Este documento apresenta informações sobre sequenciamento e métodos em metabolômica de proteína, com aplicações em ciências ômicas. Ele discute conceitos importantes da metabolômica e suas etapas, além de técnicas experimentais como eletroforese 2D e espectrometria de massa. O documento também aborda a aplicabilidade da metabolômica em diversas áreas como farmacologia e nutrição.

1. Universidade Federal de Mato Grosso
Disciplina: Taxonomia de Fungos Filamentosos, com ênfase em
Endofíticos
Docente: Profº Dr. Marcos Antônio Soares
Discentes:
Mestrando: Adnaldo Brilhante (Pós Graduação em
Química).
Doutoranda: Ivani Souza Mello (Pós Graduação em
Biotecnologia e Biodiversidade - Rede Pró-Centroeste).
Cuiabá/ MT
2015

2. 2
SEQUENCIAMENTO E MÉTODOS
EM METABOLÔMICA DE PROTEÍNA
- COM APLICAÇÕES

3. Ciências Ômicas
Plataformas tecnológicas que visam isolar e
caracterizar biomoléculas.
As mais comuns são a genômica, a trancriptômica a
proteômica e a metabolômica.
A origem etimológica desse termo deriva da
genômica:
3
GENE + CROMOSSOMA = GENOMA GENÔMICA

4. ESQUEMA DA CIÊNCIAS ÔMICAS
4
pt.slideshare.net

5. 5
ESQUEMA DAS CIÊNCIAS ÔMICAS
Villas-Bôas & Gombert (2006).

6. Metabolômica
Visa as pequenas moléculas que compõem o metabolismo
celular – isto é, os metabólitos – tanto para
caracterização, quanto buscando uma melhor
compreensão dos processos biológicos que estão
ocorrendo em seus objetos de estudo.
6
Metabólitos
Rotas
principais
Primários Secundários
Funções
específicas
Gautam et al., (2007).

7. 7
METABOLÔMICA
Villas-Bôas & Gombert, 2006

8. Conceitos Importantes
Caracterização metabólica:
Isolamento de moléculas alvo e a caracterização de sua via
de síntese.
Metabolômica:
Isolamento de todos os metabólitos de uma amostra
biológica em condições normais e sob algum tipo de
estresse.
Engenharia de metabolismo:
Identificação de genes e rotas metabólicas de
determinado composto, visando aumentar, reduzir ou
eliminar sua produção.
8
Villas-Bôas & Gombert, 2006

9. Etapas da Metabolômica
9
Gautam et al., (2007).

10. Técnicas experimentais
Eletroforese 2D
 Método para separação e
visualização de proteínas;
 Separação por carga e massa.
Espectrometria de Massa
 Análise de alta confiabilidade e
identificação de proteínas;
 Fragmentação de proteínas;
 Análise de peptídeos.
10
http://www.neobio.com.br/
www.alunonaweb.com.br

11. 11
A primeira dimensão
(separação por ponto isoelétrico)
Gel com um gradiente de pH
imobilizado;
Corrente elétrica leva
proteínas carregadas a se
mover até alcançar o ponto
isoelétrico.
2D-SDS PAGE gel
Gautam et al., (2007).

12. Ponto Isoelétrico (PI)
Separação por carga:
12
4
5
6
7
8
9
10
GradientedepHestável
Alto pH:
Proteína
carregada
-
Baixo pH:
Proteína
Carregada
+
No ponto
isoelétrico, a
proteína não
tem carga e
portanto não
migra mais no
campo elétrico.
Gautam et al., (2007).

13. 13
A segunda Dimensão
(separação por massa)
pH gel strip e colocado em um gel SDS;
SDS desnatura a proteína (movimento
somente devido a massa) e elimina carga.
2D-SDS PAGE gel
A primeira Dimensão
(separação por ponto isoelétrico)
Gel com um gradiente de pH
imobilizado;
Corrente elétrica leva a proteínas
carregadas a mover até alcançar o
ponto isoelétrico.
Gautam et al., (2007).

14. 14
2D-SDS PAGE gel
Gautam et al., (2007).

15. Exemplo de técnica de 2D-gel
15
Gautam et al., (2007).

16. Vantagens
Boa resolução para
proteínas;
Detecção de modificações
pós-transcricionais.
16
 Não funciona bem para
proteínas altamente
hidrofóbicas
 Limitado pelo alcance de pH
 Difícil detecção de proteínas
pouco abundantes
 Análise e quantificação são
difíceis
Desvantagens
franquiastop.com.br

17. Exemplo de experimento 2-D gel
17
Gautam et al., (2007).

18. Análise de dados do experimento 2-D gel
18
Gautam et al., (2007).

19. Exemplo de experimento 2-D gel
19
Protein identification via 2DE and MALDI-TOF PMF
Kim et al., (2007)

20. Exemplo de experimento 2-D gel
20
Kim et al., (2007)

21. O que é Espectrometria de
massa?
Ferramenta analítica para determinar a composição
molecular de uma amostra ou os pesos moleculares;
Somente picomolares de concentrações são requeridas;
Acurácia de 0.01%, com somente 5 ppm de pequenas
moléculas orgânicas;
Para 40 kDa, erro de 4 Da;
Pode-se identificar substituições de aminoácidos ou
modificações pós-traducionais.
21
Villas-Bôas & Gambert (2006), Wang et al., (2003).

22. Que tipo de informação é gerada?
Informação estrutural;
Tandem de espectrometria de massa – particularmente, uma
sequencia definida;
Fragmentação de amostra – análise de produtos;
Sequenciamento de peptídeos;
Identificação de compostos individuais em misturas
complexas;
22
Wang et al., (2003); Jewett et al., (2006); Espindola et al., (2010).

23. Como funciona um espectrômetro?
3 partes fundamentais: fonte de ionização, o analisador e o
detector
Amostras fáceis de manipular se ionizadas
Separação no analisador de acordo com a razão massa-carga
(m/z)
Detecção de íons em separado e abundância relativa
Sinais enviados ao sistema de dados e apresentados em um
espectro m/z
23

24. Esquematização de um espectrômetro
O analisador, o detector e o ionizador estão em vácuo, para
evitar movimento indesejado de íons;
A operação está sob completo controle de sistema.
24
Moraes & Lago (2003).

25. 25
mcponline.org

26. Esquema típico de um TOF-MS
26
http://www.abrf.org/abrfnews/1997/june1997/jun97lennon.html

27. Introdução da amostra e Ionização
Ionização direta ou via cromatografia para separação de
componentes (HPLC, GC, eletroforese capilar);
Ionização pode resultar em íons positivamente carregados
(proteínas) ou negativamente carregados (sacarídeos e
oligonucleotídeos).
27
http://uab.ifsul.edu.br/tsiad/conteudo/modulo1/fis/fis_ua/at1/img/pag03-img03.gif

28. Metodologias de Ionização
Pressão atmosférica Ionização Química (APCI);
Ionização Química (CI);
Impacto de Elétron (EI);
Ionização por Eletro spray (ESI);
Bombardeamento Atómico Rápido (FAB);
Dessorção de Campo / campo de ionização (FD/FI);
Matriz Laser Assistida por Dessorção de Ionização
(MALDI);
Ionização por Termo spray.
28

29. Detecção dos Íons
O detector monitora o íon, amplifica seu sinal e o transmite
para o sistema
Detectores comuns: fotomultiplicador, eléctron multiplicador
chapa de micro canal
29
altered-states.net prezi.com

30. Espectrometria de massas é uma metodologia
poderosa para analisar a estrutura de compostos
orgânicos, mas tem algumas limitações:
Nada pode ser caracterizado se não estiver em uma solução
DEVIDAMENTE LIMPA;
A técnica não tem habilidade de apresentar uma análise
seletiva de uma mistura complexa;
Para moléculas grandes, resultados são difíceis de
interpretar.
30

31. Tandem MS ou MS/MS tem 2
espectro de massa em série:
O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte
primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual
passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a
dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons
gerados. Na verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2.
MS2MS1
31

32. Sequenciamento de peptídeos
Peptídeos de 2.5 kDa ou menos dão melhores resultados.
Proteínas retiradas de géis 2-D e digeridas;
Peptídeos fragmentados nas ligações peptídicas na Tandem
da espectrometria de massa;
Alguns peptídeos geram informações para uma sequência
completa, enquanto a maioria gera sequencias parciais de 4-5
aa;
Geralmente essas “tag” de sequencias são suficientes para
identificação por database.
32

33. 33

34. Identificação de proteínas por MS
Espectro
artificial
Tripsinizado
artificialmente
Database de
sequências
(ex. SwissProt)
Spot removido
do gel
Fragmentação
com tripsina
Espectro dos
Fragmentos
MATCH
Library
34

35. Como funciona o sequenciamento de proteínas
Tandem MS: dois analisadores de
massa em série com uma célula de
colisão no meio;
Célula de colisão: um local aonde os
íons colidem com um gás (He, Ne, Ar)
resultando em fragmentação do íon;
A fragmentação dos petídeos na
células de colisão ocorre de maneira
previsível, principalmente nas ligações
peptídicas;
Os íons resultantes tem massas que
são consistentes com uma database
de pesos moleculares de dipeptídeos,
tripeptídeos, tetrapeptídeos.
35
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp
Célula de colisão
Ser-Glu-Leu-Ile-Arg
Ser-Glu-Leu
Ser-Glu-Leu-Ile
Etc…

36. Bioinformática e Integração de
técnicas e conhecimentos
36
Espindola et al., 2010

37. Exemplo de Experimento com MS
37
http://iitb.vlab.co.in/userfiles/Slide2%289%29.jpg

38. 38
Exemplo de Experimento com MS
Gautam et al, 2007

39. Vantagens
Determinação de
peso molecular e
sequencia de aa;
Detecção de
modificações pós-
transcricionais;
Alta confiabilidade.
39
 Alto custo
 Requer sequencia de
peptídeos em database.
Desvantagens
franquiastop.com.br

40. Etapas da Metabolômica
Fatores que influenciam as análises metabolômicas
durante a seleção do organismo a ser analisado:
Tratamento;
Idade;
Tamanho.
40
www.bagozzi.edu.br novosinsolitos.blogspot.com

41. Etapas da Metabolômica
Fatores que influenciam as análises metabolômicas
durante o preparo da amostra:
Quantidade de amostra;
Maceração;
Horário de coleta.
41
Villas-Bôas & Gombert (2006).

42. Etapas da Metabolômica
 Fatores que influenciam as análises metabolômicas
durante o pré fracionamento:
 Escolha do solvente mais adequado;
 Evitar interferência nos equipamentos;
 Evitar reações indesejadas entre o solvente e a amostra.
42

43. Etapas da Metabolômica
Técnicas comumente utilizadas no fracionamento:
43
RMN e EMFT-ICR-MS

44. Etapas da Metabolômica
Requisitos básicos para realizar análises
metabolômicas:
Grande capital para investimento;
Espaço físico adequado;
Profissionais capacitados.
44
http://aston.chem.purdue.edu/research/metabolomics

45. Etapas da Metabolômica
Fator que influencia as análises
metabolômicas durante a conversão de
valores:
Colocar os resultados obtidos por diferentes
técnicas de fracionamento em uma linguagem
comum.
45
www.nextidea.com.brMorgenthal (2005); Espindola et al., (2010)

46. Etapas da Metabolômica
Principal metodologia de análise estatística:
Análise de Componente Principal (ACP):
Identificação de componentes mais abundantes;
Organização hierárquica dos componentes identificados.
46
Morgental (2005)

47. Aplicabilidade da Metabolômica
Aplicações em diversas áreas:
Farmacologia;
Nutrição;
Ecologia;
Evolução;
47
Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..

48. Metabolômica na farmacologia
48
Seleção Síntese Industrialização
Ensaios de
toxicidade in
vitro e in vivo
Busca de
marcadores de
toxicidade
Mecanismos
de toxicidade
Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn, 2002..

49. Metabolômica na nutrição
Conhecer as modificações causadas pela alimentação
no metaboloma do indivíduo:
49
Villas-Bôas & Gombert (2006); Weckwerth & Fiehn ( 2002).
www.scielo.br

50. Alimento
Nutrientes Não-
nutrientes
FitoquímicosInsumos
agrícolas
Micro-
nutrientes
Macro-nutrientes
Contaminantes Defensivos
Metabolômica na nutrição
50

51. Metabolômica na ecologia
Observar diferenças imprevistas entre cultivares
selvagens e modificadas geneticamente:
 Glutamato desidrogenase em Nicotiana tabacum (Mungur et al.,
2005):
 + de 350 compostos alterados;
 9 compostos carcinogênicos;
 14 fármacos em potencial.
51

52. Metabolômica na ecologia
Identificar metabólitos comuns e
diferenciais entre plantas
resistentes e susceptíveis a uma
determinada praga:
Já realizado pela transcriptômica e
pela proteômica;
Poucos trabalhos utilizando a
metabolômica (Forst, 2006).
52
br.freepik.com

53. Metabolômica na ecologia
 Diferenciação de populações a partir de RMN de biofluidos:
 Haliotis rufescens (mariscos) – (Viant et al., 2003);
 Organização evolutiva a partir da presença de determinados metabólitos:
 Streptomyces – (Challis & Hopwood, 2003);
53

54. Perspectivas para a Metabolômica
Determinação de um protocolo padrão;
Desenvolvimento de ferramentas para um melhor
aproveitamento dos dados gerados;
Integração das ômicas (Biologia de Sistemas).
54

55. Considerações finais
Ômica mais nova e bastante promissora;
Grupo de moléculas muito diverso;
Necessita de padronização e melhoramento das técnicas.
55

56. Referências
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Genetics and Biology,44(9), 886-895.
• Moraes, M. C. B., & do Lago, C. L. (2003). Espectrometria de massas com ionização por" electrospray" aplicada ao estudo
de espécies inorgânicas e organometálicas. Química Nova, 26(4), 556-563.
• Espindola, F. S., Calábria, L. K., de Rezende, A. A. A., Pereira, B. B., Santana, F. A., Amaral, I. M. R., ... & de Araújo, T. G.
(2010). Recursos de bioinformática aplicados às ciências ômicas como genômica, transcriptômica, proteômica, interatômica e
metabolômica= Bioinformatic resources applied on the omic sciences as genomic, transcriptomic, proteomic, interatomic and
metabolomic. Bioscience Journal, 26(3).
• Villas-Boas, S. G., & Gombert, A. K. (2006). Análise do Metaboloma—Uma ferramenta biotecnológica emergente na era pós
—genômica. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 9(36), 58-69.
• Weckwerth, W., & Fiehn, O. (2002). Can we discover novel pathways using metabolomic analysis?. Current Opinion in
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• Hofmann, G., McIntyre, M., & Nielsen, J. (2003). Fungal genomics beyond Saccharomyces cerevisiae?. Current opinion in
biotechnology, 14(2), 226-231.
• Jewett, M. C., Hofmann, G., & Nielsen, J. (2006). Fungal metabolite analysis in genomics and phenomics. Current opinion in
biotechnology, 17(2), 191-197.
• Weckwerth, W., & Morgenthal, K. (2005). Metabolomics: from pattern recognition to biological interpretation. Drug discovery
today, 10(22), 1551-1558.
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metabolites by mass spectrometry without isotopic labeling or spiked standards. Analytical chemistry, 75(18), 4818-4826.
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• Roessner, U., & Bowne, J. (2009). What is metabolomics all about?.Biotechniques, 46(5), 363.
• Albright, J. C., Henke, M. T., Soukup, A. A., McClure, R. A., Thomson, R. J., Keller, N. P., & Kelleher, N. L. (2015). Large-
Scale Metabolomics Reveals A Complex Response of Aspergillus nidulans to Epigenetic Perturbation.ACS chemical biology.
56