フリーソフトではじめるNGS融合遺伝子解析入門

フリーソフトではじめる
N G S 融合遺伝⼦解析⼊⾨
2016年5⽉27⽇
アメリエフ株式会社

本⽇のテーマ
2Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.
• RNA-seq解析
• 融合遺伝⼦解析

Copyright © Amelieff Corporation. All Rights Reserved.
3
R N A - s e q とは
メッセンジャーRNA（mRNA）をキャプチャして次世代
シーケンサでシーケンシングする⼿法
• リファレンスゲノムがある⽣物種の場合：
– 既知遺伝⼦にマッピングする
– リファレンスゲノムにマッピングして遺伝⼦構造を同定する
• リファレンスゲノムがない⽣物種の場合：
– アセンブリングして転写物構造を予測し、それに対してマッピングする
– 近いゲノムのリファレンスゲノムにマッピングする

R N A - s e q 解析でできること
• 発現量の定量・⽐較
• 新規転写物・新規スプライシングバリアントの探索
• 融合遺伝⼦の検出
4
RNA-seqがマイクロアレイと⽐較して優れている点
• 新規転写物や融合遺伝⼦が検出可
• SNV・small Indelも検出可
• プローブの設計を必要としない（⾮モデル⽣物にも対応可）

5
解析フロー
⽣の
リードデータ
クリーニングした
リードデータ
マッピング結果
ジャンクション
情報
転写物情報
発現レベル
情報
コンセンサス
転写物
グラフ画像
融合遺伝⼦
検出
⽐較結果
リードQC
融合遺伝⼦
予測
視覚化
発現レベル予測
コンセンサス
転写物予測
マッピング・
転写構造予測
転写構造・発現レベル⽐較
既知転写物と⽐較
新規転写物
候補
マッピング
チェック結果
マッピングチェック・カバレージチェック
平均カバレージ
チェック結果
SNP/InDel
検出結果
SNP/InDel検出
Copyright © Amelieff Corporation All Rights Reserved.

上記はほんの⼀部
⽇々、多くのソフトが公開されている
6
R N A - S e q 解析ソフト
QC
• cutadapt
• FastQC
• FastX-toolkit
• HTseq
• prinseq
:
多くのツールは公開されているフリーソフトであり、LinuxというOSで動作する
アライメント
• bowtie
• bwa
• SOAP
• STAR
• Tophat
:
発現定量/⽐較
• Cufflinks
• DESeq
• DEGSeq
• EdgeR
• ERANGE
:
融合遺伝⼦検出
• BreakDancer
• FusionCatcher
• SOAPfusion
• deFuse
• Tophat-Fusion
:
※Rなど、WindowsやMacでも動くものもある

7
L i n u x とは
UNIX互換のサーバー向けOS（オペレーティングシステム）
つまり、多⼈数で同時に利⽤し、常時稼働していることを想定したコンピューター
UNIXは権利問題などで、⼀般⼈の⼿の届かない存在となったため、Linus⽒がUNIXを
参考にして、PCで動く独⾃OSを開発
Linux
⼤多数の解析ツールを使⽤することができる
新しいツールが出た時、すぐ⾃分で試せる
次世代シーケンシンスデータのように、⼤
きなデータは、Excel等で⾒る事が難しい
⾃分の思い通りにデータの可視化や加⼯ができる
バイオインフォマティクスで使⽤する解析ツールの
多くは、Linux⽤に作成されている
「Primerを数百個作りたい」「数万個の配列がどの遺伝⼦に当たるの
か確認したい」という時、同じ作業を何度も繰り返す事は、難しい
繰り返し作業を⾃動化する事ができる
⼤量データの扱い
繰り返し操作の簡易化
解析ツールの問題

8
L i n u x とは
Linuxにはさまざまなディストリビューション（配布形式）がある
Debian系・・・Ubuntuなど
Red Hat系・・・Red Hat Enterprise Linux（商⽤）、CentOS（無償）など
⾒た⽬やパッケージ管理形式が異なるが、基本的な操作コマンドは同じ
解析サーバにCentOSをお奨めする理由
• 更新⽅針が保守的で、アップデートが頻発しない
• 枯れた技術を使っていて、安定している
弊社販売の
解析サーバで
使⽤

9
⽣データ → クオリティコントロール → マッピング→発現定量
R N A - s e q 解析 : クオリティコントロール
サンプルや調整⽅法、シーケンサの特徴にあわせて
クリーニング項⽬や条件を⼯夫しています。
塩
基
ク
オ
リ
テ
ィ
0
40
5ʻリード上のポジション3ʼ

10
• TopHatの使い方を確認
$ tophat
R N A - s e q 解析：マッピング
スプライシングを考慮して、マッピングするため、
既知の遺伝⼦情報を使⽤することもできます。

11
• マッピング
$ tophat -o SMAPLE -g 3 –G /path/to/genes.gtf ¥
/path/to/Bowtie2Index/genome SAMPLE_clean_1.fastq ¥
SAMPLE_clean_2.fastq
$ ls SAMPLE
R N A - s e q 解析：マッピング
BAMとインデックス、
BEDなどが作成されます。

12
ポイント） T o p H a t のアルゴリズム
1. リードをペアエンドでリファレンスに
マッピングする。
2. マッピングできなかったリードを断
片化して、リファレンスにマッピング
する。
3. マッピング結果をもとに、転写構造
をアセンブリングする。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19289445http://en.wikipedia.org/wiki/File:RNA-seq-alignment.png

13
• Cufflinksの使い⽅を確認
R N A - s e q 解析：発現定量
$ cufflinks
アセンブルのガイドとして既知の遺伝⼦情報を
使⽤することもできます。

14
• 発現量を計算
$ cufflinks -o SAMPLE SAMPL/accepted_hits.bam ¥
–g /path/to/genes.gtf –M /path/to/mask.gtf
$ ll –h SAMPLE fpkm_trackingファイル
が作成されます。

15
$ less SAMPL/genes.fpkm_tracking
4列⽬がGene ID、
10列⽬がFPKMです。
• 発現量を計算

16
⻑い遺伝⼦ほど、マップされるリードは多くなる（遺伝⼦間のバイアス）
サンプル量の多いランほど、マップされるリードは多くなる（ラン間のバイアス）
・発現量としてよく使われる指標
RPKM（Reads Per Kilobase per Million mapped reads）
FPKM（Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped fragments）
どちらも、発現量をエクソン⻑と全マッピング数で補正した値
FPKM = raw counts×
1,000,000
all reads
×
1,000
gene length
ポイント）発現量
遺伝⼦の発現量 ≠ 遺伝⼦上にマップされたリード数
これらのバイアスを補正してから発現量を⽐較する必要があります

17
解析フロー
⽣の
リードデータ
リードデータ
マッピング結果
ジャンクション
情報
転写物情報
発現レベル
情報
コンセンサス
転写物
グラフ画像
融合遺伝⼦
検出
⽐較結果
リードQC
融合遺伝⼦
予測
視覚化
発現レベル予測
コンセンサス
転写物予測
マッピング・
転写構造予測
転写構造・発現レベル⽐較
既知転写物と⽐較
新規転写物
候補
マッピング
チェック結果
マッピングチェック・カバレージチェック
平均カバレージ
チェック結果
SNP/InDel
検出結果
SNP/InDel検出

本⽇のテーマ
• RNA-seq解析
• 融合遺伝⼦解析

融合遺伝⼦とは
• 染⾊体の挿⼊・逆位・転座などの組換えの結果、２つの遺伝⼦が
融合して⽣じる遺伝⼦
• がんなどにおけるゲノム・遺伝⼦異常の⼀種
exon exon exon
Gene A
exon exon exon
Gene B
exon exon exon exon
join
Fusion Gene

20
• 腫瘍のドライバーとなったり、分⼦標的治療のターゲットとなる
など、がんなどの疾患との関連が注⽬されている
– ヒト21番染⾊体上のTMPRESS2遺伝⼦とERG遺伝⼦から⽣じる融合
遺伝⼦TMPRESS2-ERGは、前⽴腺がんとの関連が報告されている
Tomlins SA et al., Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription
factor genes in prostate cancer. Science. 2005;310(5748):644–8.
– RET-ROS1融合遺伝⼦は肺腺がんの分⼦標的治療のターゲットである
Takeuchi K, Soda M, Togashi Y, et al. RET, ROS1 and ALK fusions in
lung cancer. Nat Med 2012;18:378-81.
融合遺伝⼦とは

融合遺伝⼦関連論⽂
⽪膚ガンの原因遺伝⼦を特定
AYA世代の⽩⾎病で複数の新規の融合癌遺伝⼦を同定
Cancer Res. 2015 Nov 1;75(21):4458-65.
Nat Genet. 2016 May;48(5):569-74.
近年、NGSを⽤いた融合遺伝⼦の研究が盛んに⾏われている

22
ChimeraScan FusionSeq TopHat-Fusion
deFuse SOAP-Fusion PRADA
FusionMap STAR-Fusion :
⽇々、多くのソフトが公開されているが
golden standardと呼べるものはまだない
ソフトウェア論⽂被引⽤数
Chimerascan
ChimeraScan: a tool for identifying chimeric
transcription in sequencing data, Bioinformatics, 2011
107
deFuse
deFuse: an algorithm for gene fusion discovery in
tumor RNA-Seq data, PLoS Comput Biol, 2011
215
TopHat-Fusion
TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel
fusion transcripts, Genome Biol, 2011
226
融合遺伝⼦検出ソフト

公開データを⽤いた検証
本論⽂のデータを⽤いて融合遺伝⼦の検出を、TopHat-
FusionおよびChimerascanで検証した

検証に⽤いた公開データ
• サンプル：ヒト乳がんの細胞株5種類
• シーケンシング：Illumina Genome Analyzer IIx, paired-end
# ID 細胞株リード⻑リード数
1 SRR064286 MCF-7 50bp 12,805,674
2 SRR064287 KPL-4 50bp 10,199,593
3 SRR064437 normal breast 56bp 11,134,621
4
SRR064438
BT-474
50bp 27,030,264
SRR064439 50bp 15,830,764
5
SRR064440
SK-BR-3
50bp 18,096,704
SRR064441 50bp 18,194,304
Edgren et al., Genome Biology, 2011

25
検証の対象とした融合遺伝⼦
27個の
融合遺伝⼦
Edgren et al., Genome Biology, 2011

融合遺伝⼦解析の流れ
⽣の
リードデータ
リードデータ
融合遺伝⼦候補
リードQC
マッピング
フィルタリング

27
クリーニング前後のクオリティ⽐較
• クオリティスコアの低いリードを除去
• クリーニング前後のリード配列をFastQCでチェック
塩
基
ク
オ
リ
テ
ィ
0
40
5ʻリード上のポジション3ʼ

T o p H a t - F u s i o n 解析フロー
クリーニングしたリードデータ
融合遺伝⼦候補
マップされたリードマップされなかったリード
ブレイクポイントの探索
マッピング
フィルタリング
Supporting リードの情報

29
ブレイクポイントの探索
• マッピングされなかった
リードをセグメントに分割
↓
• 分割されたセグメントから
ブレイクポイントを探索
Kim et al., Genome Biology, 2011

30
T o p H a t - F u s i o n の実⾏
• クリーニング後のFASTQファイルから融合遺伝⼦を検出する
$ tophat -o tophat_SAMPLE -p 8 --fusion-search ¥
--keep-fasta-order --no-coverage-search ¥
--mate-std-dev 80 --max-intron-length 100000 ¥
--fusion-min-dist 100000 --fusion-anchor-length 13 ¥
--fusion-ignore-chromosomes chrM ¥
/path/to/bowtie2_index/hg19 SAMPLE_1.fastq SAMPLE_2.fastq
--keep-fasta-order = In order to sort alignments in the same order in the genome fasta file.
--no-coverage-search = Disables the coverage based search for junctions.
--mate-std-dev = The standard deviation for the distribution on inner distances between mate pairs.
--max-intron-length = The maximum intron length.
--fusion-min-dist = Minimum distance for intra-chromosomal fusions.
--fusion-anchor-length = Minimum anchor length of supporting read.
--fusion-ignore-chromosomes = Ignore some chromosomes such as chrM.

• 出⼒結果（fusion.out）では、多数の融合遺伝⼦候補が検出される
31
T o p H a t - F u s i o n の実⾏結果
# ID 細胞株検出候補数
1 SRR064286 MCF-7 59,713
2 SRR064287 KPL-4 46,195
3 SRR064437 normal breast 34,032
4
SRR064438
BT-474
69,008
SRR064439 58,525
5
SRR064440
SK-BR-3
56,852
SRR064441 52,760

32
T o p H a t - F u s i o n のフィルタリング
• 出⼒結果（fusion.out）からフィルタリングを⾏う
– BLAST検索の結果をフィルタリングに⽤いるため、BLASTの
データベースをダウンロードしておく必要がある。
– フィルタリングではBowtie1とインデックスファイルを⽤意し
ておく必要がある。
$ tophat-fusion-post -p 8 --num-fusion-reads 1 ¥
--num-fusion-pairs 2 --num-fusion-both 3
/path/to/bowtie_index/hg19
--num-fusion-reads = Fusions with at least this many supporting reads.
--num-fusion-pairs = Fusions with at least this many supporting pairs.
--num-fusion-both = The sum of supporting reads and pairs.

33
フィルタリング結果
フィルタリングにより、数個〜数⼗個の融合遺伝⼦に絞りこまれた
# ID 細胞株検出数
1 SRR064286 MCF-7 12
2 SRR064287 KPL-4 4
3 SRR064437 normal breast 1
4
SRR064438
BT-474 34
SRR064439
5
SRR064440
SK-BR-3 21
SRR064441

他ソフトウェアとの⽐較
TopHat-Fusion Chimerascan
総検出数 72 335
既知融合遺伝⼦の検出数 17 21
既知融合遺伝⼦数 27
ソフトウェア論⽂被引⽤数
Chimerascan
ChimeraScan: a tool for identifying chimeric
transcription in sequencing data, Bioinformatics, 2011
107
TopHat-Fusion
TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel
fusion transcripts, Genome Biol, 2011
226
Chimerascanの⽅が既知融合遺伝⼦の検出数は多い

35
検出結果の⽐較
Sample 5' gene 5' chr 3' gene 3' chr TopHat-Fusion Chimerascan
BT-474
ACACA 17 STAC2 17 ● ●
RPS6KB1 17 SNF8 17 ● ●
VAPB 20 IKZF3 17 ● ●
ZMYND8 20 CEP250 20 ● ●
RAB22A 20 MYO9B 19 ●
SKA2 17 MYO19 17 ● ●
DIDO1 20 KIAA0406 20 ●
STARD3 17 DOK5 20 ●
LAMP1 13 MCF2L 13
GLB1 3 CMTM7 3 ● ●
CPNE1 20 PI3 20
KPL-4
BSG 19 NFIX 19 ● ●
PPP1R12A 12 10-Sep 2 ● ●
NOTCH1 9 NUP214 9 ●
MCF-7
BCAS4 20 BCAS3 17 ● ●
ARFGEF2 20 SULF2 20 ● ●
RPS6KB1 17 TMEM49 17 ●
SK-BR-3
TATDN1 8 GSDMB 17 ● ●
CSE1L 20 ENSG00000236127 20
RARA 17 PKIA 8 ● ●
ANKHD1 5 PCDH1 5 ● ●
CCDC85C 14 SETD3 14 ●
SUMF1 3 LRRFIP2 3 ● ●
WDR67 8 ZNF704 8 ●
CYTH1 17 EIF3H 8 ● ●
DHX35 20 ITCH 20 ●
NFS1 20 PREX1 20
両ソフトで検出 15
TopHat-Fusionのみ 2
Chimerascanのみ 6
両ソフトで検出なし 4
正常サンプルでの検出数
TopHat-Fusion 1
Chimerascan 27
Chimerascanの⽅が
既知融合遺伝⼦の検出
数は多いが、正常サン
プルでの検出数も多い

融合遺伝⼦のデータベースの紹介
• ChimerDB (http://biome.ewha.ac.kr:8080/FusionGene/)
– Sanger CGP, OMIM, PubMedなどの公開情報をまとめたデータ
ベース
検出した融合遺伝⼦と照合することで、既知の融合遺伝⼦の情報をア
ノテーションすることができる

アノテーション結果
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
MCF7 BCAS4 chr20 49411707 BCAS3 chr17 59430946 7 2 9 B
SK-BR-3 TATDN1 chr8 125551265 GSDMB chr17 38066176 125 21 151 -
(1) 融合遺伝⼦が検出されたサンプル名
(2) 融合遺伝⼦の左側の遺伝⼦名
(3) 左側の遺伝⼦がある染⾊体番号
(4) 左側の遺伝⼦のポジション
(5) 融合遺伝⼦の右側の遺伝⼦名
(6) 右側の遺伝⼦がある染⾊体番号
(7) 右側の遺伝⼦のポジション
(8) ブレイクポイント上のリード数
(9) ブレイクポイントを挟むペア数
(10) ⽚側のリードが融合遺伝⼦上にあるペア数
(11)chimerDBのアノテーション（A,B,Cの信頼性クラスで⽰される）

融合遺伝⼦のデータベースの紹介
http://54.84.12.177/PanCanFusV2/
• TCGA Fusion gene
Data Portal
– がんに関連する融
合遺伝⼦の情報を
検索できるサイト
遺伝⼦別や疾患別に検索
することが可能

受託解析サービス：融合遺伝⼦解析

フリーソフトではじめるNGS融合遺伝子解析入門

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

Similaire à フリーソフトではじめるNGS融合遺伝子解析入門

Similaire à フリーソフトではじめるNGS融合遺伝子解析入門 (13)

フリーソフトではじめるNGS融合遺伝子解析入門