Métodos

Imunologia Clínica
Faculdade Dom Bosco

Testes sorológicos
Professor: Vitor Yuzo Obara
vitorobara@hotmail.com

Nesta aula veremos:

Como a interação entre antígeno e anticorpo
podem promover o diagnóstico de doenças?
Quais são as condições para ocorrer este tipo de
reação?
Quais são os métodos mais comumente
empregados em laboratórios de Análises
Clínicas?
Quais técnicas podem ser automatizadas?

1 CARACTERÍSTICAS GERAIS DA
REAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO
Ligantes biológicos baseados entre afinidades
entre as moléculas;
Reconhecimento específico;
Variedade de métodos;
Detecção de antígenos e anticorpos;
Sensibilidade do teste potencializada;
Detecção de moléculas pequenas a moléculas
complexas.

1.1 Características do Antígeno

Presença de epítopos;
Induzir a produção de anticorpos
correspondentes;

Epítopos:
Sequências de aminoácidos em proteínas;
Estruturas proteicas de alta dimensão.

1.2 Características do Anticorpo
Imunoglobulina, proteína plasmática;
Produzidos em resposta a estímulos antigênicos;
Moléculas funcionais e heterogêneas que
ligam aos antígenos através do sítio
combinatório;
5 classes: IgM, IgG, IgA, IgD e IgE.
Duas porções: Cadeia pesada (porção
constante) e cadeias leves λ ou κ (porção
hipervariável – se liga ao antígeno).

1.2.1 Anticorpos policlonais

Obtido pela imunização com antígeno que
apresenta vários epítopos;
Vários clones de linfócitos B;
Anticorpos apresentam heterogeneidade;
Alta avidez, comparada com anticorpo
monoclonal, porém mais interferentes.

1.2.2 Anticorpos monoclonais

Anticorpos obtidos através de um único clone;
Fusão celular entre uma célula B normal produtor
de anticorpo e uma de linhagem de mieloma
(câncer de linfócito B) - Hibridoma;
Não reconhecem uma molécula inteira, apenas
um único epítopo;
Reatividade cruzada com outros antígenos
(mesma sequência de aminoácidos,
carboidratos e lipídeos)

1.2.2.3 Vantagens e limitações do
anticorpo monoclonal
Vantagens: Limitações:
Reagente bem definido; Reatividade insuficiente
Produção ilimitada de na precipitação ou
reagente homogêneo; aglutinação (formação
de um complexo de
Podem ser preparados ligação fraca);
pela imunização com
um antígeno não- Um único anticorpo
purificado. monoclonal pode ser
insuficiente para
caracterização
imunoquímica.

1.3 Produção de anticorpos pela
tecnologia Recombinante

1.4 Cinética da Reação Ag-Ac

Lei do equilíbrio:
K1
Ag + Ac AgAc
K2

Ag = Antígeno livre
Ac = Anticorpo livre
AgAc = Antígeno ligado ao anticorpo
K1 = Constante de Associação
K2 = Constante de Dissociação

1.4 Cinética da Reação Ag-Ac

Taxa de formação do complexo AgAc = K1
[Ag][Ac]-K2[AgAc]
Se em equilíbrio, a taxa é nula:
K1 [AgAc]
Ka (Constante de afinidade)
K2 [Ag][Ac]

AVIDEZ

1.5 Fatores de Interferência

Constante de associação (Ka) do reagente;
Intensidade do sinal dos marcadores;
↓ razão sinal de detecção/ruído de fundo (reação
inespecífica ou próprio sinal);

1.6 Fase sólida

Suporte para ocorrer separação do imunocomplexo
(AgAc) de componentes restantes livres;

Partículas de gel produzidas em agarose,
poliacrilamida, pérolas de plástico, placas de
micro titulação em poliestireno, partículas de
óxido de ferro, eritrócitos, látex.

2 CLASSES DE IMUNOENSAIOS

Precipitação;
Aglutinação;
Líticos;
Radioimunoensaio (RIE);
Enzimáticos (EIE);
Fluorescentes (IF);
Quimioluminescentes.

2.1 Precipitação
Fenômeno de
pró-zona

Reação entre Ag e Ac resultando em um complexo
grande, visível a olho nu;
Depende das [ ] relativas dos reagentes, Tpt, pH,
força iônica do meio, avidez dos Ac;
Ponto de equivalência: [Ag] = [Ac] → Precipitação
máxima.
Curva de precipitação (Heindelberger e Kendall)
Imunodifusão.

2.1 Precipitação
Amostra do Antígeno de doença a ser
paciente pesquisada
(contém Ac)

Y YYY
Y Y Y

YY Y Y
Y A A A

A
Teste de precipitação
Antígeno: CandidinaA
A
A A
A A
A A A A A

2.1 Precipitação

Ac do Ag
pc

Ag = Antígeno
= Anticorpo

2.1 Precipitação
Ag
Ag Ag

Ag Ag

Ag
Ag
Ag
Ag Ag
Ag
Ag
Ag
Ag Ag
Ag Ag

Ag Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag

2.1 Precipitação

Ac do Ag
pc

Ponto de
equivalênci
a:
[Ac]=[Ag]

2.1 Precipitação

Ag
Ag
Ag

Ag
Ag
Ag Ag Ag Ag
Ag
Ag
Ag Ag
Ag Ag
Ag Ag Ag
Ag Ag Ag

Ag Ag Ag

Ag
Ag Ag
Ag

2.2 Aglutinação

Reação que resulta em agregados visíveis =
resultados da interação (Ac)-(Ag-Partículas
insolúveis);
Dois estágios (simultâneos): I – mistura do Ac (soro)
com as partículas sensibilizadas. II – Ac
estabelece ponte entre as partículas;
Fase sólida pode conter o elemento antigênico
(Aglutinação direta) ou sofrer sensibilização
(Aglutinação indireta).

2.2 Aglutinação

Teste de Aglutinação Direta: Tipagem do grupo ABO
e Rh;
Teste de inibição da hemaglutinação: Ac contra os vírus
da Rubéola, Sarampo, Influenza e outros que
promovem a hemaglutinação. Não diferencia IgG e IgM.
Testes de Aglutinação Indireta: Partículas podem ser
sensibilizadas através de adsorção de Ag solúveis
ou por conjugação.
Teste de hemaglutinação passiva, teste de aglutinação
do látex e teste de aglutinação de cristais de colesterol
(VDRL)

2.2.1 VDRL

Veneral Disease Research Laboratory
Cristais de colesterol sensibilizados com lecitina e
cardiolipina (lipídios);
Detecção de anticorpos anti lipídios liberados no
início da infecção pelas células lesadas e do
próprio treponema.
Teste positivo: Presença de flocos visíveis
macroscopicamente em contraste com fundo
escuro.

2.2.1 VDRL
Amostra do Cristal de colesterol
paciente sensibilizado com
(contém Ac) Lecitina e Cardiolipina

Y YYY
Y Y Y

YY Y Y
Y A A A

A
Teste de Aglutinação
VDRL A
A
A A
A A
A A A A A

2.2.1 VDRL
Amostra do Antígeno de doença a ser
paciente pesquisada
(contém Ac)

Y YYY
Y Y Y

YY Y Y
Y A
A A

A
VDRL A
A
A A
A A
A A A A A

2.2.1 VDRL
Antígeno de doença a ser
pesquisada

A A A

A
VDRL A
A Ag
A A
A A
A A A A A

Fase sólida:
Cristal de Ag
Colesterol

2.3 Ensaios Líticos
Teste de fixação do complemento:
Ligação entre Ag-Ac promove a fixação do complemento,
podendo ser empregado na detecção de Ag e/ou Ac;
Duas etapas: I – Incubação do Ag com Ac (ativação do
complemento); II – Adição do indicador da reação
(hemácia de carneiro sensibilizadas com hemolisina).
Ensaio da Neutralização da Hemólise:
Inibição de toxinas antigênicas e hemolíticas de
Estreptococos ß-hemolíticos.
Duas etapas: I – Incubação do Ac (soro do pc) com
hemolisina específica. II – Hemácias do grupo O.

2.4 Imunofluorescência (IF)

Capacidade de Ac ligarem-se a fluorocromos sem
perder atividade específica com Ag;
Fluorocromos: Substâncias que se excitam em luz de alta
energia e, instantaneamente, emitem luz visível.
Intensidade de luz depende de pH, sendo ótimo em
8,5;
Uso de corantes podem diminuir a coloração de
fundo e melhorar o contraste (Azul de Evans ou
vermelho do Congo);
Leitura dependente de Microscópio de flourescência.


Fase sólida = Lâmina

Amostra do
paciente
(contém Ac)

Y Y
Y Y
Y
Y Y
Y Y

F
C

F
C

F
C

2.5 Radioimunoensaio (RIE)

Método de alta sensibilidade (detecção na ordem de
ng - 10-9g - ou pg -10-12g), mesmo em
preparações não-purificadas, preciso e rápido;
↑ custo, ↓ vida média dos reagentes, ↑ risco
operacional;
Reagente marcado com marcadores radioativos
quantifica Ac ou Ag não marcado (soro).

2.6 Ensaio enzimático

Método quantitativo monitorada pela atividade
enzimática;
Reagentes mais estáveis que RIE, sem exigência de
se trabalhar com radioisótopos, pode ser realizada
de forma manual ou automatizada;
Sistema de detecção: leituras visuais a fotométricas.

2.6 Ensaio enzimático

Aumento de limiar de sensibilidade por não
necessitar de uma segunda etapa (precipitar,
aglutinar ou lisar células);
Enzima: alta atividade específica, produto da reação
enzimática deve ser estável e de fácil
quantificação, ser estável, facilmente obtida de
forma purificada, ligar-se a antígenos e anticorpos
diversos sem perder sua atividade (formação do
conjugado), ter preço acessível.
Peroxidade, fosfatase alcalina.

2.6.1 ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay)
Princípio: Imobilização de um dos reagentes (Ag ou
Ac) em uma fase sólida com outro reagente
conjugado a uma enzima (atividade enzimática e
imunológica preservada);

E
E

2.6.1 ELISA (Enzyme-linked
Immunosorbent Assay)
Objetivo:
Quantificação de Ag, quando bem definidos, requer uma
curva de calibração;
Verificação da presença de Ac, maior complexidade na
mensuração pela sua heterogeneidade de afinidade e
propriedades físico-químicas, geralmente afinidade
aumenta em amostras diluídas;
Cut-off: separa numericamente valores positivos de
negativos.

2.6.1.1 Tipos de ELISA

Pesquisa de Antígenos:
Sanduíche (Captura);
Competição com antígeno marcado.
Pesquisa de Anticorpos:
Indireto (Não competitivo);
Direto (Competitivo);
Captura de IgM.
Imunoensaio Homogêneo: Immunoblotting

2.6.1.1.1 Tipos de ELISA:
Sanduíche
Fase sólida sensibilizada
com Ac;
ELISA tipo Sanduíche Amostra (Ag);
Ac marcado (conjugado);
> [Ag da amostra],
> ligação aos Ac,

>densidade de leitura;

2.6.1.1.2 Tipos de ELISA:
Competição com Ag marcado
Fase sólida sensibilizada
com Ac;
Amostra (Ag) e Ag
marcado (conjugado);
> [Ag da amostra],
> ligação aos Ac,
< ligação com o
conjugado

<densidade de leitura.

2.6.1.1.3 Tipos de ELISA: Indireto
(Não competitivo)

2.6.1.1.4 Tipos de ELISA: Direto
ELISA direto (competitivo)

2.6.1.1.5 Tipos de ELISA: Captura
de IgM
Captura IgM

2.6.1.1 Tipos de ELISA:
Homogêneo (Immunoblotting)

Separação dos Ag (pc) por eletroforese;
Imersão do suporte em Ac específicos;
Revelação: coloca-se esta membrana em
solução com anti-Ig ligado a uma enzima e um
cromógeno (precipitado colorido)

2.7 Ensaios quimioluminescentes

Obtenção de energia luminosa a partir de uma
reação química;
Dissociação de componentes intermediários →
excitação eletrônica → retorno ao estado original
de energia → LUZ;
≠ Imunofluorescência!
>limite de detecção que o ELISA→10-18até10-21 M
< custo relativo (baixo consumo de reagentes)
Rapidez.

2.7.1 Enzimaimunoensaio
quimioluminescente
Princípio: Detecção da reação Ag-Ac utilizando uma
enzima e uma molécula sintetizada que atuará
como substrato para a enzima através de emissão
de luz;
Moléculas quimioluminescentes: Luminol, derivados
de acridina, éster de fenantridina, indol e
dioxetano, fosfatase alcalina, peroxidase, etc.
Mais utilizado em métodos semi- ou totalmente
automatizados.

3 TÉCNICAS EMPREGADAS NA
AUTOMAÇÃO
Nefelometria;
Turbidimetria;
Imunoensaio Quimioluminescente;
Imunoensaio Fluorescente;
Citometria de Fluxo.

3.1 Nefelometria

Medida do espalhamento de uma luz incidente,
devido a partículas (imunocomplexo Ag-Ac) em
suspensão, para um determinado ângulo;
Esse fenômeno é proporcional ao tamanho, forma e
concentração das partículas insolúveis formadas;
Quantificar as reações de precipitação: ↑
Precipitação → espalhamento e reflexão da luz →
↓ Transmitância da luz;
O anti-soro deve ser oticamente límpido, com índice
de refração conhecida.

3.2 Turbidimetria

Medida da diminuição de intensidade de luz emitida
devido a partículas que absorverão, refletirão ou
espalharão a luz;
Luz emitida deve ser próximo ao UV (290-410nm)
pois é a região que os imunocomplexos mais
absorvem luz;
A mistura dos reagentes deve ser rápida e completa,
para evitar a formação de áreas mais
concentradas → analisador com agitação
constante.

3.2 Turbidimetria vs. Nefelometria

3.3 Imunoensaio
Quimioluminescente
Medição de luz emitida pode ser chamada de
luminometria, desse modo, os aparelhos que
realizam a leitura de intensidade de luz chamam-
se luminômetros;
Conjugado (reagente marcado) e os amplificadores
da reação são próprios dos fabricantes, p.ex.
ImmuliteTM (Siemens) emprega a enzima fosfatase
alcalina e como substrato fosfato de adamantil 1,2-
dioxetano.

3.4 Imunoensaio Fluorescente

Detecção e quantificação de Ag e Ac utilizando
conjugados fluorescentes cuja emissão de luz é
lida por um fluorômetro;
Fluoróforos são compostos em estrutura de anel
benzênico ( ) que absorvem a luz de alta
energia (UV) e promove ressonência entre os
elétrons, quando estes elétrons retornam a uma
camada de menor energia (estado inicial), ocorre
emissão de luz visível.

3.5 Citometria de Fluxo

Princípio: Cito (célula)+metria (medida) + fluxo
(movimento)

FOCO DO LASER

CONVERGÊNCIA
HIDRODINÂMICA

3.5 Citometria de Fluxo

Marcação de subpopulações de células com Ac
ligados a conjugados específicos e diferentes para
cada tipo celular.

3.5.1 Detectores de dispersão
de luz em ângulo de 90º

Laser

FALS Sensor

Detector 90LS

3.5.2 Detectores de fluorescência

FALS Sensor

Freq
Fluorescence

Fluorescence detector
(PMT3, PMT4 etc.)

3.5.2 Detectores de fluorescência

4 Testes rápidos

Método dipstick – Ensaios imunocromatográficos:
Busca de Ac (soro) ou Ag (soro, urina, sangue lisado,
fezes, líquidos);
Teste qualitativo simples, rápido, fácil e barato, além de
fácil interpretação e os controles positivos e negativos
já estão contidos;
Método de impregnação, semelhante ao Western blot;
Reagente de detecção pode ser marcado com corante
coloidal ou enzimas.

Considerações
Método Fase sólida Leitura Conjugado Revelador
Precipitação Não Leitura direta NA NA
Aglutinação Sim Aglutinação NA NA
(formação de
rede)
Ensaios líticos Sim Hemólise NA NA
IF Sim Emissão de luz Ac-FC UV
(excitação por
emissão de UV)
RIE Sim Emissão de um Ac-I 125 Substrato
sinal radioativo
ELISA Sim Mudança de cor Ac-E Substrato
EQ Sim Emissão de luz Ac-composto Substrato
(Reação luminescente
química)
Nefelometria Não Quantidade de NA NA
luz desviada
Turbidimetria Não Diminuição da NA NA
intensidade de
luz emitida

Referências

SANCHEZ, M.C.A. Testes sorológicos. In:
FERREIRA, A.W.; ÁVILA, S.L.M. Diagnóstico
laboratorial das principais doenças
infecciosas e auto-imunes. 2.ed. [Reimp] Rio
de Janeiro: Gunabara Koogan, 2011. Cap. 2
pp.9-48.
ASHIHARA, Y. et al. Imunoensaios e
imunouímica. In: HENRY, J.B. Diagnóstico
Clínico e tratamento por métodos
laboratoriais. 20. ed. São Paulo: Manole,
2008. Cap. 35. pp.952-981.

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