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Técnicas de Sequenciamento e Aplicações

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Ana Paula Mendes Silva
Ana Paula Mendes Silva

O documento discute técnicas de sequenciamento de DNA e suas aplicações. Apresenta os objetivos do minicurso, o dogma central da biologia molecular, métodos de sequenciamento como o de Sanger, e plataformas atuais como Illumina, Ion Torrent, SOLiD e suas características. Inclui também estudos de caso sobre doenças genéticas e identificação criminal por DNA.

Sciences
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TÉCNICAS DE SEQUENCIAMENTO E APLICAÇÕES Lucélia Silva Barroso Bacharel em Fisioterapia – FAP Laboratório de Microbiologia – HC – UFMG Membro do LINC – INCT MM – FM - UFMG ljesus@ufmg.br Ana Paula Mendes Silva Bacharel em Ciências Biológicas – UFV Mestre em Genética – USP Doutoranda em Medicina Molecular – UFMG apmendes@ufmg.br
Objetivos do Minicurso • Definir o que é sequenciamento; • Quais as aplicações dessa técnica; • Quais as Plataformas disponíveis; • Diferenças metodológicas, • Vantagens e desvantagens. • Perspectivas futuras
DOGMA CENTRAL DNA mRNA Proteínas Variação Normal ou Patológica
Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina Cromatina mRNA ncRNA Proteínas Epigenômica Ambiente Variação Normal ou Patológica Genômica Transcritômica Proteômica DOGMA CENTRAL
Sequenciamento de DNA • Processo de determinação da ordem precisa de nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras moléculas; • Determina a ordem das bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila, • Visa o entendimento do dogma central e a previsão das moléculas possivelmente formadas a partir de determinada sequência.
Objetivos para sequenciamento genômico Exemplo Sequenciamento de novo Sequenciamento genômico Sequenciamento de >1000 genomas de influenza DNA de org. extinto Homo neanderthalenses Metagenômica Intestino humano Resequencia-mento Genomas completos Indivíduos humanos Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças Mutações somáticas Em câncer Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer
ESTUDO DE CASO 1
Esse casal de albinos poderia ter um filho com melanina (normal)?
PAI MÃE X1 X2 S1 S2 S3
ESTUDO DE CASO 2
Megaureter Família Modelo: Pai saudável, Mãe saudável, filhos gêmeos monozigóticos (um saudável e um doente)  Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
ESTUDO DE CASO 3
Estupro e assassinato 1985 Inglaterra Numa pequena cidade localizada entre montanhas estava acontecendo uma série de estupros e assassinatos de mulheres  Qual análise inicial poderia ser feita?  - Coleta e análise do DNA do esperma  - Comparação entre os DNAs dos espermas de cada assassinato • As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o agressor. Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do estuprador. Amabis & Martho, 1995<==?
PLATAFORMAS Genetic Analyser 3130
PCR https://www.youtube.com/watch?v=iQsu3Kz9NYo https://www.youtube.com/watch?v=kvQWKcMdyS4
Gene TBX3
Gene LDB3
MÉTODO SANGER Prêmio Nobel 1980
MÉTODO DE SANGER Amplificação do fragmento alvo por PCR Purificação do produto Reação de Sequenciamento Purificação do produto Obtenção da sequência do fragmento desejado
MÉTODO DE SANGER PCR Sequenciamento
MÉTODO SANGER
MÉTODO SANGER -MANUAL- • DNA molde + dNTPs e ddNTPs + DNApolimerase + Primer • Amplificação - PCR • Eletroforese em gel de acrilamida • Os fragmentos migram distâncias proporcionais ao seu tamanho. http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line& tabela=atividades
MÉTODO SANGER Reads longos (~900bps) - Baixo Rendimento - Alto Custo -MANUAL-
MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-http:// www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Ativida des%20on-line&tabela=atividades
Normalized Fluorescence Emission (Excitation at 488 nm) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
Genomas sequenciados (outubro/2014) Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso Virus: 4127 completes, 94 em progresso Organellar: 5039 completos 195
NATURE Vol 464 1 April 2010
2001: Human Genome Project 2.7G$, 11 years 2001: Celera 100M$, 3 years 2007: 454 1M$, 3 months 2008: ABI SOLiD 60K$, 2 weeks 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2010: 5K$, a few days? 2012: 1000$, <24 hrs?
Next Gen X Sanger
2ª Geração de Sequenciamento • 454 - Pirosequenciamento (Roche) • •Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível (Illumina-Solexa) • SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems - Life)
Pirosequenciamento – 454/Roche • Comercializada em 2004 • Etapas: - Ligação de adaptadores - PCR em emulsão - Seqüenciamento
Pirosequenciamento – 454/Roche
Pirosequenciamento – 454/Roche *dNTP – só um deles
Pirosequenciamento – 454/Roche Resultado
HiSeq 2000 Illumina (Solexa)  Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias.  Custo de resequenciar um genoma humano: UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura) aproximadamente $6,000 MiSeq https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4  Sistema de pequena capacidade,  Estudo metagenômico,  PE 2x250cycles in 27hours. https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw
Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD) • SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection • Data de comercialização = 2007 • Etapas: 1) Ligação de adaptadores 2) PCR em emulsão 3) Seqüenciamento https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM
Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
4ª Geração de Sequenciamento Ion Torrent (life technologies) Tamanho do read - 200-250bp (200cycles) Não realiza leitura Paired End Sequenciamento mais rápido do mercado. Recommendações:  Amplicons (produtos de PCR),  Genomas de tamanho pequeno a médio.
Ion Proton System (life technologies) Genoma humano em 1 dia Custo de reagents por corrida - $1000 Taxa de erro em torno de 1.2% RNAseq, ChIPseq  Ion Proton Chip I – 10 Gb  Ion Proton Chip II – 100 Gb
Plataforma Tamanho do read Tempo de corrida Gb/corrida Vantagens Desvantagens SAGE 900 pb 1 – 2 dias 0.02 Read longo Alta taxa de erro 454 500 pb 8 horas 0.04 Read longo Alta taxa de erro HiSeq 75-100 2 dias 600 Sequenciamento profundo/custo Reads pequenos MiSeq 75 1 dia 2 Sequenciamento profundo/custo Reads pequenos Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de erro Reads pequenos Corrida longa Ion Torrent 200 2 horas 100 Corrida rápida Novo* Ion Proton 200 2horas 100 Corrida rápida Novo*
“ Só os que se arriscam a ir longe demais são capazes de descobrir o quão longe se pode ir. ” T. S. Eliot

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Técnicas de Sequenciamento e Aplicações

  • 1. TÉCNICAS DE SEQUENCIAMENTO E APLICAÇÕES Lucélia Silva Barroso Bacharel em Fisioterapia – FAP Laboratório de Microbiologia – HC – UFMG Membro do LINC – INCT MM – FM - UFMG ljesus@ufmg.br Ana Paula Mendes Silva Bacharel em Ciências Biológicas – UFV Mestre em Genética – USP Doutoranda em Medicina Molecular – UFMG apmendes@ufmg.br
  • 2. Objetivos do Minicurso • Definir o que é sequenciamento; • Quais as aplicações dessa técnica; • Quais as Plataformas disponíveis; • Diferenças metodológicas, • Vantagens e desvantagens. • Perspectivas futuras
  • 3. DOGMA CENTRAL DNA mRNA Proteínas Variação Normal ou Patológica
  • 4. Variação em seqüência Variação estrutural Variação química na cromatina Cromatina mRNA ncRNA Proteínas Epigenômica Ambiente Variação Normal ou Patológica Genômica Transcritômica Proteômica DOGMA CENTRAL
  • 5. Sequenciamento de DNA • Processo de determinação da ordem precisa de nucleotídeos na molécula de DNA, RNA e outras moléculas; • Determina a ordem das bases nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina, Timina e Uracila, • Visa o entendimento do dogma central e a previsão das moléculas possivelmente formadas a partir de determinada sequência.
  • 6. Objetivos para sequenciamento genômico Exemplo Sequenciamento de novo Sequenciamento genômico Sequenciamento de >1000 genomas de influenza DNA de org. extinto Homo neanderthalenses Metagenômica Intestino humano Resequencia-mento Genomas completos Indivíduos humanos Regiões genômicas Detecção de rearranjos ou regiões associados à doenças Mutações somáticas Em câncer Transcriptoma mRNA Definir regulação da transcrição Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) RNAs não codificadores Identificar e quantificar microRNAs Epigenética Padrão de Metilação Avaliar padrão de metilação em câncer
  • 8. Esse casal de albinos poderia ter um filho com melanina (normal)?
  • 9. PAI MÃE X1 X2 S1 S2 S3
  • 11. Megaureter Família Modelo: Pai saudável, Mãe saudável, filhos gêmeos monozigóticos (um saudável e um doente)  Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
  • 12. Hipótese -> Pequenas modificações no(s) gene(s) (SNPs) que possam caracterizar o fenótipo da doença.
  • 14. Estupro e assassinato 1985 Inglaterra Numa pequena cidade localizada entre montanhas estava acontecendo uma série de estupros e assassinatos de mulheres  Qual análise inicial poderia ser feita?  - Coleta e análise do DNA do esperma  - Comparação entre os DNAs dos espermas de cada assassinato • As autoridades locais simularam uma doação de sangue -> identificar o agressor. Todos os habitantes doaram, e apenas um deles possuía o DNA igual ao do estuprador. Amabis & Martho, 1995<==?
  • 20. MÉTODO DE SANGER Amplificação do fragmento alvo por PCR Purificação do produto Reação de Sequenciamento Purificação do produto Obtenção da sequência do fragmento desejado
  • 21. MÉTODO DE SANGER PCR Sequenciamento
  • 23. MÉTODO SANGER -MANUAL- • DNA molde + dNTPs e ddNTPs + DNApolimerase + Primer • Amplificação - PCR • Eletroforese em gel de acrilamida • Os fragmentos migram distâncias proporcionais ao seu tamanho. http://www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Atividades%20on-line& tabela=atividades
  • 24. MÉTODO SANGER Reads longos (~900bps) - Baixo Rendimento - Alto Custo -MANUAL-
  • 26. MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-http:// www.ib.usp.br/microgene/index.php?pagina=atividades&idcategoria=4&categoria=Ativida des%20on-line&tabela=atividades
  • 27. Normalized Fluorescence Emission (Excitation at 488 nm) 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) MÉTODO SANGER -AUTOMÁTICO-
  • 31. Genomas sequenciados (outubro/2014) Eucariotos: 21 completes, 1701 em progresso Procariotos: 3227completo, 25252 em progresso Virus: 4127 completes, 94 em progresso Organellar: 5039 completos 195
  • 32. NATURE Vol 464 1 April 2010
  • 33. 2001: Human Genome Project 2.7G$, 11 years 2001: Celera 100M$, 3 years 2007: 454 1M$, 3 months 2008: ABI SOLiD 60K$, 2 weeks 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2010: 5K$, a few days? 2012: 1000$, <24 hrs?
  • 34. Next Gen X Sanger
  • 35. 2ª Geração de Sequenciamento • 454 - Pirosequenciamento (Roche) • •Genome Analyser - Seqüenciamento por término reversível (Illumina-Solexa) • SOLiD - Seqüenciamento por ligação de sondas (Applied Biosystems - Life)
  • 36. Pirosequenciamento – 454/Roche • Comercializada em 2004 • Etapas: - Ligação de adaptadores - PCR em emulsão - Seqüenciamento
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  • 40. Pirosequenciamento – 454/Roche *dNTP – só um deles
  • 42. HiSeq 2000 Illumina (Solexa)  Produz acima de 600Gb por corrida em 13 dias.  Custo de resequenciar um genoma humano: UNC-CH Genome Analysis Facilit - (30x cobertura) aproximadamente $6,000 MiSeq https://www.youtube.com/watch?v=l99aKKHcxC4  Sistema de pequena capacidade,  Estudo metagenômico,  PE 2x250cycles in 27hours. https://www.youtube.com/watch?v=1uZtCMY-yEw
  • 43. Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD) • SOLiD = Sequencing by Oligo Ligation and Detection • Data de comercialização = 2007 • Etapas: 1) Ligação de adaptadores 2) PCR em emulsão 3) Seqüenciamento https://www.youtube.com/watch?v=nlvyF8bFDwM
  • 44. Sequenciamento por ligação de sondas (SOLiD)
  • 45. 4ª Geração de Sequenciamento Ion Torrent (life technologies) Tamanho do read - 200-250bp (200cycles) Não realiza leitura Paired End Sequenciamento mais rápido do mercado. Recommendações:  Amplicons (produtos de PCR),  Genomas de tamanho pequeno a médio.
  • 46. Ion Proton System (life technologies) Genoma humano em 1 dia Custo de reagents por corrida - $1000 Taxa de erro em torno de 1.2% RNAseq, ChIPseq  Ion Proton Chip I – 10 Gb  Ion Proton Chip II – 100 Gb
  • 47. Plataforma Tamanho do read Tempo de corrida Gb/corrida Vantagens Desvantagens SAGE 900 pb 1 – 2 dias 0.02 Read longo Alta taxa de erro 454 500 pb 8 horas 0.04 Read longo Alta taxa de erro HiSeq 75-100 2 dias 600 Sequenciamento profundo/custo Reads pequenos MiSeq 75 1 dia 2 Sequenciamento profundo/custo Reads pequenos Solid 85 8 dias 150 Baixa taxa de erro Reads pequenos Corrida longa Ion Torrent 200 2 horas 100 Corrida rápida Novo* Ion Proton 200 2horas 100 Corrida rápida Novo*
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  • 50. “ Só os que se arriscam a ir longe demais são capazes de descobrir o quão longe se pode ir. ” T. S. Eliot