2. Métodos Volumétricos Métodos gravimétricos Ventajas Análisis de buena precisión Análisis de materiales patrones Métodos absolutos Inconvenientes Lentos Sensibilidad limitada Métodos clásicos (vía húmeda)

3. Cromatografía de gases (GC) ICP HPLC Absorción atómica de llama (AAS) Ventajas Gran sensibilidad Potencia de análisis Más rápidos Automatización Control computarizado Tratamiento de datos Datos gráficos Evaluación estadística Comparación espectros Control de parámetros Técnicas electroquímicas Algunos ejemplos Absorción molecular UV-vis (EAM) Espectrometría de masas Métodos instrumentales

4. ¿Qué tienen en común? Patrones secundarios de concentraciones conocidas o Patrones primarios certificado Hay que establecer la relación Señal / Concentración Calibración Patrón primario certificado

5. Y en el ensayo… Muestra Concentración? Interpolar la señal en la curva de calibración

6. Patrones de calibración Concentración conocida Cubrir el rango de concentración de las muestras a analizar en los ensayos Mismos disolventes y reactivos que en el ensayo Matriz lo más parecida posible que la muestra real Incluir el blanco en la curva (no restar) Gráfica de calibración Señal instrumental en ordenada Concentración, cantidad en abcisa Habitualmente lineal y = a + bx (no siempre) Errores Coeficiente variación de señal instrumental 2-3% Preparación del patrón < 0,1% (despreciable) Si se realiza varias medidas punto calibración : Distribución gaussiana normal

7. Centro de gravedad de la calibración (  ,  ) Se establecen pares (x i , y i ) Se incluye el blanco (0, y 0 )

8. La calibración es realmente lineal? Rango de valores -1  r  +1 +1 Correlación positiva perfecta. Ajuste perfecto -1 Correlación negativa perfecta. Ajuste perfecto 0 No existe correlación

9. Que valores de r indican una buena calibración? Se puede realizar un contraste estadístico en función del número de puntos de calibración H 0 r es pobre, x e y no guardan relación t calc < t crit H 1 r es significativo, buena correlación t calc > t crit Para t crítica = t n-2, 0.05 (tabla dos colas) t calc Generalmente para alrededor de 5 puntos de calibración r 2 > 0,995 Es aceptable Asegura una relación lineal? No

10. Malinterpretaciones de r Estupendo r 2 > 0,995 = Relación lineal Falso La relación entre x e y es una función polinómica de segundo grado y = cx 2 +bx 2 +a 2

11. Malinterpretaciones de r r =0 No existe relación entre x e y Falso Si hay relación entre x e y pero no es lineal sino parabólica

12. Para un x i de un patrón, diferencia entre el valor de señal y i y la que le correspondería en la recta de calibración Correlación lineal Distribución de residuos gaussiana y de media 0 (simétricas) Correlaciones no lineales Distribución de residuos no gaussina normal Linealidad de la gráfica de control

13. Homocedasticidad de residuos Homocedasticidad La dispersión (desv.std) de la población independiente de x (concentración) Todos los puntos en calibración igual peso Calibración no ponderada Heterocedasticidad La dispersión (desv.std) de la población depende de x (concentración) Los puntos en calibración no deben de tener igual peso al realizar la regresión Calibración ponderada Calibración ponderada

14. Ponderar o no ponderar ¿Como podemos evaluar si las desviaciones de la señal a lo largo de las concentraciones difieren o no? Repitamos n 1 veces un patrón de calibración a baja concentración del rango Calculemos s 1 Repitamos n 2 veces un patrón de calibración a alta concentración del rango Calculemos s 2 Dos s, averiguar si son significativamente la misma precisión… ¿A que suena esto? Al clásico test de Fischer H 0 Fcal < Fcrit s 1 =s 2 Se asume que la precisión en el rango de concentraciones de calibración es la misma ( homocedástico, no ponderar ) H 1 Fcal > Fcrit s 1 =s 2 Son diferentes a lo largo del rango ( heterocedástico, ponderar )

16. Es la recta que minimiza la suma de los cuadrados de los residuos Se establece una recta lineal que relaciona x e y y = bx + a Donde Pendiente/ sensibilidad instrumental Ordenada en el origen Ejemplo La recta pasa necesariamente por (  ,  ) Centro de gravedad de la calibración

17. Recordad condición 1, el error en la preparación de patrones es despreciable (< 0,1%) respecto a la dispersión de la señal (2-3%) Utilicemos los cuadrados de los residuos para hallar una medida de los errores aleatorios en la ordenada (señal) Parecida a la desviación estándar de medidas repetidas de una distribución gaussiana excepto que ahora trabajamos con una recta (n-2)

18. Ahora podemos hallar los errores y límites de confianza de la pendiente y de la ordenada en el origen Desviación estándar de la pendiente Desviación estándar de la ordenada en el origen Intervalo de confianza de la pendiente b ± t (n-2) s b Intervalo de confianza de la ordenada en el origen a ± t (n-2) s a Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)

19. Tenemos la relación lineal entre concentraciones y señal del instrumento Analicemos una muestra de concentración desconocida ¿ Cual será el error de la medida de concentración interpolada? Depende de la precisión de la señal instrumental (recuerda que era apreciable) Depende de la incertidumbre/error de la calibración efectuada ( s b y s a ) Expresión del error global muy compleja !!!

20. Se utiliza una expresión aproximada Siendo y 0 valor de la señal experimental de la muestra n Nº de patrones utilizados en calibración x i Concentraciones de patrones de calibración Que se puede transformar en Siendo m Repeticiones de la medida de la muestra Si realizamos más de una medida de la muestra Intervalo de confianza de la concentración interpolada (x 0 ) x 0 ± t (n-2) s x 0 Para n-2 grados de libertad y la confianza/probabilidad deseada (preferiblemente al 95%)

21. Tiende a 0 cuando la señal se encuentra en la zona central de la calibración Se minimiza s x 0 Se minimiza los errores y la incertidumbre x 0 ± t (n-2) s x 0 Los menores errores en el centro de la calibración

22. Interesa seleccionar bien cual es el rango de concentración que queremos cubrir antes de calibrar Zona central calibración = Rango de concentración esperado de las muestras x 0 ± t (n-2) s x 0 mínimo Medida con bajo error asociado x 0 ± t (n-2) s x 0 máximo Medida con alto error asociado

23. ¿Como se calculan?

24. Definición “ Aquella concentración de analito que proporciona una señal en el instrumento significativamente diferente de la señal de ruido de fondo o señal de un blanco” ¿Donde situar la frontera entre ruido y señal de analito? Definición abierta a interpretación Situémoslo en Lc para α (p.e. 0,05) distribución normal de la señal de ruido o blanco (y b ) Imaginemos que son 2 ppb Cualquier señal que de una concentración > 2 ppm se debe al analito y no a ruido Podemos cometer error !!! Hay ocasiones ( α ) en las que damos por señal de analito lo que es ruido

25. Estamos diciendo que nuestro técnica ve a partir de 2 ppb pero… ¿Qué pasa con los valores de señal y concentración < 2 ppb que se deben a analito? Erróneamente decimos que es ruido cuando es señal de analito No podemos definir LOD de esta forma, demasiado error

26. Debemos aumentar el límite de detección para tener menos errores α y β Si distancia L D – Y B = 3 S blanco Se demuestra que los errores α y β < 7% Error razonable que es asumible σ 0 = σ D Recuerda !!! que s es igual en todo el rango de concentración calibrado HOMOCEDASTICIDAD

27. Hemos definido LOD Y LOD = Y B + 3 S Blanco También se utiliza LOQ Y LOQ = Y B + 10 S Blanco El criterio de utilización es puramente arbitrario, pero hay que indicar el método utilizado Interpolar en recta calibrado para averiguar concentraciones LOD o LOQ

29. Interpolar en recta calibrado para averiguar concentraciones LOD o LOQ

30. La adición de patrón es apropiada cuando la composición de la muestra es desconocida o compleja y afecta a la señal analítica No siempre podemos aislar el analito de interés del resto de componentes que lo acompañan en la muestra ¿Influirán en la señal del analito? ICP

32. Si realizamos calibración con disoluciones puras de Zn (II) en agua destilada estaríamos cometiendo un error ya que la relación Señal/concentración Zn(II) nada tiene que ver el de las muestras reales (interferidas por Na + ) Queremos analizar Zn en agua de mar Alrededor de 11000 ppm Na + Solución Reproduzcamos lo mejor posible condiciones de salinidad de muestras añadiendo 11000 ppm de Na + a cada patrón

33. Ahora queremos analizar Zn en agua de ría ¿ppm Na + ? En función de las mareas y entrada de agua de mar a la ría Rango desde unos pocos ppm hasta 11000 ppm Solución Método de adición de patrón No podemos realizar unas condiciones de calibración que reproduzca el número infinito de posibilidades de concentración en Na + en muestras a distinta salinidad

34. ¿En que consiste? Adición de cantidades conocidas (excepto a una) de concentración de analito de interés a volúmenes iguales de la muestra a analizar ¿Concentración en Zn de la muestra analizada? Extrapolar

37. Útil para la calibración de impurezas de disolvente orgánico Cromatografía de gases (GC) Queremos calibrar las impureza DAA y otras de la acetona Utilizamos patrones en acetona (idéntica matriz que muestras) añadiendo concentraciones conocidas de DAA y demás impurezas Problema No existe una acetona perfectamente pura, siempre tiene DAA y demás impurezas

38. Obtendremos una curva de calibración similar a las de adición de patrón (igual para resto de impurezas) DAA En este tipo de casos no hay mayor efecto matriz una vez los patrones se preparan en el propio disolvente Misma pendiente de respuesta que si la acetona para preparar patrones de calibración fuera totalmente pura Se le descuenta la señal en el origen que pertenece a la concentración de DAA que lleva la acetona con la que se prepararon los patrones DAA y = a + bx y = bx Nos quedamos con el factor de respuesta instrumental respecto a la DAA

40. ¿Como cambian las parámetros de recta de calibración? Siendo ahora los valores del centro de gravedad ¿Y el error de concentración en la interpolación sobre la recta de calibración? En la dirección y En la concentración tras interpolación

41. Los valores de centro gravedad en calibración ponderada más próximos a valores bajos (  w ,  w ) En la práctica para simular el efecto de ponderación en regresiones no ponderadas se suelen utilizar concentraciones que no varían de forma uniforme forzando la recta a ajustarse a valores bajos de concentración

42. ¿Qué es un patrón interno? Compuesto que no pertenece ningún componente de la muestra a analizar que se añade siempre en la misma cantidad a todas los patrones y muestras a analizar Patrón Interno + 10 ppm P.I. ¿Para qué? Para corregir la fluctuación de señal de respuesta del equipo, especialmente en aquellas técnicas con un S y/x alto Errores aleatorios de detector Errores de caudal de líquidos/gases portadores Errores aleatorios de control de parámetros de equipo Fluctuaciones de tensión eléctrica, etc.

44. Área pico Analito / Área P.I. ppm analito Se divide el área de pico del analito por el área de pico del P.I. cancelándose mutuamente las fluctuaciones del equipo en un nuevo índice “libre” de ellas La precisión de la calibración mejora enormemente Se procede igual para muestras (añadiendo la misma cantidad de P.I.), ahora la señal de interpolación será Área analito muestra/ Área P.I. + 10 ppm P.I.