1. Многоцветный анализ – основныеМногоцветный анализ – основные
принципы и подходыпринципы и подходы
Кудрявцев Игорь ВладимировичКудрявцев Игорь Владимирович**
igorek1981@yandex.ruigorek1981@yandex.ru
Савицкий Валерий Павлович**Савицкий Валерий Павлович**
vsavitski@beckman.comvsavitski@beckman.com
* отдел иммунологии, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН,* отдел иммунологии, ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН,
Санкт-Петербург;Санкт-Петербург;
кафедра цитологии и гистологии, Санкт-Петербургский государственныйкафедра цитологии и гистологии, Санкт-Петербургский государственный
университет;университет;
школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивостокшкола биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток
** ООО "Бекмен Культер", Москва** ООО "Бекмен Культер", Москва
Пушкинские годы, 27 января – 2 февраля 2013 г.Пушкинские годы, 27 января – 2 февраля 2013 г.
2. Для чего нужен многоцветный анализ?
• Оптимален и необходим для онкогематологии –
типирование лейкозов и лимфом
• Повышает информативности
иммунологических исследований:
– большее число комбинаций
– большее число Ag определяется на одной
клетке
– детальная характеристика фенотипа
отдельных клеточных популяций
– анализ как основных, так и малых
популяций по широкому спектру маркеров
•Увеличивает информативность научных
исследований
•Меньше пробирок в панели – экономия времени,
трудозатрат и сопутствующих реагентов!
•Большая пропускная способность проточного
цитометра, экономия «ресурса» прибора
3. Флуорохромы для многоцветного анализа
В настоящее время – более 40 различных флуорохромов; однако
одновременно можно использовать не более 18 флуорохромов даже на
самых «продвинутых» приборах.
5. Новые флуорохромы -
новые требования к подготовке образцов
- работа с антителами должно проводиться в отсутствие прямого
солнечного света;
- инкубация образцов с антителами темноте;
- хранение готовых проб в защищенном от света месте и на холоду
(+4°С); Инкубация в темноте
Инкубация на свету, 15 минут
6. Одноцветные
реагенты
Пятицветные
панели
533
142
600
400
200
0
Новые флуорохромы -
новые требования к подготовке образцов
- использование готовых смесей антител;
- самостоятельная подготовка «коктейлей» антител перед окраской образцов;
- тандемные красители следует вносить в смесь последними, чтобы
минимизировать их облучение светом;
Все это позволяет:
- упростить работу с реагентами;
- сократить время подготовки
проб;
- снизить вероятность ошибок
при внесении антител!!!
Подготовка для анализа 5
пробирок, в каждой – 5
антител, конъюгированных с
5 различными
флуорохромами
7. 405nm
Pacific BluePacific Blue Krome OrangeKrome Orange
488nm
FITCFITC PEPE ECDECD PECy7PECy7PECy5.5PECy5.5
635nm
APC or AF647APC or AF647 APC-AF700APC-AF700 APCCy7 or APC-AF750APCCy7 or APC-AF750
400 500 600 700 800
Итак, 3 лазера и 10 каналов для детекции 10
флуорохромов одновременно…
… КОМПЕНСАЦИЯ!!!
8. Pac
Blue
Kr
Orange
FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC
AF700
APC
AF750
CD25 CD3 CD8 - - CD4 CD3 CD45 - -
Вариант №1.
Минимизировать компенсацию - использовать антитела с
флуорохромами, спектры которых слабо перекрываются
12. Расположение маркеров по каналам:
- для пан-лейкоцитарных, линейных и «ярких» маркеров
используйте фиолетовый лазер;
- для маркеров «популяций интереса» - красный лазер;
- маркеры активации и «маркеры интереса» ставьте на голубой
лазер.
Применяйте тандемные красители с тем расчетом, что тандемы,
содержащие Cy5 / Cy5.5 / Cy7, возбуждаются голубым и красным
лазерами, следовательно, помещайте маркеры со среднем
уровнем экспрессии, а также маркеры малых популяций на
голубой лазер.
Для субпопуляционных/взаимоисключающих маркеров можно
использовать пары: ECD - PC5.5, PC5 - APC, PC5.5 – APCA700,
PC7 - APCA750 или PE - ECD
Многоцветная компенсация – некоторые
частные вопросы:
13. Некоторые рекомендации по подбору
флуорохромов для минимизации многоцветной
компенсации
1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии1. Для детекции антигенов с низким уровнем экспрессии
следует использовать яркие флуорохромы, антигены сследует использовать яркие флуорохромы, антигены с
высоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают совысоким уровнем экспрессии одинаково хорошо работают со
всеми красителямивсеми красителями
2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналы, на которых располагаютсяперекрывающиеся - каналы, на которых располагаются
антигенами с высоким уровнем экспрессииантигенами с высоким уровнем экспрессии
3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние»3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать «соседние»
каналы для ярких «неперекрывающихся» -каналы для ярких «неперекрывающихся» -
взаимоисключающих антигеноввзаимоисключающих антигенов
4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для4. Не рекомендуется использовать соседние каналы для
коэкспрессирующихся антигеновкоэкспрессирующихся антигенов
5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на5. Допускается применение субпопуляционных маркеров на
каналах, сильно «засвечивающих» основные маркеры, НО неканалах, сильно «засвечивающих» основные маркеры, НО не
наоборотнаоборот
14. 1. Для детекции антигенов с низким уровнем1. Для детекции антигенов с низким уровнем
экспрессии следует использовать яркиеэкспрессии следует использовать яркие
флуорохромыфлуорохромы……
CD56-PE P-AKT s473 Alexa 647
CD25-PE CD25-PC7
15. FITCFITC PEPE ECDECD PC5PC5 PECy5.5PECy5.5 PC7PC7
APCAPC Alexa 700Alexa 700 APCAlexa 700APCAlexa 700 APC-H7APC-H7 APCAlexa 750APCAlexa 750
Pacific BluePacific Blue Pacific OrangePacific Orange
CD8
…… антигены с высоким уровнем экспрессииантигены с высоким уровнем экспрессии
одинаково хорошо работают со всемиодинаково хорошо работают со всеми
красителямикрасителями..
16. 2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналыперекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнемс антигенами с высоким уровнем
экспрессииэкспрессии
HLA-DR-PE –
является ли это
оптимальным
выбором?
(CD45 берем по FITC)
17. CD45, конъюгирован с
Pacific Blue.
HLA-DR-FITC
разрешение гораздо
лучше, чем при
использовании HLA-
DR-PE
2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ2. Для исследования слабо представленных антигенов НЕ
следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,следует использовать соседние – «соприкасающиеся»,
перекрывающиеся - каналыперекрывающиеся - каналы с антигенами с высоким уровнемс антигенами с высоким уровнем
экспрессииэкспрессии
18. 3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать3. Разрешается, но не рекомендуется, использовать
«соседние» каналы для ярких неперекрывающихся«соседние» каналы для ярких неперекрывающихся
антигеновантигенов
Mutually excluding antigens serve each other as dump channels
CD4-APC
CD20-APCAF700
CD8-APCAF750
CD4-PacBlue
CD20-ECD
CD8-APCAF700
19. 4. Не рекомендуется использовать соседние каналы4. Не рекомендуется использовать соседние каналы
для ко-экспрессирующихся антигеновдля ко-экспрессирующихся антигенов
PC5,5 на ECD – до 45%
ECD на PC5,5 – до 4%
PE/APCAF750 и
APCAF750/PE –
менее 0,5%
20. 5. Допускается применение субпопуляционных5. Допускается применение субпопуляционных
маркеров на каналах, сильно «засвечивающих»маркеров на каналах, сильно «засвечивающих»
основные маркеры, НО не наоборотосновные маркеры, НО не наоборот
21. Настройка прибора при многоцветном анализе
• Настройка напряжения. Для настройки напряжения используйте
соответствующие изотипические контроли или образцы, окрашенные
антителами по отдельности.
• Компенсация. Для настройки:
– используйте CD45, конъюгированные с различными
флуорохромами для автоматической настройки компенсации;
– используйте образны, окрашенные каждым из антител по
отдельности;
– для проверки правильности настройки компенсации используйте
FMO-подход (fluorescence-minus-one);
при переходе на другой лот антител проверяйте компенсацию!
Процедуру настройки рекомендуется проводить с использованием всех
перечисленных выше подходов. После настройки и проверки –
НИЧЕГО НЕ МЕНЯЙТЕ!!!!
23. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
-FS vs. SS – выделение популяций
лимфоцитов, моноцитов
и гранулоцитов (гистограмма “Ungated”
- отображены все популяции лейкоцитов)
-CD45 vs. SS – выделение
популяции лимфоцитов
(гистограмма “Ungated” –
отображены все популяции
лейкоцитов)
24. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция vs. SS» – контроль
корректности выставленного напряжения по каждому из каналов
флуоресценции (все гистограммы “Ungated” – все популяции лейкоцитов)
25. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
-CD45 vs. SS и FS vs. SS –
выделение популяции лимфоцитов;
удаление из зоны анализа
разрушенных и слипшихся клеток
При анализе «редких» популяций клеток также рекомендуется удалять из зоны
анализа дуплеты клеток (соотношение пикового и интегрального сигналов,
например) и использовать по одному из каналов флуоресценции какой-либо
краситель для определения жизнеспособности клеток (например, кальцин по FL1
или 7-AAD по FL4)
26. Для корректного сбора данных необходимы следующие
гистограммы:
- двухпараметрические гистограммы «флуоресценция-против-
флуоресценции» - контроль корректности настройки компенсации (на всех
гистограммах отображены ТОЛЬКО клетки интереса!!!)
27. FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750
488 Excitation 633 Excitation
HLA-DR CD4 CD3 CD56 CD25 CD8 CD19 CD45
IM1638U A07751 A07748 A79388 A52882 IM2469 A78837 A79392
T/B/NK, маркеры «ранней» и «поздней» активации
8-цветная комбинация
Цель исследования:
Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+
and CD8+
Т-клетки
Оценить уровень экспрессии активационных маркеров на примере CD25 и HLA-DR
Расположение антител по каналам:
Материал: - периферическая кровь
Пробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3
Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов
чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.
Сбор данных – NaviosTM
(2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM
32. FITC PE ECD PC5.5 PC7 APC APC-A700 APC-A750
488 Excitation 633 Excitation
CD38 CD62L CD45R0 CD56 CD3 CD4 CD19 CD8
A07778 IM2214U IM2712U A79388 737657 IM2468 A78837 A94683
T/B/NK, популяции наивных клеток и клеток памяти,
уровень экспрессии CD38 (8-цветная комбинация)
Цель исследования:
Выделить популяции B-лимфоцитов, NK- и NKT-клетки, а также CD4+
and CD8+
Т-клетки
Среди популяций Т-хелперов и цитотоксический Т-клеток выделить популяции наивных клеток,
центральных и эффекторных клеток памяти, а также «терминально-дифференцированных»
эффекторных клеток.
Определить уровень экспрессии активационного маркера CD38 на всех перечисленных выше
популяциях клеток
Расположение антител по каналам:
Материал: - периферическая кровь
Пробоподготовка: - лизис эритроцитов при помощи VersaLyse (A09777) + IOTest 3
Fixative (A07799), без отмывки, внесение по завершении лизиса эритроцитов
чаcтиц Flow-Count (7547053) для абсолютного счета.
Сбор данных – NaviosTM
(2 лазера, 8 цветов), обработка данных - KaluzaTM
