ООО «Тонкие системные технологии»
www.fine-systems.tech
г. Москва
2018 г.
Устройство для электропорации клеток на основе
микрофлюидных чипов

2
Как читать документ
Структура
Документ объемный. Для упрощения работы основные положения
каждой части вынесены после слайда с заголовком. После
основных положений идет описание более подробно
Версия 1.0
Изменения
Процесс разработки документа носит итеративный характер. По
мере получения новой информации или создания новой он
дополняется

3
Оглавление
Общее описание проекта
Цели проекта
Задачи проекта
Зачем это нужно
Описание технологий
Как делают сейчас
Ключевая технология
Предлагаемая технология
Требования
Дерево технологии
Версия 1.0

4
Общее описание проекта
Версия 1.0

5
Общее описание проекта
Общее описание проекта «устройство для электропорации клеток
на основе микрофлюидных чипов»
Проект «устройство для электропорации клеток на основе
микрофлюидных чипов» направлен на создание устройства для
проведение процесса электропорации живых клеток в
микрофлюидных чипах.
На входе в устройство поступают живые клетки и внедряемые
соединение (например, ДНК).
На выход устройства поступают живые клетки с внедренным
соединением (процесс электропорации прошел успешно), живые
клетки и соединение, которые не удалось подвергнуть процессу
электропорации
Версия 1.0

6
Цели проекта
Версия 1.0

7
Цели проекта
Цели проекта
Целью проекта является разработка устройства для
электропорации клеток в микрофлюидных чипах. Включая:
- Разработку устройства для электропорации клеток в
микрофлюидных чипах для лабораторных исследований;
- Разработку прототипа устройства для электропорации клеток
в микрофлюидных чипах для прохождения необходимых
регистрационных процедур, подготовке к коммерциализации;
- Разработку серийной версии устройства для электропорации
клеток в микрофлюидных чипах, запуск производства,
коммерциализация
Версия 1.0

8
Задачи проекта
Версия 1.0

9
Задачи проекта
Задачи проекта
Задачи проекта на стадии разработки устройства для
электропорации клеток в микрофлюидных чипах для лабораторных
исследований включают:
- Разработать микрофлюидный чип для электропорации клеток;
- Разработать подсистему подготовки ввода клеток,
соединений для электропорации, буферных растворов;
- Разработать подсистему смешения клеток, соединений для
электропорации, буферных растворов;
- Разработать подсистему промывки (под вопросом) для
многоразового использования;
- Разработать одноразовые расходные компоненты (трубки,
ёмкости для смешения и подобное
Версия 1.0

10
Зачем это нужно
Версия 1.0

11
Зачем это нужно
Зачем это нужно
Для многих задач биотехнологии необходимо каким-либо образом
ввести генетический материал (ДНК, РНК и их формы) в живые
клетки.
Это необходимо для модификации клеток для производства каких
либо соединений. В основном белковых, например, антител. Или
для изменения работы клеток нужным образом.
Обычно, внедрить какой-либо генетических материал в живые
клетки, например, смешением ДНК со суспензией клеток нельзя.
Для внедрения генетического материала в клетки используют
различные химические, физические, биотехнологические
механизмы. Все они имеют свои достоинства, недостатки и
границы применения.
Одним из перспективных и универсальных методов внедрения
генетического материала в живые клетки in vitro является
метод электротрансфера (электропереноса) генов на основе
процесса электропорации. Метод работает на большинстве живых
клеток. Например, он работает для клеток млекопитающих,
растений, грибов (дрожжи), бактерий.
Версия 1.0

12
Описание технологий
Версия 1.0

13
Описание технологий
Электроперенос/электротрансфер генов (gene electrotransfer)
посредством электропорации (electroporation) или просто
электропорация (как название для методики введения
генетического материала в клетки)
Процесс Электроперенос генов или электропорации основан на
следующих отдельных технологиях:
- Технология электрофореза;
- Технология электропорации
Версия 1.0

14
Описание технологий
Технология электрофореза нуклеиновых кислот
Технология электрофореза нуклеиновых кислот (ДНК, РНК и
подобные) основана на том, что эти соединения или их
комплексы в большинстве своём имеют отрицательный заряд.
Т.е. в электрическом поле при определенной разнице
потенциалов между электродами и определенном составе среды
эти молекулы могу преодолеть сопротивление среды и двигаться
в направлении положительно заряженного электрода (анода).
Версия 1.0
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
--
-
-
-
-
-
+ Анод
Катод -

15
Описание технологий
Технология электропорации клеток
Процесс электропорации клеточных мембран основан на том, что в
электрическом поле мембрана клетки (изначально имеет
отрицательный заряд на поверхности) начинает работать как
конденсатор. За счет миграции отрицательно заряженных частиц в
растворе (клетки находятся в растворе) к мембране клетки на
внешней стороне мембраны накапливается отрицательный заряд.
Это приводит к разрыву мембраны и формированию проводящей
поры, по которой отрицательно заряженные молекулы проникают
внутрь клетки. При этом этот процесс при нормальном течении не
является диэлектрическим пробоем и в определенном диапазоне
условий после снятия напряжения структура мембраны
восстанавливается. Поры образуются только со стороны катода.
Версия 1.0
+ Анод
Катод -

16
Описание технологий
Электроперенос
Таким образом, под действием электрофореза нуклеиновые кислоты
с отрицательным зарядом переносятся к электропорированным
клеткам. Под действием электрического поля они «пропихиваются»
через поры (размер пор может быть меньше молекул нуклеиновых
кислот) и таким образом попадают за клеточную мембрану. Далее
они должны попасть в ядро клетки для включения в геном клетки.
С определённой вероятностью это происходит.
Клетки, как и нуклеиновые кислоты движутся в электрическом
поле, но медленнее из-за большего сопротивления среды.
Версия 1.0
+ Анод
Катод -

17
Описание технологий
Факторы влияющие на процесс электропереноса нуклеиновых кислот
- Качество исходной суспензии клеток;
- Качество «раствора» нуклеиновых кислот. Для разных типов
клеток нуклеиновые кислоты могут быть приготовлены в разных
видах (например, для бактерий используется плазмидное –
кольцевое ДНК);
- Качество используемых буферных растворов
Течение процесса электропереноса нуклеиновых кислот как и
другие подобные процессы сильно зависят от наличия в растворе
других носителей заряда и их концентрации. Так например,
высокие концентрации солей могут привести к электрохимическим
и другим реакция и привести к диэлектрическим пробоям клеток
(с ионизацией), выделению различных соединений, слишком
быстрому течению процесса и т.д.
- Конструкции и условия ячейки для электропереноса;
Т.к. процесс сильно зависит от большого числа факторов и не
является линейным, то сам процесс электропереноса успешно
протекает в области с очень небольшим объёмом. Часть клеток не
подвергается процессу, часть подвергается разрушению по
различным механизма.
Версия 1.0

18
Описание технологий
Факторы влияющие на процесс электропереноса нуклеиновых кислот
Кроме общих факторов оказывают влияние и сами условия
процесса:
- Напряжение. Для процесса электропорации требуется высокое
напряжение (более 1000 V);
- Длительность воздействия. Сам процесс может протекать
секунды или доли секунды. Длительное воздействие напряжения
может привести к разрушению всех клеток из-за появления
больших пор, неспособных восстановиться, диэлектрических
пробоев, перегрева и т.д.;
- Температура процесса;
- Характер процесса. Могут быть использованы разные режимы.
Один или несколько импульсов разной интенсивностью,
предварительные импульсы, предварительный электрофорез и
т.д.
Версия 1.0

19
Описание технологий
Схема процессов
Версия 1.0
Суспензия клеток
Материал для
внедрения
Буферные растворы
Смешение Электропорация
Вывод суспензии
Выделение измененных
клеток и последующая
их культивация
Процесс электропереноса успешно завершается только для
небольшого количества клеток, не во всех клетках
внедренный генетический материал попадает в ядро клетки
и встраивается в геном.
Т.е. для каждой стадии есть некоторая вероятность
успешного протекания процесса.
Небольшая часть модифицированных клеток отделяется от
основной суспензии (различные методы, от выращивания в
средах с определенными соединениями устойчивость к
которым была внесена, до разделения на магнитных
полимерных микросферах с антителами на поверхности).

20
Как делают сейчас
Версия 1.0

21
Как делают сейчас
Устройства для электропорации
Электротрансфер генетического материала (электропорация)
начали использовать в 80х годах XX века.
На данный момент на рынке присутствуют:
- несколько десятков устройств для проведения
электропорации в кюветах;
- устройства для электропорации в шприцах и носиках
пипеток, зондах
- новое устройство для проведения электропорации в
микрофлюидных чипах
Здесь небольшой обзор по разным типам устройств для
электропорации
https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/117890-What-
to-Look-for-in-an-Electroporator/
https://www.biocompare.com/Immunochemicals/11987-
Electroporation-Cell-Fusion-
Instruments/?search=electroporation
Версия 1.0

22
Как делают сейчас
Устройства для электропорации в кюветах
Стандартный формат кювет для работы с аналитическим
оборудованием. Представляет собой просто сосуд в котором
находится два электрода. Суспензию клеток помещают между
ними
Существует большое число разновидностей по объему (разное
расстояние между электродами). Для некоторых устройств есть
взаимозаменяемые кюветы
Далее проводится процесс электропорации. Из минусов такого
подхода – довольно большой объём с неоднородным полем,
остаточный объём при заборе суспензии (загрязнение кюветы),
перегреваются при работе
Версия 1.0

23
Как делают сейчас
Устройства для электропорации в шприцах и носиках пипеток,
зондах
Относительно новый формат устройств. Представляют по сути
аналогично два электрода для создания электрического поля
между ними и цилиндрической камерой малого диаметра. Объём
регулируется по высоте.
Кювета вместе с одним из электродов является расходным
материалом.
Нет паразитного объема. Лучше охлаждается. Имеет потенциал
для автоматизации (параллельные процессы).
По сути в противовес кюветам – максимальное увеличение
расстояния между электродами и уменьшение их площади.
Версия 1.0

24
Как делают сейчас
Общее описание
По сути устройства для электропорации представляют собой
кювету разной геометрии с двумя электродами и устройство для
создания напряжения нужной величины по определенной
программе (время, профиль импульса и т.д.). Дополнительно
различные конструктивные особенности позволяют решить
проблемы перегрева, неоднородности поля и т.д.
Основную трудоёмкость составляют протоколы работы. Т.е. для
разных типов клеток требуются свои режимы.
Для этого устройство для генерации напряжения может быть или
полностью настраиваемым, или иметь протоколы работы,
заложенные производителем.
Версия 1.0

25
Как делают сейчас
Устройство для проведения электропорации в микрофлюидных
чипах
При все относительной простоте технологии возникла
потребность в её автоматизации (малые обрабатываемые объемы,
большая доля ручных операций и т.д.)
Компания Miltenyi Biotec выпустила модуль для электропорации
к своей системе для культивирования и отделения
модифицированных клеток CliniMACS Prodigy.
Система автоматически проводит смешение клеточной суспензии
с генетическим материалом, проводит процесс электропорации в
микрофлюидном чипе
По сути микрофлюидный чип в данном устройстве мало
отличается по конструкции от кювет наиболее распространённых
устройств. Электроды большой площади и камера для
электропорации между ними с небольшим расстоянием между
электродами
Версия 1.0

26
Ключевая технология
Версия 1.0

27
Ключевая технология
Ключевая технология
В качестве ключевой технологии для данного устройства
предлагается технология микрофлюидных чипов.
В данном контексте это могут быть устройства длительного
времени работы (работа с одним типом клеток или пригодные
для очистки), так и одноразовые устройства (работа с
определённым объемом и последующая замена на новые).
Плюсами такого подхода являются:
- Возможность создания расходных материалов на базе
микрофлюидных чипов;
- Воспроизводимость (чипы одинаковые);
- Возможность автоматизации работы с чипами
- Возможность использования разнообразных конфигураций
чипов для разных режимов работы
Версия 1.0

28
Ключевая технология
Микрофлюидные чипы
В общем виде технология микрофлюидики описывается как
технология работы с малыми объемами жидкости в различных
системах (уровень микролитров и меньше). Это перемещение,
смешение, разделение и обработка жидкостей различными
способами в малых объёмах, наблюдение за процессами.
Одним из вариантов технологии являются микрофлюидные чипы.
Это капилляры в каком-либо материале. Например, пластике,
кремнии, керамике, металле и т.д. Чипы могут быть созданы по
различным технологиям, например, литье в матрицы,
механическая обработка и составление многослойных
конструкций, технологии литографии на полимерах, кремниевая
литография и т.д.
Для работы с микрофлюидными чипами в большинстве случаев
нужны внешние устройства для подвода жидкостей, их
перемещения, удаления и т.д. (различные типы насосов),
нагревания и охлаждения. Некоторые устройства можно
разместить в самом чипе, например, электроды, датчики
подобное.
Версия 1.0

29
Ключевая технология
Пример чипа
На рисунке представлен один из вариантов возможной
конструкции микрофлюидного чипа для электропорации.
Изображения носят описательный характер и предназначены
только для демонстрации. Реальная конструкция может
значительно отличаться от представленной на изображениях.
Версия 1.0
Ввод жидкости Вывод жидкости
Капилляры
Камеры для
электропорации
Электроды

30
Ключевая технология
Версия 1.0

31
Версия 1.0
3D модель чипа
Отображается в новых версиях Power Point для настольных компьютеров.
В режиме презентации – вращение по щелчку.
В режиме редактирования при наведении и щелчку – вращение в ручном
режиме

32
Версия 1.0
3D модель чипа
Отображается в новых версиях Power Point для настольных компьютеров.
В режиме презентации – вращение по щелчку.
В режиме редактирования при наведении и щелчку – вращение в ручном
режиме

33
Предлагаемая технология
Версия 1.0

34
Предлагаемая технология
Описание процесса
В общем виде процесс электропереноса генетического материала
для разрабатываемого устройства выглядит следующим образом:
1. К системе подключаются ёмкости/пакеты со суспензией
клеток, генетическим материалом, буферными растворами;
2. С помощью насоса необходимые объёмы суспензии, раствора
генетического материала, буферного раствора перекачиваются в
ёмкость для смешения;
3. Клеточная суспензия, раствор генетического материала,
буферный раствор смешиваются;
4. Насосом в отдельную ёмкость перекачивается буферный
раствор;
5. Чип промывается буферным раствором;
6. Готовая смесь перекачивается в микрофлюидный чип;
7. Процесс электропорации;
8. Смесь после электропорации перекачивается или в отдельную
ёмкость или в другой модуль/ёмкость;
9. Повтор на п.5. до исчерпания рабочей смеси
10. Повтор на п.2 до исчерпания рабочих компонентов;
11. Замена расходных материалов (трубок, чипа и т.д.)
Версия 1.0

35
Предлагаемая технология
Схема процесса
Версия 1.0
Суспензия клеток
Материал для
внедрения
Буферные растворы
Перекачивание
Ёмкость для смешения
Перемешивающее
устройство
Ёмкость для буферного
раствора
Перекачивание
Микрофлюидный чип для
электропорации
Ёмкость для готовой
суспензии
Далее в другие модули
Ёмкость для отбора
проб
Перекачивание
Реализация схемы перекачивания растворов может быть организована различными способами.
Это могут быть отдельные насосы на каждой стадии или насосы с многоходовыми клапанами
на каждую стадию и т.д.

36
Предлагаемая технология
Схема рабочей камеры микрофлюидного чипа
Рабочая камера микрофлюидного чипа может быть организована в
общем виде двумя способами:
1. Большая поверхность электродов – малый зазор между ними;
2. Малая поверхность электродов – большой зазор между ними
Версия 1.0
+ Анод
Катод -
Катод - + Анод

37
Предлагаемая технология
Общие составляющие системы
- Флюидная система для перекачивания жидкостей (трубки,
клапаны, насосы);
- Ёмкости для растворов;
- Ёмкости для перемешивания растворов;
- Микрофлюидный чип;
- Устройство для управления напряжением на чипе;
- Устройство для управления флюидной системой;
- Устройство для управления устройствами для перемешивания;
- Термостатирующая система;
- Устройство для управления термостатирующей системой;
- Общее управляющее устройство;
- Несущая конструкция, корпус и т.д.
Версия 1.0

38
Требования к системе
Версия 1.0

39
Требования к системе
Общий перечень требований к системе
Перечень требований пополняется по мере формирования
документа:
- Требования к схеме процесса;
- Требования к стадиям процесса;
- Требования к последовательности операций;
- Требования к стерильности;
- Требования к расходным материалам;
- Требования материалам;
- Требования к термостатированию (рабочая температура,
диапазоны температур в устройстве;
- Требования к протоколам работы;
- Требования к рабочим растворам;
- Требования к исполнению;
- Требования к управляющей электронике;
- Требования к встроенному программному обеспечению;
- Требования к пользовательскому программному обеспечению
- Требования к процессу разработки
- И т.д.
Версия 1.0

40
Дерево технологии
Версия 1.0

41
Дерево технологии
Предлагаемое дерево технологии
1. Модуль электропорации
1.1. Разработка лабораторной версии модуля электропорации;
1.2. Разработка коммерческой версии модуля электропорации
для лабораторных исследований;
1.3. Коммерциализация коммерческой версии модуля
электропорации для лабораторных исследований;
1.4. Наработка протоколов работы для коммерческой версии для
лабораторных исследований;
1.5. Наработка протоколов работы для коммерческой версии для
клиники, запуск процедуры регистрации;
1.6. Разработка коммерческой версии для клиники, процедура
регистрации;
1.7. Коммерциализация коммерческой версии модуля
электропорации для клиники
2. Модуль культивирования клеток
3. Модуль выделения клеток
4. Интеграция модулей
Версия 1.0

42
ООО «Тонкие системные технологии»
г. Москва
2018 г.
Контакты:
ООО «Тонкие системные технологии
Владислав Трошин (CEO)
+7 929 509 44 89
troshin@fine-systems.tech
www.fine-systems.tech
Благодарю за внимание!
Версия 1.0