FLAVONOID PART II

Pengujian Flavonoid Secara KLT
• Ekstrak tanaman setelah dimaserasi dengan etanol 70%
diuji kadar flavonoidnya secara kualitatif dan sebagai
pembanding adalah kuersetin yang telah dilarutkan
dengan etanol 70%.
• Keduanya ditotolkan bersama-sama pada lempeng
kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase diam silika
gel dan fase gerak etil asetat : metanol (3:1).
• Bercak kromatogram (noda) yang dihasilkan diamati
dengan menggunakan penampak noda sinar ultraviolet
254 nm dan 366 nm, sebelum dan setelah disemprot
dengan AlCl3 5%.
• Bercak dengan flouresensi warna kuning menunjukkan
adanya flavonoid.

Contoh Hasil Uji KLT Ekstrak buah pare

Kuersetin sebagai standar penentuan kadar
flavonoid total
Kuersetin dipilih sebagai standar karena
termasuk senyawa flavonoid yang paling
efektif dalam menangkap radikal bebas
(radikal hidroksil (OH-), anion superoksida
(O2-), dan radikal peroksil (COO-) serta
mampu menghambat berbagai reaksi
oksidasi karena dapat menghasilkan radikal
fenolik yang stabil dari cincin aromatisnya

Penggunaan Pereaksi AlCl pada
Pengukuran Kadar Flavonoid Total
• Prinsip dari penggunaan pereaksi AlCl ini adalah
AlCl membentuk kompleks asam yang stabil
dengan C-4 gugus keton, lalu dengan C-3 atau C-5
gugus hidroksil dari flavon dan flavonol.
• Selain itu AlCl juga membentuk kompleks asam
yang labil dengan gugus ortodihidroksil
pada cincin A atau B dari flavonoid (Chang et
al.2002) sehingga akan mempunyai serapan
maksimum pada panjang gelombang 440 nm
yang diukur dengan spektrofotometer UV-VIS.

Penetapan Kadar Flavonoid Total
1) Preparasi Larutan Baku Kuersetin
 Pertama kali dibuat larutan induk kuersetin
1000 ppm dengan cara menimbang 0,0250 g
kuersetin dan dilarutkan dengan etanol p.a
hingga volume 25 ml.
 Selanjutnya dibuat larutan baku kerja
kuersetin dengan konsentrasi 100 ppm dengan
mengencerkan larutan induk 1000 ppm
 Kemudian dibuat larutan standar kuersetin dari
konsentrasi 100 ppm dengan deret konsentrasi 1
ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm,dan 40 ppm.

 Kemudian ditambahkan
 0,1 ml AlCl3 10% Natrium asetat 1 M 0,1 ml
dan 2,80 ml aquades steril.
 Campuran dikocok sampai homogen lalu
dibiarkan selama 30 menit.
 Kemudian siap dibaca pada spektrofotometer
Ultra violet Visible (UV-Vis) pada panjang
gelombang 440 nm .

2) Penetapan kadar Flavonoid Total
 Sampel dari ekstrak tanaman dilarutkan dengan
etanol p.a (2%-8%)
 Ditambahkan 0,1 ml AlCl3 10% Natrium asetat 1M
0,1 ml dan 2,80 ml aquades steril.
 Campuran dikocok sampai homogen lalu dibiarkan
selama 30 menit.
Kemudian diukur serapannya (Absorbansinya)
dengan spektrofotometer UV-VIS pada λ 440 nm.
 Dibuat kurva regresi linier menggunakan standar
kuersetin

Pengujian kemampuan antioksidan
dalam ekstrak tanaman
• Pengujian antioksidan dengan metode kemampuan
mereduksi ekstrak etanol tanaman menggunakan
metode Oyaizu.
• Menurut Katja, et al 2009, dalam penentuan
daya reduksi, antioksidan berfungsi sebagai
reduktor .
• Antioksidan dalam sampel akan mereduksi Fe3+
(kompleks kalium ferisianida [K3Fe(CN)6]
menjadi Fe2+ (bentuk ferro)
• Reaksi ini berdasarkan Reaksi FENTON yang terjadi
dalam tanaman maupun dalam tubuh manusia.

Reaksi Fenton
• Reaksi Fenton sebenarnya merupakan reaksi
yang normal terjadi dalam tumbuhan maupun
dalam tubuh manusia.
• Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH• + OH –
• Tetapi pada keadaan stress oksidatif Reaksi
Fenton berjalan lebih cepat sampai 4-5 kali lipat
dibandingkan dalam keadaan normal sehingga
pembentukan OH• dan OH – yang merupakan
radikal bebas golongan ROS(Reactive Oxygen
Species) juga bertambah banyak 4-5 kali lipat.
• Hal ini menyebabkan kerusakan sel bertambah
parah.

Penentuan kemampuan mereduksi ekstrak
tanaman
• Dibuat larutan ekstrak etanol tanaman dengan
konsentrasi 2%, 4%, 6%, dan 8%.
• Kemudian masing-masing diambil 1,0 ml lalu
ditambah dengan 2,50 ml dapar phospat 0,2 M
pH 6,6.
• Kemudian ditambahkan 2,50 ml larutan K3Fe(CN)6
1 %
• Selanjutnya diinkubasi selama 20 menit pada
suhu 50 ˚C
• Setelah itu ditambahkan Trikloro asetat (TCA)
10% sebanyak 2,50 ml.
• Lalu di kocok sampai homogen, selanjutnya
disentrifugasi pada 3000 rpm selama 10 menit

• Sebanyak 5,0 ml lapisan atas dari larutan
tersebut ditambahkan dengan 5,0 ml aquades
steril dan 1,0 ml FeCl3 0,1%
• Diukur absorbansinya pada λ 700 nm
• Sebagai pembanding disiapkan larutan standar
kuersetin konsentrasi 10 ppm, 20 ppm, 40 ppm
dan 80 ppm
• Larutan standar kuersetin perlakuannya dibuat
sama seperti perlakuan pada ekstrak tanaman

Contoh Hasil Pengukuran Standar kuersetin

Grafik Perbandingan Konsentrasi Standar Kuersetin
dengan absorbansinya

Hasil pengukuran kadar Flavonoid Ekstrak Buah Pare
Semakin tinggi konsentrasi ekstrak buah
pare semakin tinggi kadar flavonoid totalnya
(Warna kuning semakin tua)

Hubungan antara daya reduksi ekstrak dengan
kadar flavonoid
Semakin tinggi kadar flavonoid total ekstrak buah pare
(terbentuknya warna biru) semakin tinggi kemampuan
daya reduksinya

• Ekstrak dengan daya reduksi tinggi
merupakan donor elektron yang potensial
dan memiliki kemampuan untuk
menghentikan reaksi berantai peroksidasi lipid
yang ditimbulkan oleh serangan radikal bebas,
dengan cara mengubah radikal bebas
menjadi produk yang lebih stabil.
• Aktivitas antioksidan dengan cara
mendonorkan atom hidrogen kepada radikal
bebas sehingga menjadi netral.

Uji Aktivitas Antioksidan Flavonoid
dengan metode DPPH
• Metode DPPH (1,1 diphenyl-2picrylhydrazyl)
banyak digunakan dalam uji aktivitas antioksidan flavonoid.
• Pada metode ini antioksidan flavonoid (AH)
bereaksi dengan radikal bebas DPPH dengan cara
mendonorkan atom hidrogen, menyebabkan perubahan
warna DPPH dari warna ungu menjadi kuning
• Intensitas warna diukur dengan spektrofotometer UV-VIS
pada panjang gelombang 517 nm

Metode DPPH
• DPPH merupakan radikal bebas yang stabil pada
suhu kamar dan sering digunakan untuk menilai
aktivitas antioksidan beberapa senyawa atau
ekstrak bahan alam.
• Interaksi antioksidan dengan DPPH baik secara
transfer elektron atau radikal hidrogen pada DPPH
akan menetralkan karakter radikal bebas dari
DPPH.
• Jika semua elektron pada radikal bebas DPPH
menjadi berpasangan maka warna larutan akan
berubah dari ungu tua menjadi kuning terang

• Adapun reaksinya sebagai berikut:
UNGU KUNING

Pembuatan Larutan Induk DPPH
• Sebanyak 9,8 mg serbuk DPPH ditimbang,
dimasukkan ke dalam labu ukur
50 mL dilarutkan dengan metanol lalu volumenya
dicukupkan sampai garis tanda (konsentrasi 200 ppm)
• Pembuatan larutan blanko DPPH
• Larutan DPPH (konsentrasi 200 ppm) dipipet
sebanyak 2 mL, kemudian
dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, lalu
dicukupkan volumenya dengan metanol sampai
garis tanda (konsentrasi 40 ppm)

Pembuatan Larutan Uji Kuersetin
• Pembuatan larutan uji kuersetin (Sebagai kontrol
positif)
• Larutan induk dipipet sebanyak 0,125 mL; 0,25 mL;
0,5 mL; 1,0 mL
• Lalu dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL untuk
mendapatkan konsentrasi larutan uji 1,25 ppm; 2,5
ppm; 5 ppm dan 10 ppm.
• Lalu ke dalam masing-masing labu ukur
ditambahkan 2 mL larutan DPPH (konsentrasi 200
ppm), dicukupkan volumenya dengan metanol sampai
garis tanda.
• Diamkan selama 60 menit, diukur serapannya
menggunakan spektrofotometer UV-Visble pada
panjang gelombang yang diperoleh.

Persiapan sampel uji
• Larutan induk sampel uji dipipet sebanyak 0,25
mL; 0,5 mL; 1,0 mL dan 2,0 mL ke dalam labu
ukur 10 mL untuk mendapatkan konsentrasi larutan
uji 25 ppm; 50 ppm; 100 ppm dan 200 ppm
• Lalu ke dalam masing-masing labu ukur ditambahkan
2 mL larutan DPPH (konsentrasi 200 ppm),
dicukupkan volumenya dengan metanol sampai
garis tanda.
• Diamkan selama 60 menit pada suhu kamar,
diukur serapannya menggunakan spektrofotometer
UV-Visible pada panjang gelombang yang diperoleh
(panjang gelombang 515 – 517 nm)

Perhitungan Aktivitas perendaman radikal
bebas
A sampel = Absorbansi sampel

Hasil Uji DPPH Standar Kuersetin

Contoh Hasil Uji DPPH Sampel
EKSTRAK
Tanaman

Nilai IC 50 (Inhibitory Concentration)
• Perhitungan yang digunakan dalam penentuan
aktivitas peredaman radikal bebas adalah
dengan mencari nilai IC 50
• Nilai tersebut menggambarkan besarnya
konsentrasi senyawa uji yang dapat meredam
radikal bebas sebesar 50%.
• Nilai IC50 diperoleh berdasarkan perhitungan
persamaan regresi dengan cara memplot
konsentrasi larutan uji dan persen (%) inhibisi
atau peredaman DPPH sebagai parameter
aktivitas antioksidan

• Konsentrasi sampel (ppm) sebagai absis
(sumbu X) dan nilai persen (%) inhibisi
sebagai ordinat (sumbu Y).
• Hasil persamaan regresi linier dan hasil
analisis nilai IC 50 diperoleh dari absorbansi
ekstrak sampel dan kuersetin

Contoh Hasil Uji IC 50
Larutan Uji Persamaan Regresi IC50 (ppm)
A Y= 0,335 + 6,617 130,326
B Y= 0,295 + 9,485 137,187
C Y= 0,314 + 11,076 123,817
D Y= 0,310 + 9,723 129,670
Standar kuersetin Y= 9,055 + 5,128 4,950
Molyneux (2004) menyatakan bahwa suatu zat mempunyai sifat antioksidan
bila nilai IC50 < 200 ppm, tetapi dengan kategori lemah

THANK YOU