El documento discute el potencial del diagnóstico molecular para cambiar el enfoque del diagnóstico y tratamiento de la alergia alimentaria y aeroalergenos. El diagnóstico molecular permite identificar componentes específicos de alérgenos e informar diagnósticos y tratamientos más precisos.

1. Dr. Tomás Velarde Domínguez
EscuelaMédicoMilitar
HospitalCentralMilitar,Cda.México.
Hospital.Lic.AdolfoLópezMateosISSSTE
UnidaddeEspecialidadesMédicasSEDENA
¿El diagnóstico molecular puede
cambiar el abordaje de la alergia
alimentaria y por aeroalergenos?

2. IgE
Identificar, aislar y purificar múltiples alérgenos.
Técnicas de DNA recombinante (Nanotecnología)
Micromatrices ( microarrays)
Ello permite hablar de:
DIAGNÓSTICO MOLECULAR O DIAGNÓSTICO POR COMPONENTES
(component-resolved-diagnosis CRD)

3. El papel del especialista en Alergología, bajo el conocimiento actual, es establecer el
riesgo potencial de enfermedad alérgica, situación difícil de determinar, y que requiere
un continuo entrenamiento y años de experiencia clínica.
Dr. Tomás Velarde Domínguez.
Tiempo
RIESGO
Severidad de los síntomas (afección en calidad de vida)
Detección precoz de la enfermedad alérgica…
No
sensibilizado
IgE normal IgE elevada Sensibilizado
Piel-digestivo-Respiratorio
(Marcha Alérgica)

4.  Interesantes expectativas.
 Miniaturización del diagnóstico en Alergia.
 Sueño de conocer la especificidad molecular IgE en
cada paciente.
 Diagnóstico refinado.
 Múltiples perfiles de sensibilización.
 Predecir reacciones severas y la evolución de las
mismas.
 Inmunoterapia más precisa

5. Dr. Blakely
1893
Prueba cutánea
Von Pirquet
1906
Toxina Caballo
Sir Henry Dale
Histamina 1910
Dr Leonard Noon
1910
Vacunas hiposensibilizantes
1966
IgE
Ishizaka / Johansson
1908
Mantoux
1921 primer
extracto estandarizado
1924
Lewis y Grant
pruebas por punción
1970
Pepys modifica la prueba cutánea
1967
Pharmacia
1970
Phadebast
amylase
test
1971
Allergon
B
1972
Phadebast
IgE test
1974
Phadebast
Rast
(IgEs)
1976
Pharmacia
Diagnostic
IgE PRIST
1981
Phadezym
RAST
1986
Wallac Oy
Phadiatop
1989
Immunocap
1990
Procordia /
Kaby
1995
Fusión con
Upjohn
1995
Immunocap
100
Automático
Pharmacia &
Upjohn
Diagnostic
1990
Procordia /
Kaby
1997
Varelisa Elias
Autoinmunidad
Immunocap
2000
Micromatices
2009
ISAC
2010
Phadia
2500
5000
2011

6. PANALERGENOS
Proteínas ligadoras de calcio,
Homólogos del alérgeno mayor
del abedul,
Determinantes de hidratos de
Carbono y las profilinas
DILEMA DE LA POLISENSIBILIZACIÓN…!PROBLEMA FRECUENTE EN
ALERGIA!
 ¿Es sensibilización independiente?, es decir cada alérgeno es
responsable de la enfermedad clínica.
 IgE muy elevada y entonces ¿toda ella se fija de manera
inespecífica?
 Fenómeno de reactividad cruzada.
La alergia vista desde
el enfoque molecular:

8. POLISENSIBILIZACIÓN
 ≥ 3 Alergenos no relacionados
 36% Población infantil

9. DIFERENTES INMUNOENSAYOS MARCADOS…….FASESOLIDA/LÍQUIDA
Ag
Conjugado marcado
RADIOINMUNOENSAYO
(RIA)
ENZIMOINMUNOENSAYO
(EIA)
FLUOROINMUNOENSAYO
(FIA)
QUIMIOINMUNOENSAYO
(QIA

10. Nomenclatura de los alérgenos ( Marsh,Lowestein.,Platts-Mills,1980)
Primeras 3 letras del género, primera de la especie y
No. de identificación:
Felis domesticus 1: Fel d 1
Ambrosia artemisiflora 1: Amb a 1
Isoalergeno: Tamaño, f, y > 67% secuencia a.a.
Ejem: Amb a 1. 01
Isoforma: > 97% homología secuencial:
Ejem: Amb a 1.01 01, Amb a 1.01 02

11. Sitio de corte enzimático
Epítope 1
Epítope 2
 Secuenciales
 Conformacionales
La reactividad cruzada requiere al
menos un 70% de estructura
conformacional.

12. Epítope 1 Epítope 2
La reactividad cruzada requiere al
menos un 70% de estructura
conformacional.

13. Gal d 4
(lizosima
 Gal d 1 Alta estabilidad térmica , difícil
desnaturalizar, 11% proteína de la clara
 Gal d 2 54% proteína clara. Resistente a
la digestión por la pepsina a pH 1.2,
lábil al calor y se desnaturaliza a 90
grados
 Gal d 3 Ovotransferrina 12% clara, lábil
al calor a 95 grados por 15 min.
 Gal d 4 3.4% clara termolábil a 80
grados, resistente a pepsinas
 Gal d 5 14% proteínas de la yema ,
relacionado s. ave-huevo, cruza con
OVOTRANSFERRINA, termolábil a 90
grados 30 min.
 Gal d 6 resiste calor, lábil a pepsina
Gal d 2
Ovoalbúmina
Gal d 5
alfalivetina
Gal d 6
(Vitelogenina)

14. Alerge
no
Literatura
experimental
Secuencia Pruebas
Immunoblott
Prueba de
función
(degranulación
basófilos)
Prueba
cutánea
Prueba
reto
conjuntival
Prueb
a reto
nasal
Prueba
reto
bronquial
Reto
oral
Datos
epidemiología
Monitoreo tiempo real
sensibilización IgE
Gal d
1
Gal d
2
Gal d
3
Gal d
4
Gal d
5
Gal d
6

15. Alergeno Literatura
experimental
Secuencia Pruebas
Immunoblott
Prueba de
función
(degranulació
n basófilos)
Prueba
cutánea
Prueba
reto
conjuntiv
al
Prueba
reto
nasal
Prueba
reto
bronquial
Reto oral Datos
epidemiologí
a
Monitoreo tiempo real
sensibilización IgE
Der p 1
Der p 2
Der p 3
Der p 4
Der p 5
Der p 6

16. LÁCTEOS
MATERNO
VACA
40% CASEÍNA
60% PROTEÍNAS SÉRICAS
α LACTOALBUMIN A
Lactoferrina, lactosa,
transferrina, hierro, ácidos
grasos cadena larga, IgA,
vitaminas
NO CONTIENE
β LACTOALBUMINA
80% CASEÍNA
20% PROTEINAS SÉRICAS
α LACTOLABUMINA
β LACTOALBUMINA
FORMULA ARTIFICIAL
FORMULA ADAPTADA

21. Alergeno Literatura
experimental
Secuencia Pruebas
Immunoblott
Prueba de
función
(degranulació
n basófilos)
Prueba
cutánea
Prueba reto
conjuntival
Prueba
reto
nasal
Prueba
reto
bronquial
Reto
oral
Datos
epidemiología
Monitoreo tiempo real
sensibilización IgE
Bos d 1
Lipocalina
Bos d 2
Lipocalina
Bos d 3
Proteína
unión Ca
Bos d 4
Α-lacto
albúmina
Bos d 5
β-lacto
globulina
Bos d 6
Albumina
suero
Bos d 7
IgG
Bos d 8
Caseina
(α,β,κ)
Bos d 9
α S-1
caseína
Bos d
10 α S-2
caseína
Bos d
11 β
caseína
Bos d
12 κ
caseína

22. Características APLV NO APLV
Reto Historia Tolerancia Negativa
Sexo (Niños /Niñas) 21 / 13 18 / 9 7 / 4 9 / 2
Edad en años (media) 3.9 ( 1.0 – 12.7) 3.0 (0.8 – 12.8) 2.5 (1.0 -15.8) 3.2 (1.4 – 14.2)
Serología (media, rango)
IgE total (kU/L) 395 (32 – 12,784 536 (34 -14,283) 267 (44 – 3,260) 958 (66.1 – 27,815)
IgE leche específica (kUA/L) 11.6 (< 0.35 - > 100) 15.9 (1.4 - > 100) 4.2 (<0.35-27.6) 3.9 (1.0-17.3)
IgE caseína específica(kUA/L) 13 (<0.35 - >100) 21.6 (0.42- >100) 2.3 (<0.35-6.6) 2.0 (1.1 -4.2)
Síntomas de alergia No.(%)
Dermatitis atópica 28 (82%) 24 (89%) 9 (82%) 10 (91%)
Asma 9 (26%) 12 (44%) 5 (45%) 1 (9%)
Alergia a huevo 25(74%) 20(74%) 4(36%) 6(54%)
Medicación No. (%)
Antagonistas H-1 6 (18%) 6 (22%) 3 (27%) 3 (27%)
Esteroide inhalado 2 (6%) 5 (18%)
55
28
¿UTIL?

23. Ito et al . Clinical and Molecular Allergy 2012 10:1 1-7
La leche se conforma de suero
y coágulo.
Suero contiene α y β
lactoalbúmina.
Coágulo contiene caseína.
Potencialmente todas las
proteínas son alergénicas.
Mayor sensibilidad y especificidad con CASEINA

24. Prueba APLV
(61)
GRUPO NO APLV GRUPO CONTROL
NO SENSIBILIZADO A LECHE
Tolerancia
(11)
Negativo
(11)
Atopia
(28)
Sin atopia
(31)
Caseína 0.36
( < 0.07-13.4)
0.46
(<0.07-25.4)
24.8
(0.17-197)
5.2
(0.14-64.7)
1.3
(< 0.07-125)
valor p - NS < 0.001 < 0.001 NS
α -lacto
albúmina
< 0.07
(< 0.07-2.7)
< 0.07
(<0.07-1.8)
7.1
(0.09-52.9)
2
(<0.07-44.7)
1.2
(<0.07-25.1)
valor p - NS < 0.001 <0.001 <0.01
β-lactoalbúmina <0.07
(<0.07-3.5)
0.09
(<0.07-1.8)
5.2
(<0.07-16.5)
1.5
(<0.07-20.6)
0.53
(<0.07-28.2)
valor p - NS < 0.001 < 0.001 < 0.001
Nivel de anticuerpos IgG4 alérgeno específicos a leche
IgG4 pudiera utilizarse como valor protector o de tolerancia

25.  Mejor rendimiento en
diagnóstico APLV es IgEs
caseína.
 APLV es problema de salud
pública.
 Evitar el consumo de caseína
no es tarea fácil.
 Muchos productos no lácteos
contienen caseína.
 Placebo doble ciego oral es
estándar de oro en Dx.
 Niveles elevados de IgEs vs
leche en > 5 años: peor
pronóstico.

26. Mayor concentración IgE específica a leche a mayor edad
PEOR PRONÓSTICO

27.  Presencia de IgG4 se
considera respuesta
fisiológica normal.
 Niveles elevados indican
mayor tolerancia.
 Marcador de tolerancia.
Niveles IgE/IgG4.
 IgG4 refleja exposición a
leche.
 IgG4 muy elevada sugiere
factor protector para
alergia a leche (
¿Fenotipo?)
 No es un estudio para
alergia a leche.
 Se requieren más estudios al
respecto.

28. ¿El diagnóstico molecular puede cambiar la indicación y prescripción de los
alérgenos en la ITE?
Extractos de diversos alérgenos
(mezclas, purificadas o no)
 Específicos
 Reacción cruzada
 Concomitante

29. 141 pacientes (RCA / AB)
31 años ( ± 13.6)
59% Mujeres
Prick:
 Olea
 Platanus
 Cupressus
 Cynodon
 Artemisa
 Plantago
 Phragmites
 Mezcla gramíneas
Microarray 96 alérgenos
ISAC® Phadia

31. PRICK TEST VS ISAC® PHADIA
No hay concordancia con la prueba
cutánea
54% hay desacuerdo en la indicación ITE
Solo basado en el resultado de la prueba
cutánea o serológica.
Sensibilidad cutánea
Sensibilidad molecular
¿Nuevos fenotipos de la enfermedad
alérgica?

32. 50% alergenos de plantas
Superfamilia
prolaminas
Profilinas
Superfamilia
cupinas
Proteínas
relacionadas Bet v-1
Cacahuate (Arachis hipogaea)
Ara h 1
Ara h 3
Ara h 2
Ara h 6
Ara h 7
Ara h 9
Ara h 5
Ara h 4
Ara h 3
Ara h 8
Oleosinas Defensinas
Ara h 12
Ara h 13
Ara h 10
Ara h 11

33. Curr Allergy Asthma Rep (2014) 14:429
Trímero Ara h 1 Hexámero Ara h 3
ALERGENOS MAYORES
( > 50% RECONOCIMIENTO DEL SUERO EN POBLACIÓN ALÉRGICA)
Ara h 5 Ara h 8
Ara h 2

34. Diferencias entre IgE vs IgG
Epitopes IgE tienen mayor reactividad
cruzada
Prioridad a ciertas superficies.
Epitopes se agrupan en ciertas regiones.
Paratopos de IgE son más flexibles (sitio
unión al Epítope).
Reactividad cruzada puede ser
clínicamente relevante o irrelevante
(ELISA, RAST, IMMULITE, IMMUNOCAP,
PRUEBAS EN PIEL) FRECUENTE
ENCONTRAR POLISENSIBILIZADOS
50% pacientes alérgicos al cacahuate tienen
reactividad a otras leguminosas.
5% son clínicamente relevantes.
Especial importancia la Historia Clínica y las
pruebas de reto.
2005 se sabía Ara h 1 tenia reactividad cruzada
con Ara h 2 (empírico).
Jug r 2 ( nuez nogal) proteína tipo vicilina cruza
Ara h2.

35. Modificaciones moleculares a los alérgenos de cacahuate.
No enzimáticas
Enzimáticas
Glicosilación
Glicoepítopes o CCDs
(Determinantes de carbohidratos de reacción cruzada)
Xilosa
Anillo 3 similar fucosa
Reactividad cruzada entre plantas e
insectos
Ara h 1
IgE antiglicano (CCD)
IgG
Síntomas!!!
Protección
Reacción Maillard
Productos finales de glicación avanzada
(AGEs)
10 plegamientos!!!!
Mayor susceptibilidad a la producción de AGEs son:
Ara h 1
Ara h 3

36. Ubicuidad de la respuesta alérgica
Estimulación de receptores similares a productos
finales de glicación avanzada (RAGE)
TH2
Tejidos que muestran RAGE:
 Piel
 Pulmón
Inmunoterapia inyectable con cacahuate cocido
Ara h 1
Ara h 2
Ara h 3
Ara h 5
Ara h 8
*Raro consumo del alimento crudo
IgE específica
Reacción Maillard

37. Enfermedad muy severa
Enfermedad poco severa
IgG 4 Caseína
Bos d 8 (caseína)
Extracto completo de Leche
Ara h 2 (cacahuate) *Mayor reacción e incremento
en reactividad cruzada clínicamente relevante
Ara h1 Ara h 3 (cacahuate) *Incrementa el riesgo de ANAFILAXIA
Gal d 1 Incrementa riesgo de reacciones
Gal d 2 Gal d 3 menor riesgo al consumo
huevo cocido

38. POTENCIA
Almacenamiento
(Temperatura)
Estandarización
Estabilización
 Liofilizados
 Glicerinados
Naturaleza del
alérgeno
Proteasas
Dilución
ALERGENOS PARA PRUEBAS CUTÁNEAS
Fisicoquímicas
Adherencia
Estabilidad
Amortiguadores
Solubilidad

40. • 4 AÑOS 1 MES
• 3 AÑOS CON RINITIS/ASMA/ECCEMA
• TALLA BAJA (100 cm) PC<5
• 6 meses con ciclosporina (5 mg/Kg/d) se
suspende por reducciòn dep.creatinina
• Prednisona 1mg/kg/d
• Zafirlukast 20mg/dia
• Difenhidramina 5 ml cada 6 hrs
• Loratadadina 10 mg/día
• SCORE AD: 89
• TRAK: 20
• Bh 2300 eos/mmc
• IgE: 6956 UI/ml
20

42. www.allergen.org
www.allergome.org
http://www.meduniwien.ac.at/allergens/allfam/
¿Quieres conocer más de moléculas
que producen alergia?

43. Conclusiones
Enfermedad alérgica
(Clínica)
Diagnóstico
Método directo
Historia clínica
Exploración
Reto directo
Método indirecto
Pruebas alergia
Cutáneas intradérmicas
Prick test
Serológicas
 Immunolite
 Immunocap
 Microarrays
Validación de la prueba
Problema complejo

44. Conclusiones
¿Las pruebas de alergia molecular están validadas?
Relativas a la muestra:
Relativas al sistema analítico:
Relativas a la interpretación del resultado de la prueba
• Individuales
• Agrupadas
• Composición de la matriz
• Cuantitativa
• Cualitativa
• Físicos
• Químicos
• Técnicos
• Factores inherentes a la muestra ( sexo, raza, edad, estado nutricional,
embarazo, capacidad de respuesta inmune
• Costos
• Sensibilidad
• Especificidad
• Valor predictivo positivo
• Valor predictivo negativo

46. “LA ALERGOLOGÍA ES UNA CIENCIA QUE SE PRACTICA
COMO SI FUERA RELIGIÓN, COMO CIENCIA PUEDES
TENER TONELADAS DE EVIDENCIA, SIN EMBARGO
DEBES DUDAR DE LO QUE VEZ; Y EN MUCHOS CASOS
NO TIENES EVIDENCIA, AÚN ASI CREES LO QUE VEZ.”
Pensamiento modificado de Carl Sagan
¡GRACIAS!