1. 1
Kinetika enzimskih reakcijaKinetika enzimskih reakcija
Predavanja iz Kliničke enzimologije
Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska
biohemija
Školska 2014/2015. godina

2. 2
Enzimi kao katalizatoriEnzimi kao katalizatori
Definicija katalizatora
• Supstanca koja modifikuje i povećava brzinu odreñene hemijske
reakcije pri čemu se ona ne menja.
• Enzimi su proteinski katalizatori
• Uloga enzima u metabolizmu
• Senzitivni indikatori patoloških procesa
• Povećanje količine enzimskih molekula u cirkulaciji se meri na
osnovu njihove povećane katalitičke aktivnosti
• Kinetika enzimskih reakcija i katalitička aktivnost

3. 3
Kinetika enzimske reakcije i stvaranjeKinetika enzimske reakcije i stvaranje
kompleksa enzimkompleksa enzim--supstratsupstrat
Energija aktivacije kod reakcije sa i bez enzima
Esf energija aktivacije reakcije S → P bez katalizatora
Esf’ energija aktivacije u prisustvu katalizatora
∆Go promena u slobodnoj energiji za ovu reakciju
Enzim-supstratni kompleks
ES – molekul supstrata je vezan za
aktivni centar enzima
Vezivanje transformiše supstrat
u aktivno stanje
Energija transformacije je obezbeñena
slobodnom energijom vezivanja S za E.
Aktivacija bez dodatne spoljašnje energije
Energetska barijera reakcije je snižena
i ubrzana je razgradnja produkta.
ES se razgrañuje i nastaje produkt (P) i slobodan enzim
E + S ↔↔↔↔ ES →→→→ P + E

4. 4
Enzimska kinetikaEnzimska kinetika
• Teorijski sve enzimske reakcije su reverzibilne
– Praktično obično je reakcija u jednom pravcu brža
• Kinetika enzimske reakcije je važna za:
1. Metaboličke procese
– U biološkim procesima je niz enzimskih reakcija
– Nastali produkt je supstrat za sledeću enzimsku reakciju
2. Laboratorijska odreñivanja
– U laboratoriji kod odreñivanja aktivnosti enzima obično imamo
više povezanih enzimskih reakcija kako bi se odredila aktivnost
prvog enzima ili koncentracija inicijalnog supstrata u lancu
enzimskih reakcija
– Indikatorske reakcije – kinetika indikatorske reakcije ?
– Prva reakcija (merna reakcija ) je ograničavajuća

5. 5
Enzimska kinetikaEnzimska kinetika
• Merenje aktivnosti enzima - merenje brzine
enzimske reakcije
– Promena supstrata u jedinici vremena
– Promena produkta u jedinici vremena
-d[S] d[P]
dt dt
V = =

6. 6
Faktori koji utiFaktori koji utičču na brzinu enzimskiu na brzinu enzimski
katalizovanih reakcijakatalizovanih reakcija
• Koncentracija enzima
• Koncentracija supstrata
• pH
• Temperatura
• Prisustvo inhibitora, aktivatora, koenzima i
prostetičnih grupa

7. 7
Koncentracija enzimaKoncentracija enzima
Reactionvelocity
Enzyme concentration
Zavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije enzima pod
uslovom da je prisutan višak supstrata.
[S] >> [E], V ≈ [E]

8. 8
Koncentracija supstrataKoncentracija supstrata
S - supstrat reakcije
Ef - slobodan enzim
K1- konstanta asocijacije kompleksa
K-1 - konstanta disocijacije kompleksa
ES – kompleks enzim-supstrat
K2 - konstanta razgradnje ES na Ef i P
P- produkt reakcije
Šta je Michaelis-Mentenova jednačina ?
Matematička ekspresija stvaranja produkta reakcije pod eksperimentalnim uslovima
Michaelis – Menten-ova jednačina definiše
Zavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata
Različita je kinetika enzimske reakcije za reakcije:
A. sa jednim supstratom
B. sa dva supstrata
C. uzastopne enzimske reakcije

9. 9
Kinetika zasićenja supstratom
Stvaranje ES daje hiperbolu
X - Koncentracija supstrata
Y – Brzina enzimske reakcije
Inicijalna brzina enzimskih reakcija
v0= f [S]
Uslovi merenja enzimske aktivnosti:
•Koncentracija enzima konstantna
•Porast koncentracije supstrata
Michaelis – Mentenova kriva
Kinetika enzimske reakcije sa jednimKinetika enzimske reakcije sa jednim
supstratomsupstratom

10. 10
Enzimske reakcije sa jednim supstratomEnzimske reakcije sa jednim supstratom
Michaelis – Mentenova jednačina
1. Reakcija prvog reda
Brzina enzimske reakcije zavisi
od koncentracije supstrata (niske konc)
2. Mešovitog tipa
3. Nultog reda
Brzina reakcije ne zavisi od
koncentracije supstrata
Km Michaelis-Mentenova konstanta
Definicija:
Km je koncentracija supstrata pri kojoj se postiže polovina maksimalne brzine
Vmax – Maksimalna postignuta brzina enzimske reakcije.
[S]0
Vmax
V0
First order with
respect to [S]
Zero order with
respect to [S]
1. Reakcija prvog
reda
3.Reakcija nultog
reda
2.

11. 11
LineweaverLineweaver-- BurkBurk--ova krivaova kriva
Dvostruko reciproDvostruko reciproččna krivana kriva
Linearna transformacija hiperboleLinearna transformacija hiperbole

12. 12
IzraIzraččunavanje kinetiunavanje kinetiččkih konstanti enzimskihkih konstanti enzimskih
reakcijareakcija
• Software za izračunavanje Km i Vmax za enzime
• http//med.umich.edu/biochem/enzersources/software.ttm
• http://www.sigmaplot.com/products/sigmaplot/enzyme-mod.php
Upotreba Km
• Izbor optimalne koncentracije supstrata
• Za poreñenje vezivanja homolognih ili sličnih supstrata za jedan te
isti enzim
• Km služi za poreñenje svojstava sličnih enzima iz različitih izvora
• Izoenzimi odreñeni različitim genskim lokusima razlikuju se u Km

13. 13
Postavljanje metode za odreñivanje enzimaPostavljanje metode za odreñivanje enzima
Izbor optimalne koncentracije supstrata
Preduslov za postavljanje metode:
1. Ispitati odnos izmeñu brzine enzimske reakcije i koncentracije supstrata
u širokom opsegu
2. Odrediti Km
3. Ispitati inhibiciju supstratom pri visokim koncentracijama supstrata
• Nulti-red reakcije se održava, ako je supstrat u velikom višku
• Koncentracije najmanje 10 puta veće od Km ili od 10 do 100
• Kada je S = 10 X Km brzina enzimske reakcije je aproksimativno 91 % od
teorijske vrednosti Vmax.
• Red veličine za većinu enzima je za Km 10-5 do 10-3 mol/L
• Obično je optimalna koncentracija supstrata u opsegu od 0,001 do 0,10
mol/L.
• Optimalna koncentracija supstrata se ne može uvek primeniti zbog
– Ograničene rastvorljivosti supstrata
– Koncentracija supstrata inhibira aktivnost enzima neophodnog u drugoj
kuplovanoj reakciji

14. 14
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
Tipovi bisupstratnih reakcija
• Pseudo reakcije sa jednim supstratom
• Voda je drugi supstrat
A. Bisupstratne reakcije dehidrogenaza
• Bi-Bi sekvencione reakcije
• Redosled vezivanja supstrata
• ureñeni (ordered)
• neureñeni (random)
B. Bisupstratne reakcije aminotransferaza
Bi-Bi ping-pong mehanizam

15. 15
• Bi-Bi sekvencione reakcije
• Redosled vezivanja supstrata
• neureñeni (random)
• ureñeni (ordered)
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata

16. 16
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
• Bisupstratne reakcije dehidrogenaza
– Drugi supstrat je NADH ili NADPH
– Supstrati se vezuju za dva različita mesta na enzimskoj
molekuli
Km
1 i Km
2 su Km vrednosti za oba supstrata
S1 i S2 koncentracije supstrata
Ks
1 je ravnotežna konstanta za reverzibilnu reakciju izmeñu enzima i S1

17. 17
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
Bisupstratne reakcije dehidrogenazaBisupstratne reakcije dehidrogenaza
Eksperimentalno odreñivanje Km i Vmax
za svaki supstrat
Koncentracija S1 konstantna
(potpuno zasićenje)
Koncentracija S2 se varira i obrnuto
Km vrednosti su različite za dva supstrata
Primer
Reakcija laktat dehidrogenaze
Dva supstrata piruvat i NADH
Km za enzim iz goveñeg srca
Piruvat 2x10-5 mol/L
NADH 3X10-6 mol/LNagib prave i odsečak na
y-osi zavise od koncentracije drugog
Supstrata S2

18. 18
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
•Bisupstratne reakcije aminotransferaza
•Nema stvaranja tercijarnog kompleksa ES1S2
•Supstrati se vezuju za isto mesto na enzimskoj molekuli
•Prvo se vezuje supstrat S1 za enzim pa se oslobaña P1
•Zatim se vezuje S2 i onda se oslobaña P2
Linearizacija jednačine:
Bi-Bi ping-pong mehanizam

19. 19
BiBi--Bi pingBi ping--pong mehanizampong mehanizam

20. 20
Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata
Bisupstratne reakcije aminotransferazaBisupstratne reakcije aminotransferaza
• Ping-pong mehanizam
Varijacija S2 ne utiče na nagib prave
Menja se odsečak na y-osi i Vmax
kada koncentracija S2 varira
Eksperimentalno reakcioni uslovi
bisupstratnih reakcija se odreñuju tako
što se varira koncentracija prvog supstrata,
a koncentracija drugog se drži konstantna
sve dok se ne postigne maksimum aktivnosti
Proces se ponavlja sa varirajućim
koncentracijama drugog supstrata
Izbor koncentracije supstrata je limitirana
•Rastvorljivošću supstrata
•Viskozitetom rastvora
•Inicijalnom apsorbancijom koncentrovanog rastvora
•Relativnom cenom reagenasa

21. 21
Kinetika uzastopnih enzimskih reakcijaKinetika uzastopnih enzimskih reakcija
A. Metabolički procesi
B. Analitička enzimologija
Indikatorska reakcija
Odnos aktivnosti indikatorske i merne reakcije
varira meñu enzimima i zavisi od:
1. Opsega merenja aktivnosti
2. Km indikatorskog enzima
3. Lag faze - dužina vremenskog intervala
od početka merenja koja se prihvata
Vi
max i Ki
m za indikatorsku reakciju

22. 22
Efekat pHEfekat pH
pH optimumi
Većina enzima oko 7,0
Ekstremi
Pepsin 1,5
Alkalna fosfataza 10,5
pH kriva je zavisna od
1. Jonizacije supstrata
2. Stepena disocije a.k. u
bočnim lancima
Uticaj na trodimenzionalnu konformaciju
Denaturacija enzima pri ekstremnim pH
Izbor pufera
Dovoljan kapacitet da neutrališe
• efekat uzorka (seruma)
• stvorenih baza ili kiselina
Uticaj pKa pri izboru pufera
Maksimalni kapacitet pufera blizu pKa
Enzymaticactivity
1.0
2.0
1.5
0.5
2.0 10.08.04.0 6.0 pH
pepsin
trypsin

23. 23
Efekat temperature i optimalna temperaturaEfekat temperature i optimalna temperatura
Q10 relativne brzine enzimske reakcije na
dve temperature razlika za 10o C
Q10 od 1,7 do 2,5
Inicijalna brzina raste sa porastom t
Vreme potrebno za termostatiranje
Termalna inaktivacija i denaturacija
Temperatura inaktivacije 60-70oC
Gubitak tercijarne strukture
Uticaj na temp inaktivacije:
•supstrat i njegova koncentracija
•pH
•pufer i jonska jačina
•prisustvo drugih proteina iz seruma
stabiliše enzime
Čuvanje uzoraka
Amilaza stabilna na 220C (24 sata), kisela fosfataza nestabilna (u frižideru u kiseloj sredini
pH=6,0);
Alkalna fosfataza i efekat odmrzavanja; LD-5 (jetreni izoenzim - inaktivacija u frižideru
Preporuke IFCC
Analizatori na 37oC

24. 24
Efekat temperature na enzimsku reakcijuEfekat temperature na enzimsku reakciju

25. 25
Inhibitori i aktivatoriInhibitori i aktivatori
• Ligandi se vezuju za enzim i menjaju aktivnost enzima ali sami
se ne menjaju
• Modifikatori ili modulatori ili efektori
– Mali molekuli mogu biti i joni
– Deluju na sve enzimske reakcije
– Specifični za odreñenu reakciju
• Nespecifični inhibitori:
– Jake kiseline ili multivalentni anjoni i katjoni denaturišu i precipitiraju
enzime
– Oksidansi SH grupa dovode do inhibicije jer se redukovane SH
grupe nalaze u aktivnom centru enzima
• Aktivacija jonima Mg sa ATP

26. 26
Alosterna modifikacija enzimaAlosterna modifikacija enzima
Alosterno mesto; alosterni modulatoriAlosterno mesto; alosterni modulatori
Mesto aktivacije
Mesto inhibicije
K klasa menja Km
V klasa menja VmaxSigmoidalna kriva
Promena konformacije enzima i aktivnog mesta

27. 27
Inhibicija enzimske aktivnostiInhibicija enzimske aktivnosti
1. Reverzibilna inhibicija
– kompetitivna
– nekompetitivna
– akompetitivna
2. Ireverzibilna inhibicija
3. Inhibicija antitelima
• Reverzibilna inhibicija
E + I EI
– Ki konstantna inhibicije
– mera afiniteta inhibitora za enzim

28. 28
Kompetitivni inhibitor je strukturni analog
supstratu
•Inhibicija viškom supstrata
•Inhibicija bisupstratnih reakcija
•Inhibicija produktom
Primer alkalna fosfataza
1.Reverzibilna inhibicija
Kompetitivna inhibicija
+
S P
I
ES E+
+
EI
E
Km se povećava
Vmax se ne menja

29. 29
1. Reverzibilna inhibicija
Nekompetitivna inhibicija
Nekompetitivni inhibitor se strukturno razlikuje
od supstrata
Inhibitor se ne vezuje za supstrat vezujuće mesto
Km se ne menja
Vmax se redukuje
Tercijarni kompleks
+
S P
I
+
+
E
EI
I
+
S
+
E
ESI
ES

30. 30
1. Reverzibilna inhibicija
Akompetitivna inhibicija
Kombinacija inhibitora sa ES kompleksom
Najpre se vezuje prvi supstrat
a onda se gradi tercijarni komples
Bisupstratne reakcije
+
S P
+E
I
+
E
ESI
ES
Km se menja i Vmax se menja
Sniženje oba parametra
Paralelna kriva
1/[S]
1/V
No inhibitor
Uncompetitive
inhibitor
increase
-1/ Km
(1 + [I]/Ki
)/Vmax
1/Vmax
-1/ Km(1 + [I]/Ki)

31. 31
2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicija
Fiziološka inhibicija
•Tripsin sa tripsin-inhibitorom
•Ireverzibilna inhibicija proteolitičkog dejstva tripsina
Primer ireverzibilne inhibicije

32. 32
2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicija
TeTešški metali vezuju SH grupeki metali vezuju SH grupe
E
SH
SH
E
S
S
Hg
E
SH
SH
Cl
As
Cl
C
H
CHCl As C
H
CHClE
S
S
Hg2+
+ + 2H+
+ 2HCl+
Inhibicija enzima sa jodoacetamidom vezivanjem za SH grupe serinskog ostatka

33. 33
3. Inhibicija antitelima3. Inhibicija antitelima
• Antitela u principu ne inhibiraju enzimsku aktivnost
• Mogućnost inhibicije zbog
– Sternih smetnji antitela
– Konformacionih promena
Inhibicija aktivnosti enzimske molekule obeležene haptenom
kao rezultat kombinacije sa specifičnim antitelima je osnov
homogenog imunoenzimskog eseja EMIT

34. 34
Aktivacija enzimaAktivacija enzima
• Aktivatori povećavaju brzinu enzimske reakcije
• Metalni joni, koenzimi i prostetične grupe
1. Metalni joni
• Mehanizam dejstva metalnih jona na aktivaciju enzima:
– Metalni joni kao integralni delovi strukture enzima
• Zn u alkalnoj fosfatazi i karboksipeptidazi A
• Uloga metalnog jona
– Stabilizacija tercijerne i kvarternerne strukture
• Uklanjanje dvovalentnog katjona sa EDTA dovodi do konformacionih promena i inaktivacije
enzima
• Reaktivacija enzima dijalizom u rastvoru metala ili dodatak metalnog jona

35. 35
Aktivacija enzimaAktivacija enzima
• Vezivanje jona za enzim:
– čvrsto kao deo strukture enzima i ima dodatnu katalitičku aktivnost
– slabo vezivanje
– prolazno vezivanje za enzim ili supstrat
• Neophodnost dodavanja jona, ako postoji deficijencija
– efekat dodavanja jona može biti i inhibicija
• Primer
• kinaza – fosfo trasferaze Mg2+
• Amilaza - dodatak hloridnog anjona
Karboanhidraza

36. 36
Aktivacija enzimaAktivacija enzima
2. Koenzimi
– kompleksnije strukture nego aktivatori
– male molekule u odnosu na enzim i supstrat
– NAD i NADP
– vezani za enzim u toku enzimske reakcije

37. 37
Aktivacija enzimaAktivacija enzima
3. Prostetične grupe
– aktivni holoenzim kombinacija inaktivnog apoenzima i prostetične
grupe
– trajno vezani za enzim
– piridoksal-5’-fosfat (P-5’-P)