LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER OLEH NAMA: AULIDYA NURUL HABIBAH NIM: P2BA009012 KEMENTRIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN PROGRAM MAGISTER BIOLOGI PURWOKERTO 2010 DAFTAR ISI ACARA 1. ISOLASI DNA PLASMID ACARA 2. RESTRIKSI DNA PLASMID ACARA 3. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ACARA 4. TRANSFORMASI E. coli JM 109 PRAKATA Puji syukur ke hadirat Alloh SWT, sehingga penulis dapat menyusun laporan ini. laporan ini merupakan hasil praktikum tentang teknologi dalam biologi molekuler. Penulis dalam praktikum dan pembelajaran mata kuliah Biologi Sel Molekuler dibimbing oleh Dr. Hendro Pramono, M.S. dan Ir. Alice Yuniaty, M.Sc., Ph.D. Adapun informasi ilmiah yang mendukung penyusunan laporan, dihimpun dari sejumlah referensi meliputi hal-hal yang berkaitan dengan teknologi dalam biologi molekuler dan segala aspek yang berkaitan dengan hal tersebut. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada para asisten praktikum yang telah memberi pengarahan selama praktikum. Akhirnya penulis berharap semoga laporan ini bermanfaat dalam ilmu pengetahuan, khususnya di bidang biologi molekuler. Amin. Purwokerto, Februari 2010 Penulis ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID ,[object Object],LANDASAN TEORI Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri dan sel eukariotik tingkat rendah misalnya yeast. DNA plasmid mengalami duplikasi sebelum pembelahan sel inang. Plasmid biasanya digunakan dalam teknologi DNA rekombinan menggunakan E. coli sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim. Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu : a replication origin, marker yang memungkinkan adanya seleksi (biasanya gen resisten antibiotik) dan region yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al.). Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. TUJUAN Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid BAHAN DAN ALAT E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19 Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair Ampisilin QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) Tabung mikrosentrifuga Sarung tangan Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) Lemari pendingin Kamera Digital CARA KERJA DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA). Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama). QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua). ,[object Object],Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan cara isolasi DNA plasmid pUC19 yang terdapat di dalam E. coli JM 109. Isolasi tersebut dilakukan berdasarkan kit dari Qiagen (USA), yaitu QIAprep Spin Miniprep Kit. Hasil yang diperoleh dapat diketahui dengan cara elektroforesis gel agarosa. Adapun hasil dari elektroforesis gel agarosa adalah sebagai berikut : 333375188595 Gambar 2. 1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : tanda anak panah menunjukkan fragmen DNA plasmid yang diisolasi dari E. coli JM 109. Berdasarkan hasil di atas, dapat diketahui bahwa pita (fragmen) DNA plasmid yang diisolasi dari E. coli menunjukkan pita yang jelas untuk urutan terakhir dan kurang jelas untuk urutan sebelumnya. Fragmen (pita) yang kurang jelas tersebut terjadi karena adanya penggunaan komposisi larutan yang tidak sesuai. Penggunaan larutan yang tidak sesuai tersebut terjadi pada saat penambahan buffer P1 sebanyak 2 x lipat dari ketentuan kit. Penambahan buffer P1 sesuai kit adalah 250 µl sedangkan pada praktikum, ditambahkan buffer P1 sebanyak 500 µl. Setelah penambahan buffer P1, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer P2. Penambahan kedua buffer tersebut bertujuan untuk melisiskan sel. Sel yang lisis ditandai dengan berubahnya warna suspensi menjadi biru. Setelah penambahan buffer P1 dan P2, tahap selanjutnya adalah penambahan buffer N3 yang berfungsi sebagai penetral. Menurut kit yang digunakan, penambahan buffer N3 adalah 350 µl, namun pada kelompok dengan hasil pita kurang jelas, buffer N3 ditambahkan sebanyak 100 µl dikarenakan tidak cukupnya tabung yang digunakan untuk menampung larutan lebih banyak. Secara umum, isolasi DNA plasmid menghasilkan DNA plasmid yang diinginkan. Jumlah pasangan basa DNA plasmid dapat diketahui melalui perhitungan dengan Excel, yang menghasilkan tabel berikut ini : Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi bp markerjarak markerlog 10bpunknown distancem*distancey valueunknown bpNo. Sumuran23130134,36417634-1,0543,694897,78819429416253,97386633-1,0233,7215260,17266436557303,81670532-0,9923,7525649,36974844361403,63958632-0,9923,7525649,369748539-1,2093,5353427,677865630-0,933,8146516,283941733-1,0233,7215260,172664841-1,2713,4732971,666032941-1,2713,4732971,6660321042-1,3023,4422766,94164511 Keterangan : DNA plasmid hasil isolasi terdapat pada sumuran no. 10 dan 11. Jumlah pasangan basa DNA plasmid dari hasil isolasi DNA sesuai tabel di atas adalah 2.971,67 bp untuk sumuran no.10 yang menghasilkan pita kurang jelas dan 2766,94 bp untuk sumuran no. 11 yang menghasilkan pita jelas. Dibandingkan dengan fragmen (pita) yang lain yang merupakan DNA plasmid yang direstriksi, pita DNA plasmid hasil isolasi memiliki jarak yang paling jauh dari sumuran. Adapun sumuran no. 9 dengan hasil sama dengan sumuran no. 10 adalah pita dari plasmid pUC19. Berdasarkan uraian tersebut maka dapat diketahui bahwa salah satu penentu jarak pita dari sumuran adalah konformasi DNA. DNA dengan konformasi bulat akan berlari lebih cepat dibandingkan DNA linier pada saat running elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa yang dilakukan dalam praktikum bertujuan untuk mengetahui hasil isolasi DNA plasmid. Berdasarkan hasil di atas, maka dapat dinyatakan bahwa isolasi DNA plasmid berhasil untuk DNA plasmid yang di running dengan sumuran no. 11. Isolasi DNA plasmid yang dilakukan menggunakan prosedur sesuai dengan QIAprep Spin Miniprep Kit. Kit tersebut diproduksi oleh Qiagen dan terdapat kit prosedur isolasi DNA plasmid yang lain (Brolle et al.,1997) , namun pada dasarnya tahapan isolasi DNA plasmid memiliki langkah – langkah sebagai berikut : inokulasi sel bakteri yang mengandung plasmid, inkubasi dalam shaker inkubator, pemanenan, penambahan buffer yang mengandung enzim pemecah (lisozim) dan dilanjutkan dengan pemanenan plasmid,. Tahapan pemanenan plasmid berdasarkan QIAprep Spin Miniprep Kit adalah : penyaringan sel yang telah lisis ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan Qiaprep spin column, penambahan buffer PB untuk mengikat plasmid pada spin column (buffer ini mengandung etanol yang berfungsi sebagai pencuci), sentrifugasi pada 13000 rpm selama 5 menit, cairan di bagian bawah dibuang, sentrifugasi kembali, pemindahan kolom ke dalam tabung, penambahan Elution Buffer (EB) untuk melewatkan plasmid dari kolom menuju tabung, sentrifugasi pada 13000 rpm selama 1 menit. Komponen yang tertampung pada tabung inilah yang merupakan DNA plasmid. ,[object Object]

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa isolasi DNA plasmid dapat dilakukan menggunakan kit yang telah tersedia, pada praktikum digunakan QIAprep Spin Miniprep Kit. Jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi dapat diketahui dengan elektroforesis gel agarosa.

Isolasi DNA yang dilakukan untuk praktikum yang akan datang sebaiknya mewakili DNA dengan konformasi linier dan DNA sirkuler sehingga dapat dibandingkan melalui elektroforesis gel agarosa.

DAFTAR REFERENSIBrolle, D. F., T. Henzler, S. Stefani, A. Weissenborn, D. Zell, and W. Wohlleben. 1997. Microbiology–Biotechnology, University of Tübingen, Germany ,[object Object],QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) Skema kerja Isolasi DNA Plasmid menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA) 25 ml LBE.coli transforman pUC19Inkubasi 370C, shaker 150 rpm, 16 jam@ 3 ml Sp dibuang+ 1 ml STEresuspensiSentrifugasi5000 rpm, 5'1Sp dibuang+ 250 µl Buffer P1Resuspensi (vortex, bolak balik+ 250 µl Buffer P2Bolak-balik sebentarWarna mjd BIRU+ 350 µl Buffer N3Bolak-balik sebentarWarna BIRU hilangSentrifugasi13.000 rpm, 1'Sp dipindahCairan dibuangSentrifugasi5.700xg (5000 rpm), 5'+ 500 µl Buffer PB+ 750 µl Buffer PESentrifugasi13.000 rpm, 1'Sentrifugasi13.000 rpm, 1'Cairan dibuanggSentrifugasi13.000 rpm, 5'Cairan dibuangSentrifugasi13.000 rpm, 1'Kolom pindah+ 50 µl Buffer EBSentrifugasi13.000 rpm, 1'DNA plasmid ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID ,[object Object],LANDASAN TEORI Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi. Enzim – enzim restriksi yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan berasal dari beberapa bakteri. Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Enzim restriksi akan mengenali sisi restriksi suatu fragmen DNA yang biasanya terdiri atas 4 – 8 pasang basa. Sisi restriksi tersebut biasanya berupa pasangan basa palindrom. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi. Sisi pengenalan enzim restriksi tersebut berbeda – beda pada suatu fragmen DNA, misalnya BamHI yang diperoleh dari Bacillus amyloliquefaciens memiliki sisi pengenalan -G-G-A-T-C-C--C-C-T-A-G-G yang akan memotong pada basa G nomor 2 dari tepi masing – masing strand (Lodish et al.), AGCT merupakan sisi pengenalan AluI, GAATTC merupakan sisi pengenalan EcoRI. Enzim restriksi akan memotong fragmen DNA di ujung yang sama pada 2 strand (blunt ended), namun biasanya enzim restriksi akan memotong pada ujung yang berbeda pada 2 strand sehingga menghasilkan sisi lengket (sticky ended). Pemilihan enzim restriksi untuk pemotongan fragmen DNA pada suatu teknologi DNA rekombinan didasarkan pada beberapa hal, yaitu : ukuran fragmen, blunt-ended atau sticky-ended fragment, sensitivitas terhadap metilasi, kompatibiliti terhadap kondisi reaksi. Enzim restriksi dengan sekuens pengenal lebih pendek akan menghasilkan lebih banyak potongan fragmen DNA. Sticky ended biasanya lebih efisien dalam ligasi sedangkan blunt ended biasanya dikenali oleh enzi khusus yang cocok dengan tipe pemotongan blunt ended. Metilasi biasanya terjadi pada DNA mahluk hidup dan bervariasi polanya sehingga dibutuhkan enzim restriksi yang cocok untuk DNA yang mengalami metilasi dengan pola tertentu. Apabila terdapat 2 enzim yang cocok untuk suatu reaksi yang sama maka kedua enzim ini dapat ditambahkan pada reaksi dengan reaksi bufer dan suhu yang sama (Anonim, 2007). Komponen reaksi (master mix)restriksi terdiri dari : air, DNA, buffer dan enzim. Volume akhir untuk komponen reaksi biasanya 10 – 50 µL. Volume di bawah 10 µL tidak dianjurkan karena memiliki kemungkinan yang sangat besar untuk terjadinya kesalahan pipeting. Komponen enzim ditambahkan terakhir pada saat pembuatan master mix (Anonim, 2007). TUJUAN Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid BAHAN DAN ALAT Plasmid pUC19 Enzim restriski (PstI) Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) Tabung mikrosentrifuga Sarung tangan Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea) termometer Lemari pendingin (Frezeer) Kamera Digital CARA KERJA Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi. Tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 0C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath). tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 0C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Freezer. ,[object Object],Restriksi DNA plasmid dilakukan menggunakan beberapa enzim restriksi yaitu : HindIII, EcoRI, PstI. Hasil dari pemotongan DNA plasmid tersebut dapat dilihat melalui elektroforesis gel agarosa. Adapun hasil dari elektroforesis gel agarosa adalah sebagai berikut: 8765432333375188595Gambar 2.1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : nomor menunjukkan nomor sumuran Berdasarkan hasil di atas, dapat diketahui bahwa pita (fragmen) DNA plasmid yang direstriksi (ditunjukkan oleh anak panah) menghasilkan pita-pita yang jelas, kecuali sumuran no. 6. Hal ini terjadi kemungkinan karena pita DNA pada sumuran no. 6 belum terpotong dengan baik sebelum di running dengan eletroforesis gel agarosa. Sumuran no. 1 menghasilkan beberapa pita karena sumuran ini merupakan marker yang merupakan DNA λ dengan HindIII. Jumlah pasangan basa DNA plasmid yang telah direstriksi dapat diketahui melalui perhitungan dengan Excel, yang menghasilkan tabel berikut ini : Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil isolasi bp markerjarak markerlog 10bpunknown distancem*distancey valueunknown bpNo. Sumuran/ enzim restriksi23130134,36417634-1,0543,694897,7881942/HindIII9416253,97386633-1,0233,7215260,1726643/EcoRI6557303,81670532-0,9923,7525649,3697484/PstI4361403,63958632-0,9923,7525649,3697485/HindIII39-1,2093,5353427,6778656/EcoRI30-0,933,8146516,2839417/PstI33-1,0233,7215260,1726648/HindIII41-1,2713,4732971,666032941-1,2713,4732971,6660321042-1,3023,4422766,94164511 Keterangan : DNA plasmid hasil isolasi terdapat pada sumuran no. 10 dan 11. Jumlah pasangan basa DNA plasmid yang telah direstriksi sesuai tabel di atas adalah 4897,79 bp untuk DNA plasmid yang dipotong dengan enzim restriksi HindIII, 5260,17 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan EcoR1, 5649,37 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan PstI, 5649,37 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan HindIII, 3427,68 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan EcoRI 6516,28 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan PstI, 5260,17 bp untuk DNA plasmid yang direstriksi menggunakan HindIII. Menurut Anonim (2007), jumlah basa enzim restriksi mempengaruhi jumlah pasangan basa hasil restriksi, enzim restriksi dengan 6 bp akan menghasilkan fragmen dengan ukuran rata – rata 4096 basa. EcoRI merupakan enzim restriksi dengan 6 bp sehingga menghasilkan fragmen DNA dengan ukuran sekitar 3000 – 5000 bp pada praktikum. Sumuran no. 9, 10, dan 11 digunakan untuk me-running DNA plasmid pUC19 dan DNA plasmid hasil isolasi. Dibandingkan dengan fragmen (pita) yang lain yang merupakan DNA plasmid yang direstriksi, pita DNA plasmid yang direstriksi memiliki jarak yang lebih dekat dari sumuran dibandingkan dengan pita DNA plasmid hasil isolasi. Hal ini menunjukkan bahwa konformasi linier dari DNA memiliki kemampuan running lebih lambat dibandingkan dengan pita DNA sirkuler dalam praktikum ini adalah DNA plasmid. Jumlah pasangan basa juga menentukkan jarak pita DNA dari sumuran. Jarak pita DNA dari sumuran menunjukkan kecepatan DNA pada saat dirunning. Hal tersebut menjelaskan bahwa kecepatan DNA pada saat dirunning dipengaruhi oleh konformasi dan jumlah pasangan basanya. Adapun sumuran no. 9 dengan hasil sama dengan sumuran no. 10 adalah pita dari plasmid pUC19. Berdasarkan uraian tersebut maka dapat diketahui bahwa salah satu penentu jarak pita dari sumuran adalah konformasi DNA. DNA dengan konformasi sirkuler akan berlari lebih cepat dibandingkan DNA linier pada saat running elektroforesis gel agarosa. Elektroforesis gel agarosa yang dilakukan dalam praktikum bertujuan untuk mengetahui pita DNA hasil restriksi. Restriksi DNA plasmid pUC19 dilakukan dengan beberapa tahapan. Tahapan yang pertama adalah pembuatan larutan untuk optimasi reaksi pemotongan DNA menurut Promega (2005) dengan modifikasi (Lampiran 1.). Komposisi larutan tersebut adalah ddH2O, Buffer E, BSA, DNA pUC19, enzim restriksi. Volume larutan final tersebut adalah 25 µl, sedangkan volume ddH2O relatif terhadap komposisi komponen yang lain. Larutan optimasi dibuat dengan cara memipet satu persatu larutan tersebut dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml dengan cara menempelkan tip mikropipet yang digunakan untuk mengambil komponen larutan pada dinding tabung. Setelah larutan optimasi dibuat tahapan selanjutnya adalah tabung dispin dengan tujuan agar larutan yang menempel pada dinding tabung jatuh ke tengah tabung. Kemudian tabung diketuk-ketuk. Tahapan selanjutnya adalah inkubasi pada suhu 37 oC selama 4 jam. Suhu tersebut merupakan suhu optimum enzim bekerja. Pada saat inkubasi ini, enzim restriksi bekerja memotong DNA plasmid yang memiliki konformasi sirkuler menjadi linier. Kemudian enzim ini diinaktivasi dengan cara menginkubasi tabung tersebut pada suhu 70 oC selama 10 menit. Tahapan terakhir adalah penyimpanan di freezer. ,[object Object]

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa restriksi DNA plasmid dapat dilakukan menggunakan beberapa enzim restriksi,diantara HindIII, EcoR1, dan PstI. Jumlah pasangan basa DNA plasmid hasil restriksi dapat diketahui dengan elektroforesis gel agarosa.

Restriksi DNA yang dilakukan untuk praktikum yang akan datang sebaiknya dapat menggunakan enzim-enzim restriksi yang lainnya.

Anonim. http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0301/1017317_QN301_ITJPDIS-3-5.pdf. Diakses pada tanggal 9 Februari 2010.

Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. Molecular Cell Biology fifth Edition.

Promega. 2005Lampiran 3. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005) No.KomponenP1P2P31.ddH2O22,5 µl22,5 µl22,5 µl2.Buffer E5 µl5 µl5 µl3.BSA0,5 µl0,5 µl0,5 µl4.DNApUC1920 µl20 µl20 µl5.PstI2 µl--6.EcoR1-2 µl-7.HindIII--2 µlJumlah50 µl50 µl50 µl 1234567 P1P2 P3 Simpan di frezerSpin sebentar, 2” Ketuk-ketuk Inaktifasi, suhu 700C dg waterbath, 10 menitInkubasi 37 0C, dg Water bath selama 4 jam ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA ,[object Object],LANDASAN TEORI Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp). Elektroforesis gel agarosa biasanya digunaka untuk analisis ukuran dan konformasi sampel DNA, kuantifikasi DNA, pemisahan dan ekstraksi fragmen DNA (Anonim, 2010). Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. TUJUAN Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa BAHAN DAN ALAT DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII Sampel DNA, misalnya : DNA kromosom bakteri, DNA plasmid hasil isolasi (uncut) DNA plasmid hasil restriksi (cut) Agarosa Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml) Akuades Gelas Ukur 1000 ml Labu Erlenmeyer 50 ml Tabung mikrosentrifuga Sarung tangan Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) Kertas parafilm seperangkat alat elektroforesis Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM) larutan Etidium Bromid (EtBr) UV transluminator Kaca mata UV kamera digital CARA KERJA Buat 250 ml larutan buffer TAE 1x dengan cara mencamnpurkan 5 ml TAE 50x ke dalam 245 ml akuades. Buat gel agarosa 1% dengan cara menimbang agarosa 0,2 g untuk dilarutkan ke dalam bufer TAE 1x hingga volume 20 ml. Larutan agarosa dididihkan hingga larut sempurna. Siapkan baki gel agarosa, lekatkan selotip di tiap ujung baki gel agarosa (pastikan bahwa selotip melekat kuat dan tidak ada lubang pada masing-masing ujung baki) Pasang sisir elektroforesis di salah satu ujung baki gel agarosa dengan posisi hampir menyentuh dasar baki Periksalah suhu larutan agarosa dengan cara menempelkan erlenmeyer ke tangan, jika suhunya sudah turun hingga sekitar 50-60 0C, tambahkan 1 µl etidium bromid (PERINGATAN KERAS!!, gunakan sarung tangan karena bersifat karsinogenik). Larutan agarosa dihomogenkan sebentar, kemudian tuangkan larutan ke dalam baki gel agarosa, biarkan hingga larutan berubah menjadi gel yang padat. ambil sisir dengan hati-hati, lepaskan selotip dari ujung-ujung baki. masukkan baki yang telah berisi gel agarosa ke dalam tangki elektroforesis yang telah diisi dengan larutan bufer TAE 1x (pastikan bahwa gel terendam seluruhnya dalam TAE). siapkan sekitar 5 cm kertas parafilm di dekat tangki elektroforesis. masukkan 10 µl sampel DNA dan 2 µl loading dye 6x ke dalam sumuran gel agarosa dengan cara mencampurkan kedua bahan tersebut terlebih dahulu secara merata pada kertas parafilm menggunakan mikropipet. buatlah catatan mengenai nomor sumuran dan jenis sampel DNA yang dimasukkan. hubungkan kabel dari sumber arus ke tangki elektroforesis (pastikan bahwa kabel yang tersambung ke kutub negatif berada di dekat sumuran; jika tidak demikian, ubahlah posisi baki/gel ke arah sebaliknya). nyalakan sumber arus, aturlah voltase dan waktu running hingga diperoleh angka 70 V dan 45 menit dengan cara menekan tombol yang sesuai pada sumber arus. jalankan elektroforesis (lakukan running) dengan cara menekan tombol run pada sumber arus. elektroforesis akan berhenti apabila waktu yang ditetapkan sudah habis, yang ditandai oleh adanya bunyi alarm. Matikan sumber arus dan angkatlah baki dari tangki elektroforesis. keluarkan gel dan letakkan di atas UV transluminator (letakkan selubung kaca hitam di atas UV transluminator). nyalakan UV transluminator, amati pita-pita DNA yang tervisualisasi. ,[object Object],Elektroforesis gel agarosa dilakukan menggunakan DNA plasmid pUC19 hasil restriksi dengan beberapa enzim restriksi, yaitu : HindIII, EcoR1, dan PstI dan DNA plasmid pUC19 hasil isolasi. Beberapa DNA tersebut dirunning bersama dengan marker yang berupa DNA λ yang dipotong menggunakan HindIII dengan elektroforesis gel agarosa dan menghasilkan pita-pita pendaran seperti gambar berikut ini : 1110918765432333375188595Gambar 2. 1. Elektroforesis gel agarosa. Keterangan : nomor menunjukkan nomor sumuran Berdasarkan hasil di atas, dapat diketahui bahwa pita (fragmen) DNA plasmid yang direstriksi menghasilkan pita-pita yang jelas, kecuali sumuran no. 6. Hal ini terjadi kemungkinan karena pita DNA pada sumuran no. 6 belum terpotong dengan baik sebelum di running dengan eletroforesis gel agarosa. Sumuran no. 1 menghasilkan beberapa pita karena sumuran ini merupakan marker yang merupakan DNA λ dengan HindIII. Sumuran ke-2 sampai dengan ke-8 adalah DNA plasmid yang dipotong dengan beberapa enzim restriksi yang berbeda untuk tiap sumuran. Sumuran ke-9 sampai dengan ke-11 adalah DNA plasmid hasil isolasi. Berdasarkan gambar 2.1, dapat dinyatakan bahwa DNA dengan konformasi linier akan lebih lambat runningnya dibandingkan dengan DNA plasmid dengan konformasi sirkuler. Selain itu, kecepatan running DNA juga ditentukan oleh jumlah basa pada fragmen DNA. Adapun hasil perhitungan jumlah basa dari DNA pada praktikum disajikan pada tabel 2.1 berikut ini : Tabel 2.1. Tabel jumlah pasangan basa DNA hasil elektroforesis gel agarosa bp markerjarak markerlog 10bpunknown distancem*distancey valueunknown bpNo. Sumuran23130134,36417634-1,0543,694897,78819429416253,97386633-1,0233,7215260,17266436557303,81670532-0,9923,7525649,36974844361403,63958632-0,9923,7525649,369748539-1,2093,5353427,677865630-0,933,8146516,283941733-1,0233,7215260,172664841-1,2713,4732971,666032941-1,2713,4732971,6660321042-1,3023,4422766,94164511 Fragmen DNA dengan jumlah basa lebih banyak memiliki jarak dari sumuran lebih dekat dibandingkan dengan fragmen DNA dengan jumlah basa yang lebih sedikit. Hal ini menunjukkan bahwa semakin kecil ukuran pasangan basa fragmen DNA maka semakin cepat running fragmen DNA tersebut. Hal ini sesuai dengan pernyataan yang terdapat dalam The QIAGENGuide to Analytical Gels (Anonim). Elektroforesis gel agarosa pada praktikum dilakukan dengan beberapa tahapan. Tahap pertama adalah pembuatan gel agarosa dengan komposisi 0,2 gram gel agarosa dilarutkan dalamTAE 1x sehingga dihasilkan konsentrasi akhir 1 % kemudian dituang ke dalam cetakan yang telah dipasang sisir pada salah satu sisinya, setelah memadat, sisir tersebut dilepas dan gel yang terbentuk direndam dalam TAE 1x sebanyak 220 ml. Tahap ke-2 adalah menyiapkan sampel DNA yang akan dirunning. Sampel DNA tersebut dicampur dengan loading buffer terlebih dulu pada parafilm. Setelah tercampur kemudian sampel DNA tersebut dimasukkan ke dalam sumuran pada gel yang telah diletakkan di bejana bufer elektroforesis dengan larutan TAE 1x sebanyak 220 ml. Tahap ke-3 adalah running sampel DNA (power supply dihidupkan). DNA yang telah bermigrasi kemudian dilihat pada transluminator UV, tahapan ini adalah tahap terakhir pada elektroforesis gel agarosa. Pita – pita yang terbentuk diamati. ,[object Object]

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa elektroforesis gel agarosa dilakukan dengan beberapa tahapan yaitu pembuatan gel agarosa, menyiapkan sampel DNA yang akan dirunning (sampel DNA tersebut dicampur dengan loading buffer terlebih dulu pada parafilm), running sampel DNA, DNA yang telah bermigrasi kemudian dilihat pada transluminator UV.

Elektroforesis gel agarosa dilakukan dengan menggunakan sarung tangan khusus karena terdapat bahan karsinogenik pada saat praktikum.

Anonim. http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0100/Practical_Hints.pdf. Diakses pada tanggal 9 Februari 2010.ACARA IV. TRANSFORMASI SEL E. coli JM109 ,[object Object],LANDASAN TEORI Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Sel E. coli disisipi vektor DNA rekombinan yang disisipkan ke dalam plasmid. Setelah diinkubasi, sel tersebut akan memperbanyak diri sehingga jumlahnya menjadi banyak, karena fenotip strain E. coli hasil transforman mengandung plasmid dan salah satu ciri sel yang disisipi plasmid adalah resisten terhadap antibiotik (ampisilin), maka untuk mendapatkan sel transforman cukup mudah yaitu dengan menumbuhkan sel hasil transformasi pada media yang mengandung ampisilin. Strain E. coli tersebut akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Apabila vektor DNA rekombinan telah terintegrasi dengan sel inang maka sel tersebut dapat dikatakan telah ditransformasi. Transformasi merupakan hal yang penting karena menghasilkan organisme rekombinan sesuai dengan gen yang disipkan pada vektor. Teknologi ini digunakan dalam usaha memperoleh tanaman yang tahan terhadap infeksi bakteri, jamur, herbisida. Transformasi dilakukan dengan menggunakan sel kompeten. Sel kompeten merupakan sel yang memiliki kemampuan untuk disisipi DNA dari luar. E. coli biasanya digunakan sebagai sel kompeten. TUJUAN Praktikum ini bertujuan untuk melakukan transformasi pada sel E. coli BAHAN DAN ALAT strain E. coli JM 109 media LB cair media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG es batu shaker-incubator termometer Tabung mikrosentrifuga Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific) Microsentrifuga 5415D (Eppendorf) pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea) jarum ose batang drugalsky cawan Petri Erlenmeyer shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.) kamera digital. CARA KERJA Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam (semalam). Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain perbandingan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37oC. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37oC. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5). Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37oC. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama lebih kurang 30 menit. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37oC. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut Dimana, Σkoloni= jumlah koloni putih (dalam cfu) [pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng) ,[object Object]

Transformasi pada praktikum ini dilakukan dengan tujuan menyisipkan plasmid ke dalam sel. Praktikum ini menggunakan sel E. coli sebagai sel kompeten. Sel tersebut kemudian digunakan untuk transformasi yaitu disisipkannya plasmid ke dalam sel tersebut. Sel yang telah ditransformasi disebut transforman. Hasil yang diperoleh dari praktikum transformasi ini adalah koloni E. coli dalam cawan.Gambar 2.1. Koloni E. coli hasil transformasi dan koloni E. coli nontransformasi dalam cawan. ,[object Object]

Hasil yang diperoleh untuk sel transforman adalah tumbuh pada kedua cawan kultur. Pada cawan kultur dengan ampisilin dan tanpa ampisilin, koloni E. coli tumbuh dengan koloni – koloni kecil dan koloni lebar (TBUD) (Tabel 2.1.).

Tabel 2.1 Jumlah koloni sel transforman dan nontransforman pada media kultur.

Jenis selJumlah koloni pada mediaMedia +ampisilinMedia tanpa ampisilinE. coli transforman416TBUDE. coli nontransforman16TBUD

E. coli transforman dapat tumbuh di kedua media. Hal ini sesuai dengan teori yang ada. Sel tersebut mampu tumbuh pada media dengan ampisilin karena di dalam selnya terdapat plasmid. Keberadaan plasmid di dalam sel E. coli membuat sel tersebut resisten terhadap antibiotik ampisilin (Lodish et al.).

Sel nontransformasi merupakan sel yang tidak disisipi plasmid sehingga tidak dapat tumbuh pada media dengan ampisilin (Lodish et al.). Namun hasil praktikum menunjukkan bahwa sel nontransformasi tumbuh pada media dengan ampisilin dengan jumlah koloni 16. Hal ini dimungkinkan karena terjadi kontaminasi selama pengkulturan sel atau kondisi ampisilin yang tidak mencukupi pada media kultur.

Berdasarkan uraian di atas maka dapat disimpulkan bahwa transformasi yang dilakukan pada E. coli berhasil.

Pembuatan media kultur dilakukan oleh masing – masing kelompok pada praktikum sehingga terjadi kemungkinaan perbedaan tumbuhnya sel yang dikultur pada media kultur.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

En vedette

En vedette (20)

Similaire à LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER

Similaire à LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER (20)

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI SEL MOLEKULER