El documento describe las tecnologías de RT-qPCR. La RT-qPCR permite la cuantificación cualitativa y cuantitativa de ácidos nucleicos en tiempo real. La técnica implica la extracción de RNA, transcripción reversa a cDNA, y amplificación por PCR cuantitativa en tiempo real para medir los niveles de expresión génica. La RT-qPCR ofrece mayor sensibilidad y rango dinámico que otras técnicas como la PCR convencional.

1. TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre
 Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez)
 RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)

2. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

3. Definición de la Técnica
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
Termociclador
Cebadores Ácido nucléico con sistema de detección
Taq
polimerasa
A G CU
T
Nucleótidos
Tampón de
reacción
UNG
(opcional) ROX
Sonda Agentes intercalantes
R Q
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr

4. ROX como referente pasivo
ROX=6-carboxy-X-rhodamine
+ ROX - ROX
Desv St= ± 0.306
Desv St= ± 0.059
Δ Rn
Ciclos Ciclos
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado
para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.

5. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

6. Terminología asociada a qPCR
Escala semi-logarítmica
al Plató
Line
Log Fluorescence
l
cia
en
pon
Rn
Threshold
Ex
Baseline
Ct value= 15.5
Cycle Number

7. RT-qPCR vs PCR Convencional
PCR Convencional RT-qPCR
 Semi-cuantitativa:  Cualitativa y cuantitativa.
 Rango dinámico pequeño ›2 logs
 Baja Precisión; baja resolución y poco Cuantificación Absoluta
A tiempo real
Sensible.
(fase exponencial) Cuantificación Relativa
 Manipulación post-PCR .
 Baja Resolución
 No-automatización A tiempo final Plus/Minus
 Elevado rango dinámico de detección
(fase plató) Discriminación Alélica
 Discriminación basada sólo en tamaño  Capaz de detectar cambios 2-fold.
No requiere procesado post-PCR
 Los resultados no están expresados en 
números.
 El BrET no es muy cuantitativo

8. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

9. Diseñando un experimento de qPCR
 Aplicación
 Método de Normalización
 Química de detección:
 Sondas específicas marcadas con fluorocromos
 Agentes Intercalantes
 Fluorocromos unidos a primers
 Reactivos:
 Core kit vs Master Mix
 dNTPs/dUTPs y UNG enzyme
 ROX como referente pasivo
 Termociclador:
 Formato
 Número de canales de detección
 Software de análisis
 Duración del programa
 Precio y flexibilidad de la oferta

10. Aplicaciones RTqPCR
3´oligo
5´oligo
Proteína
Tejido Target
mRNA
miRNA
Célula RNA ncRNA
Eucariota siRNA
saRNA
CNA
Análisis en Células Stem Validación Microarrays
Análisis en célula Única
DNA
Bacteria SNP
CNV
Mutaciones
Micoplasma
Patógenos en la comida Virus Análisis Metilación

11. Estrategias de Normalización qPCR
 Normalización respecto a la masa total de RNA exraído
(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
 Normalización respecto al volumen/masa de la muestra
( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
 Normalización respecto al número de células
( moléculas/célula)
 Normalización respecto a un gen endógeno no regulable
(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
 Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3)
 geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology)
 BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004)
 Normfinder
 Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)
Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review
BMC Bioinformatics 2009, 10:110

12. Plataforma de RTqPCR en la UCTS
7000 SDS 7900HT Fast SDS LightCycler 480
Tiras de 8 Tubos
Formato
Microfluidicas Placas-384 White Plates-384
Placas-96
(Arrays de baja densidad)
Ref. Pasivo ROX Ninguno
ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, Filtros/canales detección:
Química FAM, TAMRA, VIC, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.
JOE, NED, SYBR, ROX 500, 533, 568, 610, 640, 670 nm
Formato LDA: FAM, VIC, ROX.
mode 9600 Emulation/Standard Fast
9600 Emulation /Standard
Fast
Softwares V1.2.3f2 con RQ study SDS 2.4.1
RQ Manager 1.2 SW 1.5
Primer Express 2.0

13. La UCTS dispone de los siguientes reactivos:
Química: SYBRGreen SondasTaqMann SondasTaqMann
UNG: Sí Sí
Mode: 9600 Emulation/Standard Fast

14. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

15. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ác. Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )

16. Preparación Material de partida
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
 Tipo de muestra
 Método Extracción
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

17. Preparación Material de partida
DNA
Producto
Muestra
Amplificado
RNA cDNA
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
 RNA total/mRNA/DNA
 Calidad & Cantidad
 Almacenamiento (-80ºC)
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

18. Evaluación del RNA
RNA Q &Q
Pureza (ausencia Integridad Cantidad
de contaminación por • Existen dif. métodos de
DNA y Proteínas y • rRNA ( 28S:18S=2:1) cuantificación.
ausencia de inhibidores) • Número RIN (› 5) • Generan difs. resultados.
• ODA260/A280=1.8-2.0 • Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica •Hay que cuantificar muestras
elevada integridad; ›5 degradado) comparables entre sí con el
• OD A260/A230=2 mismo método de cuantificación.
• SPUD assay (Nolan, 2006)
Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139 Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)
PERFECTO BUENO MALO
10.0 9.2 8.1 7.2 6.0 5.0 4.4 4.0
2:1
Gel Desnt.
Agarosa Agilent Bioanalyzer

19. Reacción de Transcripción Reversa (RT)
Producto
Muestra RNA cDNA Amplifcado
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
 One-Step vs Two Step
 CDNA Priming
 Pérfil Térmico
 Consideraciones Experimentales
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

20. One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR
One-Step RT-PCR  Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo
tubo.
 AmpErase UNG no se puede usar.
 Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente.
 Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación.
 No es posible la optimización por separado de ambas reacciones.
 Requiere primer RT específico de secuencia.
 Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa.
 Acumulación de dímeros de primers.
RT qPCR
RNA cDNA Producto Amplif.
Two-Step RT-PCR  Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y
reacción PCR).
 Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado
RNA
RT
cDNA
más tarde).
 Permite la optimización por separado de ambas
reacciones.
qPCR
cDNA Producto Amplif.  Permite el uso de primer RT específico de secuencia,
random primers o oligo(dT).
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

21. Transcripción Reversa: cDNA Priming

22. Consideraciones Experimentales de la RT
 En general, usar el RNA total como molde para la RT.
 Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy
importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis
de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar
resultados entre sí.
 Hacer réplicas
 Incluir siempre control no-RT
 Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción.
 Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al
mismo tiempo para evitar la variación entre tandas.
 Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra
control positiva de referencia en todas las tandas.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

23. qPCR
Producto
Muestra RNA cDNA Amplifcado
Preparación Extracción Transcripción PCR a tiempo
Muestra Ácidos Nucléicos Reversa (RT) Real (qPCR )
 Elección en el software del ensayo a realizar
 Perfil Térmico
 Consideraciones Experimentales
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006

24. Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

25. Con Curva Stándard
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
Absolute Quantification Standard Curve (AQ)
(Standard Curve)

26. Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI

27. ddCt
7900 SDS
7000 SDS ∆∆Ct (RQ)
Relative Quantification (ddCt) Plate
Relative Quantification (ddCt) Study

28. LightCycler 480 II

29. Perfil térmico clásico qPCR
Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG
1.- Activación UNG
2.- Activación Taq y desnaturalización UNG
3.- Desnaturalización del dsDNA
4.- Anillamiento y extensión primers

30. Consideraciones qPCR
 Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra
calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la
variabilidad inter-ensayo.
 Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas
difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados
biológicos.
 Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más
distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación
cruzada.
 Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.
 Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación
de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas,
es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta
10 horas.
 Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y
huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad

31. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

32. Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
DNA Producto
Amplificado
Muestra RNA cDNA
Preparación
Muestra
Extracción
Ác. Nucléicos
Transcripción
Reversa (RT)
PCR a tiempo Real Análisis
(qPCR )
de datos
Calidad del
Ensayo
Métodos de
Cuantificación
Estadística

33. Calidad del Ensayo
 Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
 Controles qPCR
NEGATIVOS
 NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación
 NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas
 No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS
 Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar.
 Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos
 Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
 Curva de Disociación (SYBR Green)
 Curva Estándar
 Linealidad de los datos
 Distancia entre las curvas de amplificación
 Eficiencia de amplificación

34. Calidad del Ensayo
Curva Estándard: Eficiencia Convertir E en
Pendiente Amplificación Porcentaje
(E= 10-1/slope) %E= (E-1)100%
R2 ›0.98 o r › 0.99 -3,0 2,2 115
-3,1 2,1 110
Slope= -3.73
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100 OK
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
2n=Factor de dilución
Factor
n=LG(Factor Dil.)/LG(2)
Dilución
2 1,00
5 2,32
10 3,32

35. Métodos de Cuantificación
Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa
Cantidad de ácido nucléico (número de Cantidad relativa de ácido nucléico
copias, µg) por cantidad de muestra de una muestra A
dada (por célula, por µg de RNA total) respecto a una muestra B
Ejemplo: Niveles de expresión génica
Ejemplo: medida carga viral
en Tumor vs Tejido normal.
A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard:
Qty gen problema
Muestra Problema =
Qty gen EC
106 105 104 103 102 10
Qty gen problema
Calibradora =
Qty gen EC
B.- Método Pfaffl:
(Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra problema)
RQ =
(Egen EC)
Ct
dCT, gen EC (calibradora – muestra problema)
C.- Método (Livak) Doble Delta CT:
dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC)
ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora)
Log (Num de copias)
RQ= 2–ddCT

36. Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC
Slope
(Ct gen Target – Ct gen Endógeno) R2
Y = 0.0471x + 3.0178
R2 = 0.2315
ΔCt=
Log Diluciones

37. RTqPCR en tela de juicio
Routine lab method’s accuracy called into
question
NATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010
Catherine Shaffer
Ejemplos:
1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel disease
V Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90
Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.
RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic
children.
S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.
2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces
flowering.
Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696
“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885
Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.
H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.

38. Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR

39. MIQE Guidelines

40. Programa del Seminario RTqPCR-2011
 Definición de la técnica
 Terminología asociada a qPCR
 Diseñando un experimento de qPCR
 Etapas en la realización de un experimento de qPCR
 Evaluación de un ensayo de qPCR
 Bibliografía muy recomendada

41. Direcciones de interés relacionadas con qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://genex.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html

42. Seminario RTqPCR
18 de Octubre en VHIR
Prof. Michael Kubista
Está entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR

43. Gracias