1. ELETROFORESE
Prof. Dra. Adriana Dantas
UERGS Bento Gonçalves, RS

2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS
Introduzida por Tiselius em 1937, foi
inicialmente realizada em meio líquido, sendo
posteriormente aperfeiçoada com emprego de
um meio-suporte.
É uma técnica bioquímica versátil,
relativamente simples, rápida e de grande poder
informativo, tornando-se indispensável nas mais
diversas áreas da biologia molecular.
Atualmente é aplicada na análise de enzimas,
proteínas e ácidos nucléicos e tem amplamente
usada em estudos de taxonomia, bioquímica,
fisiologia e genética humana, de plantas, animais
e microrganismos.

3. POTENCIAL DE USO
 Identificação de fungos, bactérias, nematóides,
vírus, viróides;
 Caracterização de fitopatógenos;
 Estudos de genética e evolução de fungos
fitopatogênicos;
 Identificação de clones, cultivares e linhagens;
 Estudos citogenéticos, ecológicos, fisiológicos
e bioquímicos;
 Estudos de resistência à doenças;

4. POTENCIAL DE USO
 Estudos da relação patógeno-hospedeiro;
 Determinação do peso molecular de proteínas;
 Caracterização de moléculas de ácidos
nucléicos;
 DNA recombinante, seqüênciamento de
nucleotídeos;
 Mapeamento de fragmentos de restrição;
 Amplificação de DNA.

5. PRÍNCIPIOS DA TÉCNICA DE
ELETROFORESE
A eletroforese consiste na migração de
moléculas ionizadas, de acordo com suas cargas
elétricas e pesos moleculares em campo elétrico.
Moléculas com cargas negativas migram para
o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga
positivas migram para o pólo negativo (cátodo).
Em razão das proteínas serem substâncias
anfóteras, é indispensável manter constante o pH
do meio durante a eletroforese, através do uso de
soluções-tampão para não gerar cargas, as quais
podem interferir na corrida.

6. Ferramentas da Biologia Molecular
Enzima de restrição
PCR
Eletroforese Termociclador
DNA ligase
CA AR
L
S
CO
AR
CAS
COL

7. A separação dos fragmentos da
molécula de DNA em gel de
eletroforese
Características do DNA
Separação por tamanho

8. Eletroforese (Michaelis, 1909)
Géis
Amido —
Agarose
Acrilamida
Soluções-tampões
+
O sentido e a velocidade de migração é
determinado pelo tamanho e carga das
moléculas

9. O princípio básico envolvido na obtenção e
detecção de cada classe de marcador
bioquímico ou de DNA reside no uso de
eletroforese.
O termo eletroforese foi criado por Michaelis
em 1909, para descrever migração de
colóides sob a influência de um campo
elétrico.
Seu princípio é simples: moléculas de carga
negativa migram para o pólo positivo, e
moléculas com carga positiva migram para o
pólo negativo.
A eletroforese visa à separação de
moléculas em função de suas cargas
elétricas, de seus pesos moleculares e
de suas conformações, em suportes
porosos (géis) e soluções-tampões
(estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo
de corrente elétrica).

10. AGAROSE

11. Carregando o gel com as
amostras

13. Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo

14. Análise DNA forense
Exemplo, de caso resolvido pelo gel
vertical de acrilamida corado com nitrato
de prata
Sangue retirado de chapéu e jeans
S = suspeito
V- vítima

15. SISTEMA TAMPÃO
 Tampão usado na preparação do gel;
 Tampão do tanque ou cuba eletrolítica;
CONDUÇÃO DA ELETROFORESE
 Gradiente de densidade
 Meios de suporte:
* Papel filtro;
* Sílica gel;
* Membranas de acetato de celulose;
* Amido;
* Gel de agarose;
* Poliacrilamida.

16. CORRENTE ELÉTRICA:
A passagem da corrente elétrica através de uma
solução segue a lei de Ohm, na qual:
V=R.I
V = voltagem, R = resistência e I = amperagem
Para que a técnica funcione, deve ser desenvolvida sob
voltagem (V), corrente (I) e potência (W) constantes.
VELOCIDADE DE MIGRAÇÃO:
* Diretamente proporcional: ao campo elétrico e à carga
líquida.
* Inversamente proporcional: ao raio, à distância entre os
dois eletrodos e à viscosidade.

17. TEMPERATURA:
Quanto mais elevada a voltagem ou a
intensidade da corrente, maior será o aumento
de temperatura.
No caso de eletroforese de isoenzimas e de
proteínas, as temperaturas elevadas podem
degradar as enzimas e proteínas, o que,
eventualmente, resulta na perda da atividade
enzimática e protéica.

18. VISUALIZAÇÃO DAS BANDAS:
 PROTEÍNAS: corante “coomasie blue”
 ENZIMAS: solução específica (substrato,
coenzimas, solução-tampão e sais)
 DNA e RNA: vários sistemas de revelação, tais
como:
- Fluorescência (Brometo de Etídio);
- Radioatividade;
- Nitrato de prata;

19. SISTEMA DE RESOLUÇÃO
AFLP
RAPD
Agarose
Brometo de Etídeo
U.V. Poliacilamida
Nitrato de Prata 0,2%

20. SISTEMAS DE ELETROFORESE:
 POSIÇÃO DO GEL: vertical ou horizontal;
 POROSIDADE: contínuo ou descontínuo;
 PASSAGEM DA CORRENTE: unidirecional
ou bidirecional.

23. APLICAÇÕES EM ANÁLISE ENZIMÁTICA:
As isoenzimas são empregadas como
marcadores genéticos, e suas aplicações vão
desde a genética de microrganismos até a
genética humana.
Isoenzimas são usadas para reconstrução
da história evolutiva das espécies, e como
ferramenta taxonômica capaz de caracterizar
variantes individuais de uma dada espécie,
apresentando valia na sistemática de raças,
espécies e gêneros estreitamente relacionados.

24. APLICAÇÕES EM ANÁLISE ENZIMÁTICA:
Análises eletroforéticas em plantas e
animais mostram que padrões de isoenzimas
e a intensidade relativa dos eletromorfos são
espécie-específica para órgãos ou tecidos e
para estádios de desenvolvimento.
O estádio de desenvolvimento em que as
isoenzimas aparecem ou desaparecem
refletem a ativação ou repressão de genes que
controlam a síntese das enzimas.

28. Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de
uma mesma enzima, apresentando função idêntica ou
similar, presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller,
1959).
6PGDH -CM
Gel de Araucaria angustifolia
MANTOVANI, 2003

29. monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
MANTOVANI, 2003

30. APLICAÇÕES EM ANÁLISE PROTÉICAS:
A grande maioria das análises protéicas é
realizada pelo sistema denominado SDS-
PAGE, na qual se usa o detergente Dodecil
Sulfato De Sódio (“Sodium Dodecyl Sulfate”).
Basicamente, a proteína é desnaturada
por aquecimento na presença de 2-
mercaptoetanol, que rompe as ligações
dissulfeto, e os polipetídeos adquirem a carga
negativa do SDS. A separação no gel dá-se
unicamente pela diferença dos pesos
moleculares.

31. APLICAÇÕES EM ANÁLISE DE DNA E RNA:
A migração eletroforética de ácidos nucléicos é
amplamente empregada em técnicas de biologia
molecular, para separar, isolar e manipular fragmentos
de DNA e RNA.
O sentido da migração dos ácidos nucléicos é
sempre em direção ao ânodo ou pólo positivo, pois
possuem carga total negativa decorrente de seus
grupamentos fosfato.
Além disso, em presença de tampões adequados,
que permitem a desnaturação das conformações
secundárias ou terciárias, fragmentos lineares
pequenos, bem como fitas simples, migram mais
rapidamente do que os longos e de fita dupla.

32. APLICAÇÕES EM ANÁLISE DE DNA E RNA:
Técnicas eletroforéticas usadas nas
separação de fragmentos de DNA/RNA:
 DGGE - Eletroforese em Gel com Gradiente
Desnaturante: emprega gradientes desnaturantes
químicos.
 TGGE – Eletroforese em Gel com Gradiente de
Temperatura: refere-se a gradientes de
temperatura.
 PFGE/IFGE – Eletroforese em Gel com Campo
em Pulso/Inverso: refere-se a gradientes
elétricos.

33. GEL DE AGAROSE

52. GEL DE POLIACRILAMIDA

55. Gel acrilamida

67. GEL DE PROTEÍNA

71. Picture 5

75. Gel de Proteína - Gluteninas