Practicas de Microbiologia Alimentaria UNSA

38
PRACTICA N° 4
DETERMINACIÓN Y RECUENTO DE COLIFORMES EN LECHE Y
PRODUCTOS LACTEOS
I. OBJETIVOS
 Brindar conocimientos sobre las metodologías de análisis microbiológicos de la leche y sus
productos (quesos).
 Detectar e interpretar la presencia de bacterias coliformes en leche entera (cruda) y sus
productos (quesos).
II. INTRODUCCIÓN
La leche es un excelente medio de cultivo para numerosos microorganismos por su elevado
contenido en agua, su pH casi neutro y su riqueza en alimentos microbianos. Posee una gran cantidad
de alimentos energéticos en forma de azúcares (lactosa), grasa y citrato, y compuestos nitrogenados.
Los alimentos nitrogenados se hallan en numerosas formas: proteínas, aminoácidos, amoniaco, urea,
etc.
Por poseer azúcares fermentables, en condiciones ordinarias lo que más frecuentemente ocurre es
una fermentación ácida a cargo de las bacterias; si no existen gérmenes formadores de ácido o si las
condiciones son desfavorables para su actividad, pueden sufrir otros tipos de alteración. Las
principales alteraciones son:
 Agriado o formación de ácido: Cuando la leche se agria suele considerarse alterada. La
formación de ácido se manifiesta inicialmente por olor agrio y la coagulación de la leche, que
produce una cuajada de consistencia gelatinosa o más débil, que libera un suero claro.
 Proteólisis: La hidrólisis de las proteínas lácticas por acción microbiana se acompaña en
general de la producción de un sabor amargo producido por algunos polipéptidos.
EL QUESO
El queso es uno de los principales derivados de la leche, rico en proteínas y calcio. Se lo define como
un producto obtenido por maduración de la cuajada de leche, con características propias en cada de
sus clases.
III. MATERIALES Y EQUIPOS
MATERIALES
- Muestras de leche y derivado lácteo
- 8 placas de Petri estériles
- 4 tubos con 9 mL. de AP al 0.1%
- 1 matraz con 90 mL. de AP al 0.1%
- 5 pipetas estériles
- Mecheros de Bunsen
- Gradillas porta tubos
- 1 incubadora bacteriológica

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- Agar lasctosado con bilis al cristal violeta y rojo neutro (VRBA)
IV. PROCEDIMIENTO
A) LECHE
MUESTREO
 Todos los equipos e implementos a ser empleados en la toma de muestra y que tenga
contacto con la leche, deben ser previamente higienizados para eliminar todo el resto de
materias extrañas a su constitución original. Especialmente materia orgánica de un uso
anterior: envases, cucharones, etc.
 El personal encargado de realizar el análisis deberá contar con toda la indumentaria
necesaria para evitar la contaminación de la leche.
 Se realizará la toma de muestras y la realización del análisis deberá ser la más corta
posible. La muestra se debe mantener en refrigeración.
B) QUESO
MUESTREO
 Toma de muestra mediante el corte de un sector: Háganse dos cortes radiales desde
el centro del queso con un cuchillo afilado. El tamaño del sector así obtenido deberá ser
tal que, al separar la corteza, la porción comestible sea dos veces mayor que la que se
requiere para hacer los análisis.
 Tomas de muestra con un sacabocados: El sacabocado puede insertarse oblicuamente
hacia el centro del queso una o varias veces es un punto en una de las superficies planas
a una distancia no inferior a 10 – 20 cm del borde. A partir del cilindro o cilindros
obtenidos córtese una porción cuya distancia a la corteza no sea inferior a 2 cm y utilícese
esta pieza para cerrar el orificio practicado en el queso. El resto del cilindro o cilindros
constituirán la unidad de muestra.
PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
1. Comenzar el examen tan pronto como se disponga de la muestra.
2. Añadir 10 mL (g)de muestra a un recipiente que contiene 90 mL del diluyente. Así se
obtiene la dilución 10-1
.
3. Pipetear 1 mL (dilución 10-1
) evitando la formación de espuma y transferir a un recipiente
con 9 mL de diluyente, y se tiene la dilución 10-2
, mezclar mediante agitación. Repetir
esta operación para preparar las diluciones 10-3
, 10-4
o las necesarias según el caso.
NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MÉTODO DE
RECUENTO EN PLACA
 Siembra en una placa Petri 1 mL. de la muestra o 1mL. de la disolución 10-1
.
 Repetir la operación de cada una de las siguientes diluciones (10-2
,10-3
y 10-4
).
 Verter 15 mL. del medio VRBA a 45°C o 47°C.

40
 Mezclar la muestra con movimientos suaves en forma de las agujas del reloj, hasta que
solidifique.
 Cubrir con 5 mL. del medio para la prueba de esterilidad.
 Contar las colonias características de coliformes (diámetro mayor o igual a 0.5 mm. De
color rojo violeta y a veces rodeada de un halo de precipitación) en las placas que
contengan menos de 150 colonias características.
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
1) PREPARACIÓN DEL MEDIO (Agar VRBA):
Hacemos el cálculo para el calcular el uso del agar VRBA, para 3 diluciones
VRBA Agua destilada
40,0 g _______ 1000 mL.
X g _______ 60 mL. X = 2,4 g de VRBA
2) PREPPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Se peso 10 g, de queso el cual se diluyo en 90 mL de diluyente en un matraz,
obteniendo así la dilución 10-1
. Luego se pipeteo 1mL de la solución preparada y se
transfirió a un tubo de ensayo de 9 mL. de diluyente obteniendo así la dilución 10-2
,
finalmente se pipeteo nuevamente 1 mL. de la dilución 10-2
a un segundo tubo de
ensayo conteniendo 9mL.
Figura N° 2: Agar VRBA Figura N° 3: 2,4 g. de VRBA Figura N° 4: Agar VRBA
disuelto en 60 mL. de agua
Figura N° 5: Agar VRBA a
punto de ebullir
Amarillo
100 mL. de
solución
10-1
1mL.
_ 9mL.
10-2
_ 9mL.
1mL.
10-3
Figura N° 6:
Diluciones de
muestra de
queso.

41
3) SIEMBRA POR PROFUNDIDAD DE MUESTRA DE QUESO:
4) CONTEO DE COLONIAS DE COLIFROMES:
Luego de incubar por 24 horas escogemos la placa que tenga un número de
colonias entre 20 y 200 colonias con un diámetro mayor a 0,5 mm para dar nuestro
conteo del Número más probable.
NMP=(N° de colonias)(Factor de dilución)+ (N° de colonias)(Factorde dilución)+…+ (N° de colonias)(101
)
NMP= (48) (104
) UFC/g
NMP= 480 000 UFC/g
DISCUSIONES
 NORMA TÉCNICA PERUANA: Reglamento de la leche y productos lácteos
 REGLAMENTO TÉCNICO CENTROAMERICANO(RTCA 67.04.50:08)
Alimentos. Criterios microbiológicos para la inocuidad de Alimentos
1mL. 1mL. 1mL.
20 mL.
20 mL.
20 mL. Figura N° 7:
Siembra por
profundidad
de muestras
de queso con
VRBA.
Figura N° 8: Colonias de Coliformes en Agar
VRBA.
Tabla N° 1: Parámetros microbiológicos de queso de la NTP

42
Observamos que nuestro resultado de 48x104
UFC/g de coliformes excede a la norma técnica
peruana y mucho más a la norma internacional.
VI. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
A. CONCLUSIONES
 Se utilizó las metodologías de análisis microbiológicos de la leche y sus productos (quesos).
 Se observó ia presencia de bacterias coliformes en queso en 48 colonias en agar VRBA,
cuya dilución fue de 10-4
, mediante siembra por profundidad obteniendo en el recuento en
placa de 480 000 UFC/gm.
B. RECOMENDACIONES
VII. CUESTIONARIO
1. Describa y esquematice el análisis microbiológico de helado y yogurt
A. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE HELADO
1) Análisis microbiológicos (técnicas descritas por el INVIMA)
Figura 9. Preparación y dilución de los homogenizados de las muestras de helados
a) Recuento de microorganismos aerobios Mesófilos
HELADO 10-1 10-2
10-3
10-1
10-2
Tabla N° 1: Parámetros microbiológicos de queso de la RTC
Figura N° 10:
Dilución de
microorganismos
aerobios Mesófilos.

43
b) Determinación de coliformes en alimentos número más probable (NMP)
10-3
10-4
Plate Count
Plate Count
Plate Count
1 mL. 1 mL
1 mL.
1mL.
1mL.
Dilución 10−2
Dilución 10−3
10−1

44
2) Aislamiento E Identificación De Bacterias Patogénicas
a) Recuento De Staphylococcus Coagulasa Positivo
o Medios de cultivo y reactivos
b) Determinación de Salmonella
o Medios de cultivo y reactivos
10 -1
Baird Parker
Figura N° 11: Dilución de coliformes en alimentos número más probable.
Figura N° 12: Siembra.

45
o Identificación de Salmonella mediante pruebas bioquímicas
3) Frotis a los operarios:
B. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE YOGURT
a. Muestreo
b. Análisis de las muestras
MUESTRA
XLDSS
Figura N° 13: Diluciones
para la determinación
de Salmonella .

46
2. ¿Cómo reconocería Estafilococcus aureus y Brucella melitensis, y en qué productos lácteos
lo encontramos?
a) Estafilococcus aureus
 Identificación mediante medios de cultivos
 Detección de β-lactamasa
 Prueba de difusión en disco para cefoxitina
 Detección de PBP2a
 ChromID MRSA
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

47
b) Brucella melitensis
 Cultivo
 Métodos de Identificación
3. ¿Qué influencia tiene el proceso UHT sobre la composición bacteriana en leches?
4. Qué microorganismos pueden encontrarse en la leche en polvo
Tabla N° 3: Microorganismos que deberían abarcar el análisis de leche en polvo.

48
VIII.BIBLIOGRAFÍA
 Avila,V., & Silva, M.(2008). Evaluación de la calidad microbiológica de los helados
elaborados en una empresa del municipio de Soacha y su Impacto a nivel local (Tesis de
pregrado).Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.
 Hernández Betancourt, O. (1981). Staphylococcus aureus y su identificación en los
laboratorios microbiológicos. Archivo Médico de Camagüey 2005, [online] 9(1). Available at:
http://www.amc.sld.cu/amc/2005/v9n1/997.htm [Accessed 15 Oct. 2017].
 ACOSTA, G., RODRÍGUEZ, G., LONGORIA, E. and CASTRO, M. (2012). Evaluación de cuatro
métodos para la detección de Staphylococcus aureus meticilino-resistente de muestras
clínicas en un hospital regional. Salud pública México, [online] 54(1). Available at:
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0036-36342012000100001
[Accessed 15 Oct. 2017].
 Forbes, B., Sahm, D., Weissfeld, A. and Bailey, W. (2007). Diagnostico Microbiologico. St.
Louis, Mo.: Elsevier Mosby, pp.431 - 432.
 Ellner, R. (2000). Preguntas y respuestas sobre la microbiología de la leche y los productos
lácteos. Madrid, España: Díaz de Santos, pp.43,49,50.
IX. ANEXOS

49
PRACTICA N° 5
DETERMINACIÓN DE E. coli TERMOTOLERABLE
EN CARNE Y PRODUCTOS CÁRNICOS
I. OBJETIVOS
 Detectar e interpretar la presencia de E. coli en carnes y productos cárnicos
II. INTRODUCCIÓN
Según el código alimentario, es la parte comestible de los músculos de animales sacrificados en
condiciones higiénicas, incluye (vaca, oveja, cerdo, cabra caballo y camélidos sanos), y se aplica
también a animales de corral, caza, de pelo y plumas y mamíferos marinos, declarados aptos para el
consumo humano.
Todas las carnes están englobadas dentro de los alimentos proteicos y nos proporcionan entre un
15 y 20% de proteínas, que son consideradas de muy buena calidad ya que proporcionan todos los
aminoácidos esenciales necesarios. Son la mejor fuente de hierro y vitamina B12. Aportan entre un
10 y un 20% de grasa (la mayor parte de ellas es saturada), tienen escasa cantidad de carbohidratos
y el contenido de agua oscila entre un 50 y 80%. Además, nos aportan vitaminas del grupo B, zinc y
fósforo.
Se admite que la masa interna de la carne no contiene microorganismos o estos son escasos. Debido
a la gran variedad de fuentes de contaminación, los tipos de microorganismos que suelen
encontrarse en la carne son muchos. Mohos de diferentes géneros, llegan a la superficie de la carne
y se desarrollan sobre ella. Son especialmente interesantes las especies de los géneros Cladosporium,
Sporotrichum, Geotrichum, Thamnidium, Mucor, Penicililum, Alternaria y Monilia. A menudo se
encuentran levaduras, especialmente no esporuladas.
Entre las muchas bacterias que pueden hallarse, las más importantes son las del género
Pseudomonas, Alcaligenes, Micrococcus, Sttreptococcus, Sarcina, Leuconostoc, Lactobacillus, Proteus,
Flavobacterium, Bacillus, Clostridium, Echerichia, Salmonellas y Streptomyces. Muchas de estas
bacterias crecen a temperatura de refrigeración, también es posible la contaminación de la carne y
de sus productos por gérmenes patógenos del hombre, especialmente de origen entérico.
MATERIALES
- Muestras de carne fresca y embutidos.
- 4 tubos con 9 mL. de AP al 0,1%
- 5 pipetas estéril
- Mecheros de bunsen

50
- Medio EMB agar (eosina azul de metileno) o MC (Mac Conkey).
IV. PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
 Comenzar el examen tan pronto como se disponga de la muestra.
 Añadir 10 mL.(g) de muestra a un recipiente que contiene 90 mL. del diluyente. Así se obtiene
la dilución 10-1
.
 Pipetear 1mL. (dilución 10-1
)evitando la formación de espuma y transferir a un recipiente con
9 mL. de diluyente, y se tiene la dilución 10-2
, mezclar mediante agitación. Repetir esta
operación para preparar las diluciones 10-3
,10-4
MÉTODO
 Siembra en una placa Petri 1 mL. de muestra o 1 mL. de la disolución 10-1
.
 Repetir la operación de cada una de las siguientes diluciones (10-2
,10-3
y 10-4
).
 Verter 15 mL. del medio EMB a 45°C o 47°C.
 Mezclar la muestra con movimientos suaves en forma de las agujas del reloj, hasta que
solidifique.
 Cubrir con 5 mL. del medio a la misma temperatura.
 Dejar solidificar e incubar a 44°C durante 24 horas.
 Considerar una placa con medio para la prueba de esterilidad.
o Contar las colonias características de Escherichia coli de color azul con brillo metálico
y una periferia azulada o rosada porque utilizan la lactosa.
o En el caso de sospechar la presencia de E. coli estresados (resistentes a los
antibióticos), es conveniente realizar una primera incubación a 37 °C +-1°C durante
4 horas y luego la incubación a 44°C +-1°C durante 18 h. – 20 h.
a) PREPARACIÓN DEL MEDIO (Agar VRBA):
Hacemos el cálculo para el calcular el uso del agar EMB, para 3 diluciones
EMB Agua destilada
37,5 g _______ 1000 mL.
X g _______ 60 mL. X = 2,25 g de EMB
Figura N° 3: 2, 25 g. de EMB

51
b) PREPPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Se peso 10 g, de carne el cual se diluyo en 90 mL de diluyente en un matraz, obteniendo así la
dilución 10-1
. Luego se pipeteo 1mL de la solución preparada y se transfirió a un tubo de ensayo
de 9 mL. de diluyente obteniendo así la dilución 10-2
, finalmente se pipeteo nuevamente 1 mL.
de la dilución 10-2
a un segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL.
c) SIEMBRA POR PROFUNDIDAD DE MUESTRA DE CARNE:
d) DETERMINACIÓN DE E. coli EN CARNE:
Luego de incubar por 48 horas escogemos la placa obtenemos una colonia de
aproximadamente 1 cm. de diámetro de color verde, con brillo metálico, es una colonia plana
con un halo de precipitación negro-azulado alrededor de ella debido a la fermentación de la
lactosa.
Violeta
1mL.1mL.1mL.
20 mL.
20 mL.
20 mL. Figura N° 7:
Siembra por
profundidad
de muestras
de carne con
EMB.
1mL.
_ 9mL.
10-2
1mL.
_ 9mL.
10-3
Figura N° 6:
Diluciones de
muestra de carne.
10-1
100 mL. de
solución

52
DISCUSIONES
 NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD
SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO: Reglamento microbiológico de la carne refrigerada o congelada
(hamburguesa).
 REGLAMENTO TÉCNICO CENTROAMERICANO(RTCA 67.04.50:08)
Alimentos. Criterios microbiológicos para la inocuidad de Alimentos
Tabla N° 4: Parámetros microbiológicos de carne de la Norma Sanitaria Peruana
Tabla N° 5: Parámetros microbiológicos de carne de la RTC

53
Observamos que nuestro resultado de UFC/g de coliformes excede a la norma técnica peruana y
mucho más a la norma internacional.
 Se detectó la presencia de E. coli en carnes en nuestro caso de hamburguesa por la
presencia de una colonia de 1 cm. Aproximadamente , plana, con un halo alrededor negro-
azulado, por la fermentación de la glucosa, además se observaron otras colonias
transparentes probablemente Shiguella y Salmonella.
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Por qué es importante detectar la presencia de E. coli en productos cárnicos?

54
2. ¿Qué condiciones promueve el crecimiento de E. coli en carnes y sus derivados?
3. Menciones que enfermedades produce la ingesta de alimentos contaminados con E. coli.

55
4. ¿Qué tipo de microorganismo alteran la carne congelada?

56
VIII. BIBLIOGRAFÍA
 Piqueras Martinho, M. (2016). Actualización en higiene alimentaria, manipulación, toxiinfecciones
alimentarias y etiquetado de alimentos. 1st ed. [El Ejido, Almería]: Círculo Rojo, p.23.
 Revista I Alimentos - para la industria de alimentos en Colombia. (2017). Método para detectar E.
coli en productos cárnicos. [online] Available at: http://revistaialimentos.com/news/1420-443-m-
otodo-para-detectar-e-coli-en-productos-c-arnicos--.htm [Accessed 17 Oct. 2017].
 PREVENCIÓN de la E.coli en los ALIMENTOS. (2017). 1st ed. [ebook] Marco de Gestión de Crisis
para la Cadena Alimentaria (FCC), pp.6-7. Available at:
http://www.fao.org/fileadmin/user_upload/fcc/news/FAO_PREVENCION.de.la.E.Coli.en.los.ALIME
NTOS_FCC_ES.pdf [Accessed 17 Oct. 2017].
 Moreno García, B. (2015). Higiene e inspección de carnes. Volumen II. 1st ed. Madrid: Ediciones
Díaz de Santos, p.27.
 CAMEAN, A. and REPETTO, M. (2012). Toxicologia alimentaria. 2nd ed. Madrid: Díaz de Santos,
p.261.
IX. ANEXOS

38
PRACTICA N° 6
DETERMINACIÓN RECUENTO DE COLIFORMES EN FRUTAS Y
HORTALIZAS TECNICA DEL NÚMERO MAS PROBABLE
I. OBJETIVOS
 Brindar conocimientos sobre la metodología de análisis por el Método del Número más Probable,
para el recuento de microorganismos viables.
II. INTRODUCCIÓN
Una gran variedad de factores contribuye a la contaminación de frutas y hortalizas por microorganismos
causantes de enfermedades a los humanos. Algunos de los factores que pudieran considerarse de riesgo
en la calidad microbiológica de los productos frescos incluyen: el uso de agua de riego contaminada con
heces fecales de humanos y animales; procesos inadecuados en los campos de cultivo; prácticas
deficientes de desinfección; condiciones inapropiadas durante empaque; higiene deficiente de los
trabajadores, y el mal manejo durante almacenamiento y transporte.
Una vez que ocurre la contaminación, muchos microorganismos patógenos poseen la capacidad de
sobrevivir por largos períodos de tiempo en frutas y hortalizas frescas. Algunos microorganismos son
también capaces de sobrevivir a procesos de desinfección, e incluso de multiplicarse en el producto
durante almacenamiento.
Dentro de los microorganismos que pueden contaminar los productos frescos y causar enfermedades en
los seres humanos , se puede mencionar, algunos protozoarios, virus y bacterias.
Entre las bacterias patógenas que han sido asociadas con el consumo de hortalizas frescas se puede
mencionar: E. coli, especies de Salmonella, Shiguella, Listeria, Campilobacter, Clostridium, Staphylococcus
entre otros.
MATERIAL
- 15 tubos con campana de Durhans estériles
- 3 tubos con 9 mL. de AP ó SSP al 0,1%
- 1 matraz con 90 mL. de AP ó SSP al 0,1%
- Verde Brillante Bilis Caldo
IV.PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIÓN Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
- Comenzar el examen tan pronto como se disponga de la muestra.

39
- Añadir 10 mL. (g) de muestra a un recipiente que contiene 90 mL. del diluyente. Así se obtiene la
dilución 10-1
.
- Pipetear 1 mL. (dilución 10-1
) evitando la formación de espuma y transferir a un recipiente con 9
mL. de diluyente, y se tiene la dilución de10-2
, mezclar mediante agitación. Repetir esta operación
para preparar la dilución 10-3
.
B. NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES PORL EL METODO
DEL NMP
MÉTODO
o Sembrar 1 mL. de muestra de la dilución madre o de la dilución 10-1
en tres tubos con caldo
de brilla al 2%
o Sembrar 1 mL. de muestra 10-2
en tres tubos de caldo de brilla al 2%
o Sembrar 1 mL. con la dilución 10-3
en tres tubos de caldo de brilla al 2%
o Incubar a 37 °C +-1°C durante 24 h. a 48 horas
Contar los tubos positivos (con gas, cambio de color a amarillo, turbidez) para cada
dilución.
Determinar el NMP con la ayuda de una tabla
Este método es considerado como enriquecimiento, de los tubos positivos se aislará
a medios con agar como: el VRBA (Violeta rojo bilis agar) AG (agar glucosado), AN
(agar nutritivo) e incubar a 37 °C por 24 horas.
Las colonias sospechosas confirmar con pruebas bioquímicas (prueba de la oxidasa y
prueba de fermentación de la glucosa)
Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del
número más probable.
FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo
bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de
bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de
carbono fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y
gas.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Bilis de buey
deshidratada
20.0 Suspender 40 g del polvo
deshidratado por litro de agua
destilada. Disolver y distribuir 10 ml
por tubo con campanita de Durham.
Preparar además, el medio a doble
concentración. Esterilizar en autoclave
a 121°C durante 15 minutos.
Lactosa 10.0
Peptona 10.0
Verde brillante 0.0133
pH final: 7.2 ± 0.2
SIEMBRA
a.- Para el análisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por triplicado: 10 ml en
caldo doble concentración y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentración.

40
Número
de tubos
Volumen de la
muestra
Volumen de
medio
Concentración
del medio
3 10 ml 10 ml Doble
3 1 ml 10 ml Simple
3 0.1 ml 10 ml Simple
b.- Para el análisis de coliformes totales en muestras sólidas (alimentos, cosméticos, fármacos),
efectuar diluciones seriadas 10-1
, 10-2
y 10-3
y sembrar cada dilución por triplicado en medio de
cultivo simple concentración.
Número
de tubos
Dilución dela
muestra
Volumen de la
muestra
Volumen de
medio
Concentración
del medio
3 10-1
1 ml 10 ml Simple
3 10-2
1 ml 10 ml Simple
3 10-3
1 ml 10 ml Simple
c.- Para análisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test presuntivo de
coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2% Caldo ó Mac Conkey Caldo ó Lauril
Sulfato, utilizando la técnica del NMP), o a partir de colonias presentes en diferentes medios, que
se presume sean coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2% caldo
fresco, incubando a 45 +/- 0.5 ºC y otra en Agua Triptona con incubación a 35-37 ºC, para detectar
la producción de indol.
INCUBACIÓN
a- Para de coliformes totales: a 35-37 °C durante 24 horas.
b- Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 °C durante 24 horas.
RESULTADOS
-Positivo: presencia de gas.
Con el número de tubos positivos, calcular el número mas probable. El resultado se expresa por
gramos ó 100 ml de producto
-Negativo: ausencia de gas.
Microorganismos Crecimiento Gas Indol#
Escherichia coli ATCC 25922 + +* +*
Enterobacter spp. + + -*
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 + +* -*
Salmonella typhimurium ATCC 14028 + - -
Bacterias no fermentadores de lactosa + - Variable
Staphylococcus aureus ATCC 25923 - - -
+* ó -* 10-25% de cepas negativas o positivas
# a partir de Agua Triptona
CARACTERÍSTICAS DEL MEDIO
Medio preparado: verde esmeralda, transparente
ALMACENAMIENTO:
Medio deshidratado: a 10-35 ºC.
Medio preparado: a 2-8 ºC.

41
A. NTP
B. NORMAS INTERNACIONALES
“CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA ALIMENTOS CÓDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO Y SUS
ÚLTIMAS ACTUALIZACIONES”
Tabla N° 6: NORMA SANITARIA QUE ESTABLECELOS CRITERIOSMICROBIOLOGICOSDE CALIDADSANITARIA E INOCUIDAD PARA
LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO

42
a) Artículo 925 quater – (Resolución Conjunta SPReI N° 192/2012 y SAGyP N° 799/2012) Las frutas
y hortalizas deberán ajustarse a las siguientes normas microbiológicas: (*) o su versión más
actualizada 1. Hortalizas frescas y frutas frescas
Parámetro Criterio microbiológico (*) Método de referencia
E. coli NMP/g n=5, c=2 m=10 , M=100 BAM-FDA: 2002, método I ó II
ISO/TS 16649-3: 2005
Salmonella spp. n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011 ISO 6579: 2002,
Co:2004
E. coli O157: H7/NM n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011 ISO 16654:2001
(*) o su versión más actualizada
b) VEGETALES MÍNIMAMENTE PROCESADOS: Hortalizas y frutas frescas enteras o cortadas,
peladas o no, lavadas, tratadas (desinfectadas) o no y envasadas, listas para consumir.
E. coli NMP/g n=5, c=0 m< 0,3 BAM-FDA: 2002, método I ó II
ISO/TS 16649-3: 2005
Salmonella spp. n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011
ISO 6579: 2002,
Co:2004
E. coli O157: H7/NM n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011
ISO 16654:2001
c) VEGETALES MÍNIMAMENTE PROCESADOS: Hortalizas y frutas frescas enteras, cortadas, peladas
o no, y envasadas que deben lavarse con agua potable antes de consumirse crudas o cocidas
Se brindó conocimientos sobre la metodología de análisis por el Método del Número más
Probable, para el recuento de microorganismos viables.
VII. CUESTIONARIO
1) Por qué es importante el análisis microbiológico en frutas y hortalizas.
E. coli NMP/g n=5, c=2 m=10, M=100 BAM-FDA: 2002, método I ó II
ISO/TS 16649-3: 2005
Salmonella spp. n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011 ISO 6579: 2002,
Co:2004
E. coli O157: H7/NM n=5, c=0 ausencia en 25 g BAM-FDA: 2011
ISO 16654:2001
Tabla N° 7: Criterios microbiológicos de hortalizas frescas y frutas frescas
Tabla N° 8: Criterios microbiológicos de vegetales mínimamente procesados
Tabla N° 9: Criterios microbiológicos de vegetales mínimamente procesados

43
2) Mencione y describa los vectores de contaminación de las frutas y hortalizas.
3) ¿Qué enfermedades se pueden transmitir por el consumo de frutas u hortalizas contaminadas?
BOTULISMO

44
ENTAMOEBA HISTOLYTICA
Frutas y hortalizas que han estado implicadas en brotes de enfermedades de origen alimentario
(a menudo a punto de contaminación no fue determinado, pero la producción, cosecha,
procesamiento y prácticas de manejo han jugado un papel en uno o más brotes).
PATÓGENO PRODUCTO IMPLICADO
BACTERIAS
PARÁSITOS
VIRUS

45
Características de algunos patógenos microbianos ligados a brotes de enfermedades asociados a
productos frescos
Microorganismo
Periodo de
incubación
Síntomas
Dosis infecciosa
(número de
células)
Fuente
BACTERIAS
Ejemplos de Patógenos que se han aislado de productos frescos (se han
incluido estudios internacionales)
PATÓGENO PRODUCTO

46
PARÁSITOS
4) ¿Qué análisis se realizan en: frutas en almíbar, mermeladas de frutas, ¿y frutas frescas para
exportación?

47
5) ¿Qué análisis se realizan para hortalizas de consumo fresco y procesado?
VIII. BIBLIOGRAFÍA
o Britanialab.com.ar. (2017). Verde Brillante Bilis 2% Caldo. [online] Available at:
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm [Accessed 28 Oct. 2017].
o Bejarano, N. and Carrillo, L. (2007). Manual de Microbiología de los Alimentos. 1st ed. Jujuy,
Argentina: Asociación Cooperadora de la Facultad de Ciencias Agrarias, pp.71-82.
o NORMA SANITARIA QUE ESTABLECE LOS CRITERIOS MICROBIOLOGICOS DE CALIDAD
SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO HUMANO. (2003).
Lima, pp.18-19.
o Cabrera, J. (2013). CRITERIOS MICROBIOLÓGICOS PARA ALIMENTOS CÓDIGO ALIMENTARIO
ARGENTINO Y SUS ÚLTIMAS ACTUALIZACIONES. Buenos Aires: INAL – ANMAT, pp.100-102.
o Equipo Vértice (2014). Dietética y manipulación de alimentos. 2nd ed. Madrid: Vértice Books,
pp.20-21.
o Gil Hernández, A. and Sánchez de Medina Contreras, F. (2013). Tratado de nutrición. 2nd ed.
Madrid: Médica Panamericana, p.669.
o Kader, A. (2011). Postharvest technology of horticultural crops (Tecnología postcosecha de
cultivos hortofrutícolas). 1st ed. Oakland, Calif.: University of California, Agriculture and Natural
Resources, pp.343-345.
o Sosa Sarmiento, M. (2017). Analisis Microbiologico de Conservas. 1st ed. [ebook] Marilli
Milagros Sosa Sarmiento, pp.4-6. Available at: https://es.scribd.com/doc/155841475/Analisis-
Microbiologico-de-Conservas [Accessed 29 Oct. 2017].

48
o Pascual Anderson, M. and Calderón y Pascual, V. (2000). Microbiología alimentaria. 2nd ed.
Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo, p.345.
o Salgado Tello, I., Flores Mancheno, C., García Toledo, P., Guzmán Acán, F. and Villegas Freire, C.
(2017). Caracterización fisicoquímica microbiológica y sensorial de mermeladas. [online]
Eumed.net. Available at: http://www.eumed.net/cursecon/ecolat/ec/2017/mermeladas-ahuana-
calpi.html [Accessed 4 Nov. 2017].
o Puig, Y., Leyva, V., Rodríguez, A. and Carrera, J. (2014). Calidad microbiológica de las hortalizas y
factores asociados a la contaminación en áreas de cultivo en La Habana (Microbiological quality
of vegetables and factors associated with contamination in growing areas in
Havana). Sustainability of Water Quality and Ecology, [online] 13(1). Available at:
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1729-519X2014000100013 [Accessed 4
Nov. 2017].
IX. ANEXOS

49
PRACTICA N° 7
DETERMINACIÓN DE HONGOS Y LEVADURAS EN PRODUCTOS DE
PANIFICACIÓN
I. OBJETIVOS
 Conocer y aplicar técnicas para el recuento de hongos y levaduras
II. INTRODUCCIÓN
En la fase de horneado, la masa se somete a una temperatura de 200 - 230 °C, que acaba con todas las
formas de vida. Pero en el interior de la masa, se alcanza una temperatura aproximada a 100 °C. que mata
sólo a las formas vegetativas. Las formas de resistencia, surgen cuando las condiciones de temperatura
han vuelto a la normalidad, por lo que generalmente, a las 24 – 36 horas, aparecen organismos fúngicos,
alterando el pan.
Algunos de estos son: Rhizopus nigricans, Penicilium expansum, P. stoloniferum, Aspergillus niger, Minilis
(Neurospora)sitophila, Mucor spp. y Geotrichum spp.
Otros microorganismos no fúngicos que provocan la putrefacción del pan son: Bacillus subtilis(otambién
B. mesentericus o B. panis) y B. licheniformis.
MATERIAL
- Medio OGA (agar glucosa oxitetraciclina)
IV. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIÓNY DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
 Comenzar el examen tan pronto como se disponga de la muestra
 Añadir 10 mL. (g) de muestra a un recipiente que contiene 90 mL. del diluyente. Así se
.
 Pipetear 1 mL. (dil 10-1
) evitando la formación de espuma y transferir a un recipiente con
,10-4
B. MÉTODO
 Realizar diluciones decimales hasta 10-1
10-2
, 10-3
,10-4
.
 Sembrar 0,1 mL. de cada dilución en una placa Petri.
 Verter 15 mL. del medio OGA a 45 °C o 47 °C.

50
 Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
 Incubar a 25 °C +- 1 °C durante 5 días.
 Después de 5 días de incubación. Retener las placas que contengan un máximo
de 150 colonias, al nivel de dos diluciones sucesivas. Es necesario que al menos
una placa contenga un mínimo de 15 colonias.
 Las colonias de las levaduras son de color mates o brillantes, presentando
frecuentemente contorno regular y una superficie más o menos convexa.
 Los mohos aerobios mesófilos filamentosos se desarrollan por la germinación de
esporas o del crecimiento de fragmentos micelares.
a) PREPARACIÓN DEL MEDIO (Agar VRBA):
Hacemos el cálculo para el calcular el uso del agar OGA, para 3 diluciones
OGA Agua destilada
18,5 g _______ 500 mL.
X g _______ 40 mL. X = 1,48 g de OGA
b) PREPPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Se peso 10 g, de carne el cual se diluyo en 90 mL de diluyente en un matraz, obteniendo así la
dilución 10-1. Luego se pipeteo 1mL de la solución preparada y se transfirió a un tubo de
ensayo de 9 mL. de diluyente obteniendo así la dilución 10-2, finalmente se pipeteo
nuevamente 1 mL. de la dilución 10-2 a un segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL.
Figura N° 10: 1, 48 g. de OGA Figura N° 11: Agar OGA
Figura N° 12: Agar OGA
a punto de ebullir
Figura N° 9: Agar OGA
1mL.
_ 9mL.
10-2
1mL.
_ 9mL.
10-3
Figura N° 13:
Diluciones de
muestra de pastel
de maíz.
10-1
100 mL. de
solución

51
c) SIEMBRA POR PROFUNDIDAD DE MUESTRA DE PASTEL DE MAÍZ:
d) DETERMINACIÓN DE COLIFORMES EN PASTEL DE MAÍZ:
Luego de incubar por 48 horas a 37 °C escogemos la placa obtenemos varias colonias de
bacterias coliformes, también observamos el crecimientos de levaduras.
e) SIEMBRA EN PLACAS PETRIFILM:
1mL.1mL.
20 mL.
20 mL.
Figura N° 14: Siembra por
profundidad de muestras
de pastel de maíz con
OGA.
Figura N° 15: colonias de coliformes y 1 colonia rosada
no se observa la presencia de levaduras.
Figura N° 16: 2 colonias de levaduras de
aproximadamente 1 cm de radio y colonias de
bacterias coliformes
RESULTADOS
Se sembro en placas petrifilm muestra
Figura N° 17: Placas PETRIFILM Figura N° 18: Descubrimos las
Placas PETRIFILM.
Figura N° 19: Inoculación de muestra
en Placas PETRIFILM.

52
A. NTP
B. NORMAS INTERNACIONALES: Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA
67.04.50:08)
Tabla N° 10: Norma sanitaria que establece los criteriosmicrobiologicos decalidadsanitariae inocuidadpara los y productos de
panadería , pastelería, galletería y otros.
Tabla N° 11: Criterios microbiológicos de pan y productos de panadería y pastelería
Figura N° 20:
Siembra de
levaduras en Placas
PETRIFILM.

53
 Se aplicó la técnica de siembra por profundidad con una muestra de 10 g. de Pastel de maíz para
el recuento de hongos y levaduras con dos diluciones (10-1
, 10-2
) y siembra en placas petrifilm.
VII. CUESTIONARIO
1. Mencionar microorganismos no fúngicos que provocan la putrefacción del pan
2. Describa el papel de los principales componentes del pan en el envejecimiento de la miga
3. ¿Cuáles son los inhibidores empleados para prevenir el envejecimiento del pan?
4. Alteraciones que se presentan en los diferentes productos de panificación

54
VIII. BIBLIOGRAFÍA
o Navarro, A. (2009). FERMENTACIONETANOLICA - PAN. [online]
Fermentacionetanolica.wikispaces.com. Available at:
https://fermentacionetanolica.wikispaces.com/PAN [Accessed 8 Nov. 2017].
o Delgado González, F. and Caro Sánchez - Lafuente, A. (2013). Elaboración de productos de
panadería. 1st ed. Antequera, Málaga: Innovación y Cualificación, pp.111-120.
o Gil, A. (2012). Tratado de nutricion / Nutrition Treatise: Composicion Y Calidad Nutritiva De Los
Alimentos / Composition and Nutritional Quality of Foods (Spanish Edition). 2nd ed. Madrid:
Editorial Médica Panamericana, p.111.
IX. ANEXOS

55
PRACTICA N° 8
DETERMINACIÓN DE Clostridium perfringens EN ESPECIAS Y
CONDIMENTOS
I. OBJETIVOS
 Brindar conocimientos sobre el procedimiento para la determinación de microorganismos en
especias y condimentos.
II. INTRODUCCIÓN
La microbiota presente en las especias y condimentos varia dependiendo de la región en que se obtienen,
los métodos de recogida y los tratamientos pos-recogida (oscila entre 103
y 108
/g). Son frecuentes los
recuentos de microbiota aerobia mesófila de varios millones de ufc/g en pimienta blanca y negra,
jengibre, etc. Perteneciendo en gran parte esta carga microbiana a microbiota esporulada. Por ello las
especias y condimentos pueden cooperar en la alteración de los alimentos en los que se incorpora e
incluso contribuir a su participación en intoxicaciones alimentarias.
Clostridium perfringens es una bacteria anaeróbica (incapaz de crecer en la presencia de oxígeno), con
forma de bastón, Gram-positiva y formadora de esporas. Está distribuida ampliamente en el medio
ambiente y se encuentra frecuentemente en el intestino de los humanos así como también en el de varios
animales domésticos y salvajes. Sus esporas sobreviven en el suelo, en los sedimentos y en las áreas
sujetas a polución fecal tanto humana como animal.
MATERIAL
- Medio TSC (agar tristona sulfito cicloserina)

56
IV. PROCEDIMIENTO
A. PREPARACIÓNY DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS
 Comenzar el examen tan pronto como se disponga de la muestra
 Añadir 10 mL. (g) de muestra a un recipiente que contiene 90 mL. del diluyente. Así se
.
 Pipetear 1 mL. (dil 10-1
) evitando la formación de espuma y transferir a un recipiente con
,10-4
B. MÉTODO
10-2
y 10-3
.
 Pipetear 1 mL. de cada una de las diluciones por duplicado a placas estériles que contengan una
capa delgada de TSC (aproximadamente 5 mL.)
 Verter inmediatamente el agar fundido y templado a +- 45 °C y mezclar con movimientos suaves.
Dejar solidificar.
 Cubrir con una capa, adicionando nuevamente +- 5 mL. del agar empleado. Dejar solidificar.
 Colocar las placas en posición normal en una jarra de anaerobiosis.
 Incubar a 37 °C durante 20 a 24 horas.
 Seleccionar 5 colonias negras al agar y sembrarlas en caldo tioglicolato previamente
regenerado. Incubar en baño maría a 46 +- 0,1 °C por 3 a 4 horas.
 Realizar coloración de Gram (bastones cortos y gruesos, son Gram positivos aislados o
agrupados por pares o cadenas cortas).
 Realizar pruebas bioquímicas en medio tamponado nitrato-movilidad, medio lactosa-gelatina,
de este último realizar pruebas serológicas.
a) PREPARACIÓN DEL MEDIO (Agar TSC):
Hacemos el cálculo para el calcular el uso del agar TSC, para 3 diluciones
TSC Agua destilada
21 g _______ 500 mL.
X g _______ 60 mL. X = 2,52 g de TSC
Figura N° 22: 2,52 g. de TSC Figura N° 23: Agar TSC
Figura N° 24: Agar TSC a
punto de ebullir
Figura N° 21: Agar TSC

57
b) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA:
Se pesó 10 g, de pimienta el cual se diluyo en 90 mL de diluyente en un matraz, obteniendo así
la dilución 10-1
.Luego se pipeteo 1mL de la solución preparada y se transfirió a un tubo de ensayo
de 9 mL. de diluyente obteniendo así la dilución 10-2
, finalmente se pipeteo nuevamente 1 mL. de
la dilución 10-2
a un segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL formando así la dilución 10-3
.
c) SIEMBRA POR PROFUNDIDAD DE MUESTRA DE PASTEL DE MAÍZ:
d) DETERMINACIÓN DE Clostridium perfringens:
Luego de incubar por 48 horas a 37 °C escogemos la placa obtenemos, también observamos el
crecimiento de levaduras.
1mL.1mL.
20 mL.
20 mL.
20 mL.
Figura N° 26: Siembra
por profundidad de
muestras de pimienta
en TSC.
1mL.
Figura N° 27: 10-1
1mL.
_ 9mL.
10-2
1mL.
_ 9mL.
10-3
Figura N° 25:
Diluciones de
muestra de
pimienta.
10-1
100 mL. de
solución

58
RESULTADOS
Se realizó la siembra en agar TSC y se puso en una jarra de anaerobiosis para el crecimiento de
Clostridium perfringens, pero no se observo el crecimiento de la bacteria anaeróbica Gram-
positiva.
En la primera dilución se observa el crecimiento de otras bacteria pero no de Clostridium
perfringens, no se onserva colonias negras lon que nos daría una prueba positiva.
C. NTP
Tabla N° 12: Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para especias y
condimientos.
Figura N° 28: 10-2
Figura N° 29: 10-3

59
D. NORMAS INTERNACIONALES: Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA
67.04.50:08)
 Realizamos el procedimiento para la determinación de microorganismos en especias y
condimentos.
VII. CUESTIONARIO
1. ¿Qué es la Intoxicación Alimentaria?
2. ¿Cuáles son los síntomas de la intoxicación por alimentos?
3. Qué alimentos están asociados a la alteración por Clostridium perfringens.
4. Medidas de control para evitar brotes de intoxicación alimentaria
Tabla N° 13: Criterios microbiológicos de especias, hierbas, consomés y condimentos

60
5. Definir: toxinas, endotoxinas, neurotoxinas.
6. Microrganismos de Intoxicación Alimentaria
7. Microrganismos de Alimentos enlatados
8. Sulfito Reductores
VIII. BIBLIOGRAFÍA
o Kidshealth.org. (2017). Intoxicación por alimentos. [online] Available at:
http://kidshealth.org/es/parents/food-poisoning-esp.html [Accessed 13 Nov. 2017].
o Information, H., salud, I., digestivas, E., alimentos, I., alimentos, I., Center, T. and Health, N.
(2017). Intoxicaciones por alimentos | NIDDK. [online] National Institute of Diabetes and
Digestive and Kidney Diseases. Available at: https://www.niddk.nih.gov/health-
information/informacion-de-la-salud/enfermedades-digestivas/intoxicaciones-alimentos
[Accessed 13 Nov. 2017].
o Espanol.foodsafety.gov. (2017). Clostridium perfringens | FoodSafety.gov. [online] Available at:
https://espanol.foodsafety.gov/intoxicaci%C3%B3n/causas/bacteriasvirus/cperfringens/xfs/%C3
%ADndice.html [Accessed 14 Nov. 2017].

61
o Ausina Ruiz, V. and Moreno Guillén, S. (2006). Tratado SEIMC de enfermedades infecciosas y
microbiología clínica. 1st ed. Buenos Aires: Médica panamericana, p.474.
o Quintero, G. (2001). Infección en cirugía. 2nd ed. Bogotá: Editorial Médica Panamericana, pp.15-
16.
o Ingraham, J. and Ingraham, C. (2004). Introduction to microbiology. 2nd ed. Pacific Grove, Calif.:
Brooks/Cole, pp.567-568.
o Tortora, G., Funke, B. and Case, C. (2007). Microbiology. 9th ed. Madrid: Editorial Médica
Panamericana, pp.842-843.
o Sanchís Almenar, V. (1997). Prácticas microbiología de alimentos. 1st ed. [Lleida]: [Universitat de
Lleida],
pp.https://books.google.com.pe/books?id=Tq8nBgAAQBAJ&pg=PA47&dq=anaerobios+sulfito
+reductores&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwi-koaw-
7zXAhXD7SYKHVFfCtgQ6AEIOzAE#v=onepage&q=anaerobios%20sulfito%20reductores&f=fals
e.
o Pascual Anderson, M. (1989). Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y
Bebidas. 2nd ed. Madrid: Ministerio de Sanidad y Consumo,
pp.https://books.google.com.pe/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA74&dq=anaerobios+sulfito+r
eductores&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwi-koaw-
7zXAhXD7SYKHVFfCtgQ6AEIJDAA#v=onepage&q=anaerobios%20sulfito%20reductores&f=fals
e.
IX. ANEXOS

62
PRACTICA N° 9
NUMERACIÓN DE MICROORGANISMOS LIPOLÍTICOS
(PRODUCTOS GRASOS)
I. OBJETIVOS
 Realizar la numeración de Microorganismos Lipolíticos
II. INTRODUCCIÓN
La Lipólisis es la ruptura de los triglicéridos de la grasa láctea contenida en los glóbulos grasos. Las lipasas
son las enzimas responsables de la degradación de los triglicéridos a ácidos grasos liberados en la leche.
La cantidad de ácidos grasos libres totales (AGLT) es indicados de lipólisis y define sabores en la leche
que pueden ser deseables, aceptables o rechazables por el consumidor. Esta característica de la leche es
transferida al producto elaborado.
Modificaciones sugeridas por las grasas. Las bacterias lipolíticas son capaces de producir lipólisis y
acelerar a oxidación de estas sustancias. El enranciamiento de las grsas puede estar producidos por
especies liplíticas pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Achromobacter o por levaduras.
Mantequilla: Está formada por grasa de leche en una emulsión del tipo ¨agua en aceite¨. Manteniendo
alredor del 16 % de agua. La operación clave para producir mantequilla es, tras el desnatado, el batido

63
que conduce a la formación de una fracción grasa (la mantequilla) y de otra fracción no grasa (el suero
de mantequilla o mazada). Usualmente se bate nata madurada cuya acidificación favorece el batido y la
adquisición del aroma característico. En general, se aplica una pasteurización alta al producto, no sólo
para eliminar posibles patógenos sino también para destruir las lipasas. Tradicionalmente, las
mantequillas se salaban (2-3% de sal) para frenar la proliferación bacteriana y, debido al exceso de
producción en ciertas épocas, también se congelaban. La adición de sal contribuye a intensificar el sabor
y claramente aumenta su duración. Tradicionalmente, en ciertas regiones, se fabricaban mantequillas
dulces sin sal.
MATERIAL
- Baño María
- Medio agar tributirina
IV. PROCEDIMIENTO
A. MÉTODO
 Derretir la muestra antes del examen en un baño maría a 45 °C.
 Pesar antisépticamente 10 g. representativos de la muestra, adicionar 90 mL. del diluyente.
, 10-2
, 10-3
y 10-4
, calentados a 45°C.
 Sembrar 1 mL. de cada dilución en placa Petri por duplicado.
 Verter 15 mL. del medio agar tributirina a 45°C o 47°C.
 Mezclar el inóculo con el medio y dejar que solidifique.
 Incubar a 30°C +-1°C por 3-6 días.
 Contar las colonias de halo transparente en las placas que presentan entre 20 y 200
colonias.
a) PREPARACIÓN DEL MEDIO (Agar tributirina):
Hacemos el cálculo para el calcular el uso del agar tributirina, para 3 diluciones
Agar Agua destilada
tributirina
20 g _______ 500 mL.
X g _______ 60 mL. X = 2,4 g de Agar tributirina

64
b) PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: Se pesa 10 g, de mantequilla el cual se diluyo en 90 mL de
diluyente en un matraz, obteniendo asíla dilución 10-1
. Luego se pipeteo 1mL de la solución preparada
y se transfirió a un tubo de ensayo de 9 mL. de diluyente obteniendo así la dilución 10-2
, finalmente se
pipeteo nuevamente 1 mL. de la dilución 10-2
a un segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL
formando así la dilución de 10-3
.
c) SIEMBRA POR PROFUNDIDAD DE MUESTRA DE MANTEQUILLA:
1mL.1mL.
20 mL.
20 mL.
20 mL.
Figura N° 37: Siembra
por profundidad de
muestras de
mantequilla con
agar tributirina.
1mL.
1mL.
_ 9mL.
10-2
1mL.
_ 9mL.
10-3
Figura N° 36:
Diluciones de
muestra de
mantequilla.
10-1
100 mL. de
solución
Figura N° 34: 10 gramos de Mantequilla Figura N° 35: Dilución de la mantequilla

65
d) Conteo de colonias con halo transparente:
Luego de incubar por 48 horas a 37 °C escogemos la placa obtenemos, también observamos el
crecimiento de colonias con halo transparente.
RESULTADOS
Pudimos encontrar que experimentalmente para ver la presencia de microorganismos lipolíticos se utiliza
el agar tributirina. Este es un agar nutritivo suplementado con el triglicérido tributirina el cual sirve de
sustrato. El mismo forma una emulsión que aparece en el medio. Luego de la inoculación e incubación
mostró áreas claras alrededor de las colonias (lipólisis positiva), con esto podemos decir que el
microorganismo lipólíticos son capaces de secretar lipasas Observamos la presencia de 77 colonias en
nuestro conteo general en la dilución 10-1
ya que se encuentra dentro del rango de 20 a 200 colonias,
NMPmantequilla = 10*77
= 770 UFC/g
A. NTP
PRODUCTOS GRASOS: Mantequillas y margarinas
Agente microbiano Categoría Clase n c
Límite por g.
m M
Microorganismos lipolíticos 1 3 5 3 102
103
Mohos 2 3 5 2 10 102
Coliformes 3 3 5 3 10 102
Staphylococcus aureus 4 3 5 2 10 102
Tabla N° 14: Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para mantequillas y
margarinas
Figura N° 38: 10-1 Figura N° 39: 10-2
Figura N° 40: 10-3
Se observa en la dilución 10 -1
el
crecimiento de 77 colonias con halo
transparente.
el
transparente.
el
transparente.

66
B. NORMAS INTERNACIONALES: Reglamento Técnico Centroamericano (RTCA
67.04.50:08)
En la tabla vemos la presencia de Staphylococcus aureus pertenece al grupo de enzimas lipolíticas
bacterianas de la familia 1, así también como la Salmonella typhimurium que pertence a la Familia
de las enzimas lipolíticas bacterianas.
 Realizamos el conteo de microor5ganisos lipolíticos y encontramos 77 colonias en la primera
dilución,17 en la segunda dilución y 7 colonias en la tercera dilución, por tanto encontramos estos
microorganismos en la muestra de mantequilla , pero nuestro conteo final es la de 77 colonias ya
que se encuentra entre 20
VII. CUESTIONARIO
1. Describa las alteraciones de los productos grasos por microorganismos lipolíticos
2. Describa el modo de acción de las enzimas lipolíticos
Mantequilla y mantequilla con especias (grasa butírica)
Parámetro Categoría Tipo de riesgo Límite máximo
permitido
Salmonella ssp/25g 10
A
Ausencia
Staphylococcus aureus 7 102
UFC/g
Escherichia coli 5 < 3 NMP/g
Listeria monocytogenes/25g 10 Ausencia
Tabla N° 15: Criterios microbiológicos de Mantequilla y mantequilla con especias (grasa butírica)

67
3. Cómo podemos prevenir la contaminación de alimentos con microorganismos lipolíticos
VI. BIBLIOGRAFÍA
o Kidshealth.org. (2017). Intoxicación por alimentos. [online] Available at:
http://kidshealth.org/es/parents/food-poisoning-esp.html [Accessed 13 Nov. 2017].
o Pascual Anderson, M. and Calderón Pascual, V. (2010). Microbiología alimentaria. 2nd ed. España:
Díaz de Santos, p.222.
o Fbioyf.unr.edu.ar. (2017). Citar un sitio web - Cite This For Me. [online] Available at:
http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/112176/mod_resource/content/1/Alteraciones%

68
20de%20los%20Alimentos%20LIC%20QCA%20%5BModo%20de%20compatibilidad%5D.pdf
[Accessed 28 Nov. 2017].
VII. ANEXOS

Practicas de Microbiologia Alimentaria UNSA

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