les patients
           ⌦Pas de mécanisme virologique précis décrit


                            Haagsma EB et al Liver Transpl. 2010 Apr;16(4):474-7
                            Mallet V et al. Ann Intern Med. 2010 Jul 20;153(2):85-9.
                            Kamar N et al. Nephrol Dial Transplant. 2010 Aug;25(8):2792-5.
                            Kamar N et al. Gastroenterology. 2010 Nov;139(5):1612-8.




V.Thibault DU_janv.-11 48
VHE et vaccination
 20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée
 dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur
 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium.
 3 injections

                   Moyenne géométrique du taux
                           d'anticorps anti-VHE




Efficacité : 95,5% après 3 doses




              Risque cumulé d'un premier épisode
                                     d'hépatite E

Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9
  V.Thibault DU_janv.-11 49
HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech,
                                          Xiamen, China),
           VHE et vaccination             produced in bacterial cells : safe and
                                          efficacious against infection with hepatitis E
                                          virus in seronegative participants in a phase 2
                                          trial




Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902
  V.Thibault DU_janv.-11 50
Difficultés diagnostiques
                                    En routine
                         Adresser les prélèvements
                                      au
                  Centre national de référence du VHA/VHE

                                      Pr E Dussaix
                               Laboratoire de virologie
                                 Hôpital Paul Brousse
                            12-14 av Paul Vaillant Couturier
                                 94804 Villejuif cedex
                                  Tel : 01 45 59 37 21

           http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste
V.Thibault DU_janv.-11 51

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Virus de l'hépatite a et e virus et marqueurs diagnostiques

  • 1. Virus de l'hépatite A et E Virus et marqueurs diagnostiques Vincent THIBAULT Laboratoire de Virologie Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière Assistance Publique Hôpitaux de Paris V.Thibault DU_janv.-11 1
  • 2. Hépatites virales mode de transmission préférentiel parentéral féco-oral B non A, non B A 1965 D 1972 Vaccin 1977 C E Vaccin 1990 1991 (Vaccin) F, G, TTV, autres… V.Thibault DU_janv.-11 2
  • 4. Historique VHA Avant J.C.: “La Jaunisse” (Ikterus / kirrhos) 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques 1908 : McDonald, "notion de virus…" Reproduction de la maladie 1942 : Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum Entité clinique : 1995 : Vaccin 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB recommandations 1996 : "serum") Transmission nosocomiale (préparation vaccinale : variole, fièvre jaune…) Visualisation : 1973 (Feinstone) 1999 : recommandations Développement de la sérologie : épidémiologie 1979 : culture (Provost et Hilleman) 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques 1991… : Vaccination 2006 : Déclaration obligatoire V.Thibault DU_janv.-11 4
  • 5. Virus de l'hépatite A V.Thibault DU_janv.-11 5
  • 6. Virus de l’Hépatite A • Famille : Picornaviridae Capside (entérovirus type 72) • Genre : hépatovirus • Taille 27-32 nm 27-32nm ARN (+) • Non enveloppé • Structure icosaèdrique • ARN simple brin, Vpg • polarité positive • lié de façon covalente à une protéine Vpg V.Thibault DU_janv.-11 6
  • 7. P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa IRES 3 Traduction 2A A-B (eIF-4G) poly- VP2 VP3 VP1 2B 2C 3C (PRO) 3D (POL) protéine VP4 2 227 AA ? Vpg Protéase Liaison NTP Hélicase ARN VP0 Polymérase VP2 VP3 VP1 Réplication VP4 2A VP2 VP3 VP1 X5 – X12 VP4 Protéines de surface 2A Maturation finale immunogénicité V.Thibault DU_janv.-11 7
  • 8. Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules Attachement Libération Réplication du génome Espace + de Disse - ir e Traduction cellula Synthèse + de la polyprotéine - rane P3 Memb Maturation P2 Réticulum endoplasmique P1 Empaquetage Canalicule Relargage biliaire V.Thibault DU_janv.-11 8
  • 9. Hepatitis A Virus Suppresses RIG-I Mediated IRF-3 Activation To Block Induction of Beta Interferon * * Seth et al. Cell Research (2006)16: 141-147 Fensterl et al. JOURNAL OF VIROLOGY, Sept. 2005, p. 10968–10977 Yang et al. (2007) PNAS 104 :7253-7258 V.Thibault DU_janv.-11 9
  • 10. VHA : physiopathologie Absence d'effet cytopathique direct : cytolyse résultant du processus immun de défense de l'hôte, médiation cellulaire médiation humorale V.Thibault DU_janv.-11 10
  • 11. Propriétés Physiques du VHA Agents Stabilité Chaleur Autoclavage (121°C, 20') Inactivation 100°C Inactivation 60°C Stable 1 heure température ambiante Stable 1 mois (selles, eaux, sols) Plusieurs jours sur surface sèche 4 h. Sur les mains 4°C Stable plusieurs mois Congelé Stable des mois ou années Acide-base pH 1 : stable 5 h. PH 3-11 : stable au moins 30' U.V. Inactivation Chimiques Chlore, ozone, Inactivation glutaraldéhyde, iode Alcool 70° 3' : inactivation partielle V.Thibault DU_janv.-11 11
  • 12. VHA et agents physiques ou chimiques http://www.invs.sante.fr/publications/2009/guide_hepatite_a V.Thibault DU_janv.-11 12
  • 13. Variabilité génétique P1 prot. Capside P2 P3 0 Structurales Non structurales 7478 1B 1C 1D 2A 2B 2C 3 3C (PRO) 3D (POL) AAA A-B Vpg 1A 2.5kDa Comparaison nucléotidique ⌦7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII ⌦Homme : génotype I (90%), (III, II=VII) ⌦Singes : IV, V, VI Sérotype unique ⌦Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3 ⌦Tests immunologiques ⌦Vaccination (HM175, CR326) ⌦virus inactivé cultivé sur MRC-5 V.Thibault DU_janv.-11 13
  • 14. Génotypes et phylogénie VP1/P2A Génotypes : >15% variations Sous types : 7.5% variations D'après Nainan et al. 2006 Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79 IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, Kenya VI Nonhuman primate, Indonesia Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates in the VP1/P2B region (315-bp fragment). V.Thibault DU_janv.-11 14
  • 15. Répartition mondiale des génotypes Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert. Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7. V.Thibault DU_janv.-11 15
  • 16. Application à l'étude de diffusion de I certaines souches Diffusion du génotype IIA en France à partir d'une origine Africaine II Diversité génétique d’un génotype rare du virus de l’hépatite A III Pathologie Biologie, In Press, Available online 6 September 2010 D. Desbois et al. V.Thibault DU_janv.-11 16
  • 17. VHA : Paramètres Biologiques Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique) protection contre réinfection Ag foie IgG Symptomes Ictère VHA Selles IgM VHA Sang 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24 Semaines V.Thibault DU_janv.-11 17
  • 18. IgM HAV uniquement à bon escient ! 1% 11 % 82 % Faux positifs Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887 Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + Ig M HAV ⌦32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86) Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection… NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË V.Thibault DU_janv.-11 18
  • 19. Marqueurs biochimiques Diagnostic ⌦ Transaminases (ALAT, ASAT) ⌦ Bilirubine ⌦ Phosphatase alcaline ⌦ Facteurs de coagulation Sérologie +++ IgM anti VHA : infection récente IgG anti VHA : infection passée ou vaccination IgM et IgG anti VHA Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études] Virémie : techniques sensibles (105 v./mL) Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante (109v./mL), épidémiologie Salive : IgG (ELISA) V.Thibault DU_janv.-11 19 Génome viral (RT-PCR)
  • 20. Quantification de la virémie ? Limite de quantification 11 Hépatites A Normann et al., Journal of Medical Virology 72:10–16 (2004) Hépatite fulminante Evolution bénigne Fujiwara K et al. 50 Hépatites A dont 19 fulminantes (10 OLT) J. Med Virol. 2011 Feb;83(2):201-7. Hépatite fulminante : Hepatitis A viral load in relation to -virémie (p=0.03) * severity of the infection. -bilirubine -(p=0.04) * 11 patients with fulminant hepatitis -age (p=0.09) 10 with severe acute hepatitis -génotype non IA (p=0.09) 70 with self-limited acute hepatitis Rezende et al., Hepatology 38:613-618 (2003) V.Thibault DU_janv.-11 20
  • 21. Durée de la virémie: conséquences cliniques et biologiques 6-7 5-6 2-5 Log particules/mL Suivi de 13 patients : durée moyenne 95 jours Suivi de 27 patients dont 2 avec rechute (1-2 mois) High and Persistent Excretion of Hepatitis A Duration of viremia in hepatitis A virus Virus in Immunocompetent Patients infection Tjon et al. Bower et al. Journal of Infectious Diseases Journal of Medical Virology 78:1398–1405 (2006) 2000;182:12–7 V.Thibault DU_janv.-11 21
  • 22. Hépatite A : le vaccin virus inactivé AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie ⌦ Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC- 5 , inactivé HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue ⌦ Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines diploïdes MRC5 Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à 12 mois plus tard. La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur au moins jusqu'à 20 ans après primo-immunisation. Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17 V.Thibault DU_janv.-11 22
  • 23. Difficultés diagnostiques En routine Adresser prélèvements au Centre national de référence du VHA Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse 12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-11 23
  • 24. SRAS ? Hépatite E ? Grippe V.Thibault DU_janv.-11 24
  • 25. Historique VHE Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites ⌦1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH" Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A : Inde : prévalence de l’hépatite A importante Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan) Hépatite à J36 J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm) Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus) Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB) 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage  "VHE" 1991 : Tam et al. VHE 2000 : Panda et al. cDNA infectieux V.Thibault DU_janv.-11 25
  • 26. Coloured transmission electron micrograph of hepatitis E virus particles (purple) Holmberg, Lancet Vol 376 September 11, 2010 V.Thibault DU_janv.-11 26
  • 27. VHE Virus non enveloppé Sphérique (SRV) Famille : Hepeviridae Surface irrégulière Genre : Hepevirus Capside 27-34 nm Symétrie icosaédrique ARN simple brin hélice droite polarité + 7,5kb poly-A extrémité 3’ Stabilité Au laboratoire : instable(-70 à +8°C) Décongélation/congélation Tractus GI : stable (pH) V.Thibault DU_janv.-11 27
  • 28. Organisation génomique Non structurales Structurales 7 200 nt ARN polarité + 3’NC 5’ NC 28 5109 7124 Poly-A ORF3 MeT Y Pro P X Hel RdRp ORF2 Génotypes 1-3 Protéines DIAGNOSTIC immunogènes Hétérogénéité génétique Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2 Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype ⌦ Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?) ⌦ Vaccin : ORF 2 recombinante V.Thibault DU_janv.-11 28
  • 29. Similarités des souches humaines et animales Bilic et al. Journal of General Virology (2009), 90, 863–873 Sporadique Epidémique humaines aviaires Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region V.Thibault DU_janv.-11 32
  • 30. Evolution VHE Anthropotropic enzootic 536 to 1344 years ago Purdy MA, Khudyakov YE. Evolutionary history and population V.Thibault DU_janv.-11 33 dynamics of hepatitis e virus. PLoS One. 2010 Dec 17;5(12):e14376.
  • 32. Culture et Modèles animaux • Culture Difficile Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus) Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007) Cellule embryonnaire • Modèles animaux Primates : reproduction de la pathologie humaine Volontaires... VHE du porc, du poulet Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton... Lapin… Ma H et al. Experimental infection of rabbits with rabbit and genotypes 1 and 4 hepatitis E viruses. PLoS One. 2010 Feb 11;5(2):e9160 V.Thibault DU_janv.-11 36
  • 33. Résistance thermique du VHE… VHE dans des suspensions fécales : Inactivation : 70°C 10' ou 95°C 1 min; 56 °C 30 min maintien de l'infectiosité Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007 Colson et al. JID 2010:202 V.Thibault DU_janv.-11 37
  • 34. VHE et contamination des eaux Presence of hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV) in urban wastewater Prédominance du génotype 3 J. Rodriguez-Manzano et al. Excretion patterns of HAV and HEV infections in Eastern Spain Journal of Water and Health 08.2 2010 V.Thibault DU_janv.-11 38
  • 35. VHE : Paramètres Biologiques Khuroo MS, Khuroo MS. Seroepidemiology of a second epidemic of hepatitis E in a population that had recorded first epidemic Titre peu élevé 30 years before and has been under surveillance protection contre réinfection ? since then. Hepatol Int. 2010 Feb 3;4(2):494-9 IgG Symptomes Ictère VHE Selles IgM VHE Sang 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200 Jours V.Thibault DU_janv.-11 39
  • 36. Virémie et excrétion fécale Virémie Selles Détection du RNA-VHE chez 20 patients ayant une hépatite E aiguë Aggarwal et al. THE LANCET • Vol 356 • September 23, 2000, p1081-1082 Chandra NS et al. Dynamics of HEV viremia, fecal shedding and its relationship with transaminases and antibody response in patients with sporadic acute hepatitis E. V.Thibault DU_janv.-11 40 Virol J. 2010 Sep 6;7:213
  • 37. HEV – virémie- selle transmission serum salive Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM IgG autologue IgM Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75. V.Thibault DU_janv.-11 41
  • 38. Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé, La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée ! (ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR) Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748 V.Thibault DU_janv.-11 42
  • 39. Stratégie Diagnostique Marqueurs non biologiques circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie) A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?) clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez l'immunocompétent ! ) – Portage prolongé en cas d'immunodépression Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D) Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès) Marqueurs sérologiques spécifiques IgM anti-HEV IgG anti-HEV (+++) RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles) ATTENTION : spécificité - performances V.Thibault DU_janv.-11 43
  • 40. Incidence des cas d'hépatite E en France : un gradient Nord-Sud Renou et al. 2008 Aliment Pharmacol Ther 27, 1086–1093 Nicand et al. Pathol Biol. 2009 Mar;57(2):203-11 V.Thibault DU_janv.-11 44
  • 41. Performance des tests Panels 50 sérums ARN HEV (+), G3 406 sérums IgG ARN HEV (-) IgM anti-HEV Microplaque Microplaque Test rapide Adaltis MP Diagnostics MP Diagnostics anti-HEV IgG positif négatif positif négatif positif négatif Positif (n=41) 40 1 39 2 37 4 Negatif (n=9) 5 4 5 4 4 5 Total (n=50) 45 5 44 6 41 9 Sensibilité 90 88 82 Spécificité 100 99.5 100 VPP 100 95.7 100 VPN 98.8 98.5 97.8 Legrand-Abravanel CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, May 2009, p. 772–774 V.Thibault DU_janv.-11 46
  • 42. Stratégie Diagnostique Se donner les moyens de faire le diagnostic Diagnostic Indirect Diagnostic Direct Recherche de l'immunité antivirale Recherche du génome sur IgM anti VHE prélèvements sang et selles IgG anti VHE Diagnostic IgG IgM RT-PCR Certain ++ ++ + Probable - ou + - + Douteux +++ - - Immunité + - - ancienne Huang S et al. 2010 Profile of Acute Infectious Markers in Sporadic Hepatitis E. PLoS ONE 5(10): e13560 V.Thibault DU_janv.-11 47
  • 43. VHE et traitement Efficacité du PEG-IFN Efficacité de la ribavirine chez les patients ⌦Pas de mécanisme virologique précis décrit Haagsma EB et al Liver Transpl. 2010 Apr;16(4):474-7 Mallet V et al. Ann Intern Med. 2010 Jul 20;153(2):85-9. Kamar N et al. Nephrol Dial Transplant. 2010 Aug;25(8):2792-5. Kamar N et al. Gastroenterology. 2010 Nov;139(5):1612-8. V.Thibault DU_janv.-11 48
  • 44. VHE et vaccination 20 μg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium. 3 injections Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE Efficacité : 95,5% après 3 doses Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9 V.Thibault DU_janv.-11 49
  • 45. HEV 239 (Hecolin; Xiamen Innovax Biotech, Xiamen, China), VHE et vaccination produced in bacterial cells : safe and efficacious against infection with hepatitis E virus in seronegative participants in a phase 2 trial Zhu et al Lancet. 2010 Sep 11;376(9744):895-902 V.Thibault DU_janv.-11 50
  • 46. Difficultés diagnostiques En routine Adresser les prélèvements au Centre national de référence du VHA/VHE Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse 12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21 http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste V.Thibault DU_janv.-11 51