Apresentação de proposta de projeto de pesquisa para exame de qualificação

1. Alda Ernestina dos Santos 23/10/2014 1 Universidade Federal do Rio de Janeiro Instituto de Pesquisas de Produtos Naturais Composição química e atividade inseticida dos óleos voláteis das folhas de Eucalyptus spp. utilizadas pela população de Luz-MG no combate à dengue Projeto de Pesquisa para Exame de Qualificação

2. 2 INTRODUÇÃO Óleos voláteis Características Plantas aromáticas (Asteraceae, Poaceae, Lamiaceae, Myrtaceae, Zingiberaceae, Pinaceae, Apiaceae, Cupressaceae) “Produto obtido a partir de matéria prima vegetal por hidrodestilação ou destilação por arraste a vapor; ou partir do epicarpo de espécies de Citrus por processo mecânico” (Norma ISO 9235.2) Produzidos por estruturas secretoras especializadas Geralmente líquidos voláteis, lipossolúveis, incolores e menos densos que a água Funções diversas nos vegetais Cerca de 20-60 componentes (majoritário(s) com 20-70% de abundância) Predominância de terpenos principalmente monoterpenoides (90%) e sesquiterpenoides Bakalli et al. (2008); Schmidt (2010); Vitti & Brito (2003); Franz & Novak (2010)

3. 3 INTRODUÇÃO Óleos voláteis Terpenos Figura 1: Exemplos de terpenos componentes de óleos voláteis diversos Monoterpenos O O Citronelal Cymbopogon winterianus Neral Citrus x limon Pulegona Mentha pulegium Dewick (2002) O Thujona Artemisia absinthium α-felandreno Zingiber officinale OH Mentol Mentha x piperita Sesquiterpenos O α-bisaboleno Origanum vulgare α-gurjuneno Achyrocline satureoides α-humuleno Humulus lupulus β-cariofileno Cinnamomum zeylanicum

4. 4 INTRODUÇÃO Óleos voláteis Atividade sobre insetos Atividade inseticida e/ou repelente Atividade sobre Aedes, Anopheles e Culex Óleo de citronela – 1901 até 1940 Citronela, limão e eucalipto – repelentes de uso tópico recomendados pela US Environmental Protection Agency Menos tóxicos para os organismos não alvos Geralmente não induzem à resistência Menor ecotoxicidade Mecanismos de ação não são bem estabelecidos Curto período de ação devido à alta volatilidade Toxicidade aguda em ratos Oral: LC50 = 2170-3664 mg/Kg Inalação: LC50 = 5.95 mg/L Dérmica: LC50 = 4280 mg/Kg Toxicidade aguda em ratos Oral: LC50 = 4200 mg/Kg Inalação: LC50 = 7.05 mg/L Dérmica: LC50 = 5000 mg/Kg Nerio et al. (2010); Katz et al. (2008); George et al. (2014); Knaak & Fiuza (2010) N O DEET N,N- dietil-m-toluamida

5. 5 INTRODUÇÃO Eucalyptus Características Figura 2 : E. pilularis em área de cultivo Myrtaceae; cerca de 700 espécies; origem Australiana Eucalyptus = eu, “bem” + kalyptós, “coberto” Fácil adaptação climática; cultivado em todo o mundo (madeira e óleos voláteis) Árvores de grande porte e odor característico Grande interesse comercial (indústrias farmacêutica e alimentícia e da perfumaria) 1855 - introdução de E. globulus no Brasil http://biolinfo.org/cmkb/view.php?comname=cmkb_public&scid=545 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Starr_020203-0027_Eucalyptus_pilularis.jpg Zrira et al. (2004); Cheng et al. (2009); Vitti & Brito (2003) Figura 3 : Frutos secos de E. pilularis

6. 6 INTRODUÇÃO Eucalyptus Óleos voláteis Zrira et al. (2004); Doran (1991) Brooker & Kleinig (2006) Folhas, cascas, brotos e frutos Apenas 200 espécies avaliadas quanto à composição química Mistura de 50-100 componentes, principalmente monoterpenos O 1,8-cineol E. globulus β-ocimeno E. curtisii β-pineno E. tenuipes α-pineno E. rubiginosa α-thujeno E. alba OH globulol E. camaldulensis OH espatulenol E. alba germacreno D E. varia OH trans-nerolidol E. deglupta Figura 4: Exemplos de terpenos componentes dos óleos voláteis de Eucalyptus spp.

7. 7 INTRODUÇÃO Eucalyptus Óleos voláteis Tabela 1: Compostos majoritários observados em Eucalyptus spp. Coletadas em regiões diversas Classificação quanto à composição Medicinais – 1,8-cineol como majoritário (acima de 70%); produtos farmacêuticos Industriais – felandreno ou piperitona; desinfetantes, obtenção do timol e mentol Perfumaria – citral ou citronelal; essências Tapondjou et al., (2005)Camarões39.5αααα-pinenoE. saligna Medhi et al., (2010)Irã69.51,8-cineolE. camaldulensis Vilela et al., (2009)Brasil89.91,8-cineolE. globulus Elaissi et al., (2011)Tunísia54.01,8-cineolE. citriodora Ribeiro et al., (2013)Brasil72.9(+) - limonenoE. staigeriana Grbovic et al., (2010)Montenegro28.6p-cimenoE. camaldulensis Oyedeji et al., (1999)Nigéria32.9αααα- thujenoE. alba Zrira et al., (2004)Marrocos87.81,8-cineolE.cinerea Brophy et al., (2009)Austrália31.0ββββ-pinenoE. tenuipes Cheng et al., (2009)Taiwan22.52αααα-pinenoE. camaldulensis ReferênciaPaís da coleta(%)CompostoEspécie Bizzo et al. (2009) 7

8. 8 INTRODUÇÃO Eucalyptus Atividade inseticida e repelente Tabela 2: Atividade de Eucalyptus spp. sobre espécies diversas de insetos Maciel et al. (2010) ; Batish et al. (2008) Potencialidade como inseticida e/ou repelente Baixa toxicidade para mamíferos Facilidade de obtenção A. aegypti Larvicida Adulticida Repelente Manimaran et al., (2013)Aedes aegyptiLarvicidaE. globulus Alzogaray et al., (2011)Blattella germanicaNinficidaE. dunnii Yang et al., (2004)Pediculus humanusOvicidaE. globulus Lucia et al., (2009)Aedes aegyptiFumiganteE. grandis Kumar et al., (2012)Musca domesticaPupicidaE. globulus Medhi et al., (2010)Anopheles stephensiLarvicidaE. camaldulensis Sritabutra & Soonwera (2013)Aedes aegyptiRepelenteE. citriodora Roh et al., (2013)Tetranychus urticaeRepelenteE. elata Jemâa et al., (2013)Ectomyelois ceratoniaeAdulticidaE. camaldulensis ReferênciaEspécie alvoAtividade avalidada Espécie 9

9. 10 INTRODUÇÃO Dengue Figura 5: Municípios brasileiros infestados com A. aegypti OMS (2002) ; Barreto & Teixeira (2008) Presente em mais de 100 países 50-100 milhões de casos anuais 2,5 bilhões de pessoas em áreas de risco Aedes aegypti – DENV-1; DENV-2, DENV-3 e DENV-4 Controle – inseticidas sintéticos e campanhas de sensibilização http://noticias.r7.com/saude/noticias/numero-de-mortes-por-dengue-20100711.html

10. 10 INTRODUÇÃO Luz-MG Tabela 3: Casos de dengue notificados no Brasil, Minas Gerais e Luz entre 2009-2013 IBGE (2006) ; IBGE (2010) 17.486 habitantes Agricultura e pecuária Cultivo de Eucalyptus spp. (fonte de madeira) 693 hectares de área plantada 35.000 toneladas anuais Espécies mais cultivadas: E. pellita, E. pilularis, E. paniculata e E. saligna Uso popular das folhas (sub produto) no combate ao Aedes aegypti

11. 11 Geral OBJETIVOS Estudo da composição química dos óleos voláteis das folhas de E. pilularis, E. pellita e E. saligna, bem como avaliação de sua atividade sobre Aedes aegypti Específicos I) Obtenção dos óleos voláteis através da hidrodestilação II) Análise da composição química por CGAR-EM III) Determinação das propriedades físicas dos óleos obtidos IV)Avaliação da atividade sobre ovos, larvas, pupas e insetos adultos de A. aegypti

12. 12 JUSTIFICATIVA I) Grande interesse científico e popular sobre Eucalyptus spp. II) Potencial dos óleos voláteis como fonte de substâncias inseticidas e/ou repelentes III) Escassez de estudos químicos com E. pilularis, E. pellita e E. saligna IV) Importância de agregar valor aos sub-produtos destas espécies V) Necessidade da busca por alternativas no controle de Aedes aegypti VI) Relevância de estudos que visem à confirmação científica das propriedades relatadas pelo uso popular de espécies vegetais

13. 13 METODOLOGIA Coleta das folhas E. pilularis, E. pelitta, E. saligna Secagem à sombra 5 dias Óleos voláteis Composição química e qualidade Hidrodestilação Identificação Botânica Prof. Cassia Sakuragui Análise por CGAR-EM Clevenger por 3 horas Controle de qualidade Óleo volátil Coluna: DB-5 ms (25m x 0.25mm x 0.25µm) Injetor: 260°C; Detector: 290°C; 1 mL/min. 60-290°C (3°C/min) NIST 21 e NIST 107; Índice de Kovats; Adams (2007) Densidade relativa – picnômetro (20°C) Rotação óptica – polarímetro Acatec PD-5000 Índice de refração – refratômetro de Abbe 2WAJ Teor de 1,8-cineol – CGAR-EM ISO 3044 Densidade relativa (20°C) = 0,858 – 0,877 Rotação óptica (20°C) = (-2) a (+4) Índice de refração = 1,4500 – 1,4590 Teor de 1,8-cineol > 70%

14. 14 METODOLOGIA Colônia de cultivo 10-12 dias Óleos voláteis Atividade sobre A. aegypti Ovos Larvas Ovos A. aegypti Instituto de Biologia do Exército Atividade ovicida (48 horas) 12.5 – 150 ppm tiras com 100 ovos (-) tween 80 (0,01%) Atividade larvicida (24 horas) 25 – 200 ppm 25 larvas de 3° estádio (+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%) Pupas Atividade pupicida (24 e 48horas) 75 – 250 ppm 25 pupas recém emergidas (+) temefós (6ppm); (-) tween 80 (0,01%) Fêmeas adultas Atividade adulticida (24 horas) 150 – 500 ppm 20 fêmeas (5-6 dias de idade) 60 min. exposição kit OMS (+) dichlorvos (0,8 ppm) Atividade repelente 0.5, 1 e 2 mg/cm2 50 fêmeas (4-8 dias de idade) (+) OFF! (SC Johnson) Análise estatística média ± desvio padrão, % de mortalidade, % de proteção LC50 e LC90 por análise de Probit Anova – teste de Tukey 5% significância 14 Govindarajan et al. (2011) OMS (2005) Panneerselvam et al. (2011) OMS (1981)OMS (2009)

15. Resultados Esperados 15 Conhecer a composição química dos óleos voláteis Resultados experimentais X uso popular; agregar valor às folhas Controle de qualidade. Interesse comercial? Avaliação em diferentes estágios de desenvolvimento = resultados mais completos Atividade larvicida – análise por MEV, possíveis modificações estruturais Atividade adulticida – análise da composição química do vapor do óleos empregando HS-SPME CG-EM Atividade repelente – análise da atividade repelente das velas produzidas com o sumo das folhas de Eucalyptus spp. Perspectivas

16. 16 Equipe Envolvida Identificação botânica das espécies Profª. Cássia M. Sakuragui – IB/UFRJ Química Prof. Ricardo M. Kuster – IPPN/UFRJ Msc Alda Ernestina dos Santos Atividade Biológica Profª. Naomi Kato Simas – FF/UFRJ Celso Evangelista dos Santos – IPPN/UFRJ Alunos Mestrando – 1 aluno Iniciação científica – 2 alunos

17. 17 Orçamento Material de consumo Quadro 1: Gastos com material de consumo R$ 671,50Gasto total com material de consumo 10,45500 g10,45Cultivo dos insetosSacarose 100,00-100,00DiversasMaterial de escritório 109,002 ml109,00CromatografiaPadrão de n-alcanos 33,70250 g33,70Tratamento dos óleosNa2SO4 anidro 12,606 Pcts. 100 unid.2,10Teste larvicidaCopos descartáveis 64,00Pct. 1000 unidades64,00Testes biológicosPonteiras micropipeta 24,80Pct. 100 unidades24,80Cultivo dos insetosPipetas descartáveis 7,95500 g7,95Cultivo dos insetosRação canina 48,003 unidades16,00Testes biológicosRack para tubos 53,00Pct. 500 unidades53,00Testes biológicosTubos eppendorf 90,002 x 50 mL45,00Testes biológicosTween 80 18,00200 mL18,00Teste de repelênciaOFF! spray 95,00250 mg95,00Teste larvicidaTemephos 50,00250 mg50,00Teste inseticidaDichlorvos Valor totalQuantidadeValor unitário FinalidadeMaterial Material de consumo (valores expressos em reais)

18. 18 Orçamento Material permanente Quadro 2: Gastos com material permanente R$ 5761,00Total solicitado para a realização do projeto R$ 5044,50Gasto total com material permanente 204,002102,00HidrodestilaçãoSuporte universal 74,00174,00HidrodestilaçãoTermômetro 346,001346,00HidrodestilaçãoManta aquecedora 349,001349,00HidrodestilaçãoAparato tipo Clevenger 34,5056,90Cultivo dos insetosBandeja plástica 158,001158,00Det. da densidadePicnômetro 1940,0011940,00Det. índice de refraçãoRefratômetro de Abbe 369,001369,00Coleta do material vegetalPodão e cabo extensor 1200,003400,00Testes biológicosMicropipeta monocanal 370,001370,00Testes biológicosAgit. tubos tipo vórtex Valor totalQuantidadeValor unitário FinalidadeMaterial Material permanente (valores expressos em reais)

19. Cronograma de Execução 19 XXXXXElaboração de artigos e relatórios científicos XXXXApresentação em eventos científicos XXXXXAnálise dos resultados obtidos XXXAvaliação das atividades inseticida e repelente XXImplementação da colônia de A. aegypti XXXAnálise da composição química dos óleos XXDeterminação das propriedades físico químicas XXObtenção dos óleos voláteis das folhas XColeta e identificação de Eucalyptus spp. XPesquisa e levantamento bibliográfico 87654321 TRIMESTRESATIVIDADE Quadro 3: Cronograma de execução

20. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 20 BAKKALI, F.; AVERBECK, S.; AVERBECK, D.; IDAOMAR, M. Biological effects of essential oils - a review. Food and chemical toxicology, v. 46, n. 2, p. 446–475, 2008. BARRETO, M.L.; TEIXEIRA, M.G. Dengue no Brasil: situação epidemiológica e contribuições para uma agenda de pesquisa. Estudos Avançados, v. 22, n. 64, p. 53-72, 2008. BATISH, D.R.; SINGH, H.P.; KOHLI, R.K.; KAUR, S. Eucalyptus essential oil as a natural pesticide. Forest Ecology and Management, v. 256, n. 12, p. 2166–2174, 2008. BIZZO, H. R. et al. Óleos essenciais no Brasil: aspectos gerais, desenvolvimento e perspectivas. Química Nova, v. 32, n. 3, p. 588–594, 2009. BROOKER, M.I.H.; KLEINIG, D.A. Field guide to Eucalyptus. v. 1, Melbourne: Inkata Press, 2006, 353p. CHENG, S.S.; HUANG, C.G.; CHEN, Y.J.; YU, J.J.; CHEN, W.J.; CHANG, S.T. Chemical compositions and larvicidal activities of leaf essential oils from two eucalyptus species. Bioresource Technology, v. 100, p. 452–456, 2009 DEWICK, P.M. Medicinal natural products: a biosynthetic approach. 2a ed. Chichester: John Wiley & Sons, 2002. 507p. DORAN, J.C. Eucalyptus leaf oil: use, chemistry, distillation and marketing. Melbourne: Inkata Press, 1991, p. 11.

21. 21 FRANZ, C.; NOVAK, J. Sources of essential oils. In: CAN BASER, K.H.; BUCHBAUER, G. Handbook of essential oils: science, technology and applications. Boca Raton: CRC Press, p. 39- 82, 2010. GEORGE, D.R.; FINN, R.D.; GRAHAM, K.M.; SPARAGANO, O.A.E. Present and future potential of plant-derived products to control arthropods of veterinary and medical significance. Parasites & Vectors, v. 7, n. 1, p. 1-12 , 2014. GOVINDARAJAN, M.; MATHIVANAN, T.; ELUMALAI, K.; KRISHNAPPA, K; ANANDAN, A. Mosquito larvicidal, ovicidal and repellent properties of botanical extracts against Anopheles stephensi, Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus. Parasitology Research, n. 109, p. 353-367, 2011. KATZ, T. M.; MILLER, J.H.; HEBERT, A.A. Insect repellents: historical perspectives and new developments. Journal of the American Academy of Dermatology, v. 58, n. 5, p. 865–71, 2008. KNAAK, N.; FIUZA, L. Potencial dos óleos essenciais de plantas no controle de insetos e microrganismos. Neotropical Biology and Conservation, v. 5, n. 2, p. 120–132, 2010. MACIEL, M. V et al. Chemical composition of Eucalyptus spp . essential oils and their insecticidal effects on Lutzomyia longipalpis. Veterinary Parasitology, v. 167, p. 1–7, 2010. NERIO, L.S.; OLIVERO-VERBEL, J.; STASHENKO, E. Repellent activity of essential oils: a review. Bioresource technology, v. 101, n. 1, p. 372–378, 2010. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Instructions for determining the susceptibility or resistance of mosquito larvae to insecticides. Technical Documents, Geneva, 1981. Disponível em: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/69615/1/WHO_VBC_81.807_eng.pdf?ua=1. Acesso em: 06 de set. 2014.

22. 22 ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Report by the secretariat Dengue prevention and control. 55ª Assembléia Mundial da Saúde A55/19, 4 de março de 2002. Disponível em: http://apps.who.int/gb/archive/pdf_files/EB109/eeb10916.pdf. Acesso em: 05 de set 2014. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Guidelines for laboratory and field testing of mosquito larvicides. Communicable Disease Control, Prevention and Erradication, 1ª ed, 2005, 39p. Disponível em: http:/whqlibdoc.who.int/hq/2005/who_cds_whopes_gcdpp_2005.13.pdf. Acesso em: 05 de set. 2014. ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE. Guidelines for efficacy testing of mosquito repellents for human skin. 1ª ed, 2009, 30p. Disponível em: http://whqlibdoc.who.int/hq/2009/WHO_HTM_NTD_WHOPES_2009.4_eng.pdf. Acesso em: 05 de set. 2014. PANNEERSELVAM, C.; MURUGAN, K.; KOVENDAN, K.; KUMAR, P.M. Mosquito larvicidal, pupicidal, adulticidal and repellent activity of Artemisia nilagirica against Anopheles stephensi and Aedes aegypti. Parasitology Research, n. 111, p. 2241-2251, 2012. SCHMIDT, E. Production of essential oils. In: CAN BASER, K.H.; BUCHBAUER, G. Handbook of essential oils: science, technology and applications. Boca Raton: CRC Press, p. 83-120, 2010. VITTI, A.M.S.; BRITO, J.O. Óleo essencial de eucalipto. ESALQ, Documentos Florestais, n. 17, 2003. 30p. ZRIRA, S.; BESSIERE, J.M.; MENUT, C.; ELAMRANI, A.; BENJILALI, B. Chemical composition of the essential oil of nine Eucalyptus species growing in Morocco. Flavour and Fragrance Journal, v. 19, n. 2, p. 172–175, 2004.

24. UMA BREVE HISTÓRIA DA MEDICINA Doutor eu tenho uma dor ... 2000 a.C. - Aqui, coma essas raízes. 1000 d.C. - Raízes são pagãs, reze. 1850 d.C. - Rezas são superstição, beba essa poção. 1940 d.C. - Essa poção é inútil, tome essa pílula. 1985 d.C. - Essa pílula é inócua, tome esse antibiótico. 2000 d.C. - Antibiótico é artificial, coma essa raiz. 24

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