Aislamiento de miosina en clamar

1. Aislamiento y caracterización parcial de miosina del
manto de calamar gigante (Dosidicus gigas)
Equipo: ID:
Nahúm Misael Cuevas Obeso 00000
Bernardo Leirer Flores Burgos 00000165174
Carlos Alexis Zepeda Godoy 00000
Fotografía del calamar Dosidicus gigas.
Imagen obtenida de WildScreen

2. Generalidades
• Las miosinas son una familia
de proteínas motoras ATP-
dependientes.
• ATP asa capaz de transducir
la energía química en
movimiento.
• La miosina tipo II es la mas
estudiada.

3. Estructura
• Cabeza: Es una ATPasa activada por actina responsable de generar
movimiento
• Cuello: actúa como un engarce y como un brazo de palanca.
• Cola: es único para cada tipo de miosina y determina sus funciones
específicas en las células.

4. Propiedades
funcionales
Sus proteínas miofibrilares
presentan habilidad para formar
geles, pudiendo ser utilizado para
la elaboración de productos
gelificados.

5. Extracción
La extracción de miosina se realizó a
partir del músculo del manto de calamar
gigante D. Gigas.
Manto de
Calamar

6. Homogenizar por 1 min
con 10 volúmenes de la
solución A
Dejar en reposo por 60
min a 4°C para ser
centrifugado a 10000 g
por 15 min.
Suspender en 5
volúmenes de la
solución B y dejar
reposar durante 90
min a 4°C
Centrifugar a 10000 g
por 15 min, diluir el
sobrenadante con 10
volúm. de agua
destilada.
Mantener a 10°C
durante 60 min, después
centrifuga a 12000 g por
10 min
Resuspender el pellet en
la solución C para
dejarse en reposo 10
min 4°C
Diluir con 2,5 volúmenes
de bicarbonato de sodio
1 mM y MgCl2 10 mM
Incubar por 12 h a 4°C
Centrifugar a 22000 g
por 15 min y
resuspender en buffer
Tris-Hcl 20 mM.
Almacenar a 10°C
R Preparación
A
KCl 0,1 M, fenil metil sulfonil fluoruro 1 mM, azida
de sodio 0,01%, buffer Tris-HCl 20 mM, pH 7,5
B
KCl 0,45 M, β-mercapto-etanol 5 mM, acetato de
magnesio 0,2 M, ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil
éter)-tetracético 1 mM, buffer Tris maleato 20 mM,
pH 6,8, mezclado con ATP 10 mM
C
KCl 0,5 M, β-mercaptoetanol 5 mM, buffer Tris-HCl
20 mM, pH 7,5

7. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA
-Disolver 100 mg
Aholorante Azul Brillante
de Coomasie G-250
En etanol 95%
+
100 mL de ácido
fosfórico.
(Diluir a 1 L).
Pipetear
soluciones de
proteína que
contengan de 10-
100 mg de
proteína.
Ajustar
volumen a 0.1
mL con buffer
apropiado.
Agregar 1 ml de
reactivo de
colorante
preparado
anteriormente
(paso 1).
Mezclar en vortex y
leer absorbancia a
559nm (Después de
2 min agregar el
colorante y antes de
una hora iniciada la
reacción).

8. FUNDAMENTACIÓN
El método está basado en que el
Colorante de Azul Brillante de
Coomasie G-250 presenta dos formas
coloreadas, azul y rojo. El color rojo
pasa a azul cuando el colorante se une
a la proteína.
Pasos
1. La curva de calibración con
concentración conocida.
2. Mide la absorbancia del reactivo con
el colorante por colorimetría.
3. Estima la concentración de proteína
en la muestra problema.
Imagen obtenida de García H. & Vázquez R.
(1998)

9. Determinación de
pureza
Para determinar la pureza de la
miosina extraída, se realizó una
Electroforesis en gel de
poliacrilamida‐SDS
• Cargar 13 μg de proteína a los
geles de poliacrilamida al 8%.
• Teñir las bandas con azul de
Coomassie al 0,05% y desteñidas
en una solución de metanol al
40% y ácido acético al 7%.
• Se utiliza como marcador de
peso molecular una mezcla de
proteínas estándar de amplio
rango (Bio-Rad)

10. Fundamentación:
• El SDS desnaturaliza las
proteínas
• Elimina estructuras
secundaria y terciaria.
Electroforesis en gel
de poliacrilamida‐SDS
Sin SDS, las proteínas con
misma masa migran de forma
diferente debido a diferencias
en la proporción carga/masa.

11. Resultados
Figura 1. Perfil electroforético nativo (a) y SDS-PAGE (b) de miosina aislada
del manto de calamar (M) y estándar (STD). Los pesos moleculares se
encuentran en kDa.

12. Bibliografía
• Cameron C., Machado M. & Meza G. (2003). Las miosinas en el
movimiento celular, estructuras y propiedades cinéticas. Octubre del 2017,
de UACJ Sitio web:
http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/2003-
2_LAS_MIOSINAS_I.pdf
• García H. (2000). Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,
actualidad e importancia. Octubre del 2017, de UNIV Sitio web:
http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.pdf
• García H. & Vázquez R. (1998). Cuantificación de proteínas: una revisión.
Octubre del 2017, de Instituto de Biotecnología UNAM Sitio web:
http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_1998_2/bitacora.pdf
• Lodish, H., et al. Molecular Cell Biology, 5th ed., W. H. Freeman, 2004.
[Biología celular y molecular. (5ª ed.). Editorial médica panamericana, 2005
(2004)]

13. • Moroyoqui, W. Torres Arreola & E. Márquez-Ríos (2015). Aislamiento y
caracterización parcial de miosina del manto de calamar gigante (Dosidicus
gigas), CyTA - Journal of Food, 13:3, 392-399, DOI:
10.1080/19476337.2014.988183
• Pérez M., Soriano J., Ponce E. & Díaz L. (20015). Electroforesis en gel de
poliacrilamida‐SDS como herramienta en el estudio de las proteínas
miofibrilares. Octubre del 2017, de UAM Nacameh Sitio web:
https://dialnet.unirioja.es/descarga/articulo/6020409.pdf

14. Gracias