Este documento describe el procedimiento de tinción de Ziehl-Neelsen para detectar micobacterias ácido-resistentes como las que causan tuberculosis. La tinción involucra teñir las muestras con fucsina fenicada y calentarlas, luego descolorar con ácido y contrateñir con azul de metileno. Esto tiñe las micobacterias de rojo sobre un fondo azul claro, permitiendo su identificación microscópica.

1. COLORACIÓN BK

2. Principio
Las micobacterias absorben los colorantes sólo muy
lentamente debido a la elevada proporción de ceras y lípidos
en la pared celular.
Para acelerar la absorción del colorante fucsina y así la
formación del complejo micolactofucsina en la pared celular,
se calienta la solución de fucsina fenicada aplicada sobre el
preparado normalmente hasta formación de vapores.
Una vez las micobacterias han absorbido el colorante,
apenas lo ceden de nuevo a pesar del tratamiento intensivo
con solución decolorante, como p. ej. Ácido clorhídrico-
alcohol.
Las micobacterias son por ello denominadas como de tinción
sólida frente ácidos y alcoholes y aparecen en el preparado
microscópico teñidas de rojo, mientras que todos los
microorganismos no resistentes a los ácidos se tiñen de
acuerdo con la contratinción.

4. TUBERCULOSIS
CAUSADA POR
Mycobacterium bovis: ganado bovino y
el bisonte es su reservorio
Mycobacterium tuberculosis: hombre y
los primates son reservorios
Mycobacterium avium: aves, y los suinos
son reservorios

6. COSTITUYENTES
CELULARES
MICOBACTERIANOS
• Concentración lipídica elevada, de 20 –
40% del peso seco
• la pared celular contiene 60% de lípidos,
10% de péptido-glicósidos.(bacilos ácido-
resistentes)
• Los fosfolípidos pueden ser importantes
en la patogenicidad de la bacteria

8. • La pared celular es rica en ácido
micólico y otros lípidos complejos
(ácidos micósidos, glucolípidos) la
vuelven hidrófoba e impermeable a
colorantes acuosos en frío.
• En la tinción de Ziehl-Neelsen se aplica
calor.

10. • Ácidos micólicos:
- Retienen la carbol-fuscina después de
aplicar ácido-alcohol para decolorar
• Micósidos:
- Controlan la permeabilidad celular
(resistencia a enzimas hidrosolubles,
antibióticos y desinfectantes).
• Glucolípidos:
Causa toxicidad.

12. PATOGENESIS
• Vía Inhalación: Pulmones y ganglios
linfáticos traqueobronquiales
• Vía Ingestión: a través de los
ganglios mesentéricos y pared
intestinal al hígado por el sistema
portal.
• Los M.O. luego de los ganglios
alcanzan el conducto torácico
diseminándose a todo el cuerpo

14. • Se produce hipersensibilidad retardada
atribuible a la alta cantidad de antígeno
tubercular que destruye los tejidos.
• Los focos son microscópicos, otros
pueden progresar a la forma de
tubérculo.

15. TUBERCULOSIS EN PIEL: H-E.

16. MODO DE INFECCIÓN
• M. bovis:
• M.O. secreciones respiratorias,
heces,leche orina, semen, secreciones
genitales inhalación
• M. avium:
M.O. Heces ingestión (agua,
alimentos contaminados)
• M. tuberculosis:
M.O. Esputo gotitas infecciosas,
fomites

17. H-E.

18. PATOGENICIDAD
• M. bovis: Bovinos
cerdos, perros, caballos, ovinos (raro),
gatos susceptibles, hombre (leche).
• M. avium:
aves de corral, acuáticas, cerdo.
• M. tuberculosis:
hombre y primates, bovinos, cerdos,
loros.

19. ZIELH NIELSEN

20. DIAGNÓSTICO
• Directo:
improntas de lesiones teñidos con
coloraciones acidorresistentes (Z-N)
bacilos pequeños, rectos o ligeramente
curvos, rojos.
• Aislamiento y cultivo:
- agar Löwenstein-Jensen.
- agar yema de huevo incubar a 37°c hasta
por 8 semanas.

22. TRATAMIENTO
• Es posible que no sea factible
• Un medicamento útil:
Isoniacida + etambutol
+(estreptomicina) terapéutica triple

23. Aplicación
Examen microscópico de micobacterias.
Material
Frotis secados al aire y termofijados de material bacteriológico como esputos,
FNAB (biopsia por aspiración con aguja fina), líquidos de lavado, improntas,
efusiones, pus, exudados, cultivos líquidos y sólidos, cortes histológicos.
Preparación de las muestras
Esputo
El esputo debería ser tratado previamente con hipoclorito, que por vía oxidante
disuelve el material orgánico preservando en gran medida las micobacterias.
Mezclar 1 parte de la muestra (mín. 2 ml) en el tubo de centrífuga con 3
partes de una solución de hipoclorito al 15 % preparada con agua destilada,
dejar actuar bajo fuerte agitación durante 10 minutos.
Centrifugar 20 minutos a 3000 – 4800 rpm, decantar el líquido sobrenadante,
extender el sedimento y dejar secar.

24. Colonias de bacilos ácido-alcohol resistentes extracelulares en el
tejido necrótico. Ziehl-Nielsen 40X.

25. Líquidos extraídos por punción, lavados, sedimentos
Después de pasos adecuados de enriquecimiento, extender las muestras
sobre el portaobjetos y dejar secar al aire.
Cortes histológicos
Desparafinar en forma típica los cortes y rehidratar en la serie decreciente de
alcoholes.
Fijación
La fijación se efectúa sobre la llama del quemador Bunsen (2-3 veces
evitando un exceso de calor).
El material puede fijarse también 20 minutos a 100-110°C en una estufa o
sobre una placa calefactora.
Reactivos
kit de tinción
Contenido:
Solución 1 de fucsina fenicada 500 ml.
Solución 2, Ácido clorhídrico-alcohol 500 ml. (2x)
Solución 3, de azul de metileno 500 ml.

26. Soluciones separadas
Fucsina fenicada en solución según Ziehl-Neelsen
100 ml, 500 ml, 2,5 l
Azul de metileno en solución según Löffler
100 ml, 500 ml, 2,5 l
Ácido clorhídrico-alcohol 1 l, 2,5 l
Técnica
Banco de tinción
1. Recubrir los preparados completamente con fucsina fenicada en solución.
Calentar cuidadosamente con el quemador Bunsen 3 veces desde abajo hasta
formación de vapores y teñir en total durante 5 minutos.
La solución de tinción no debe hervir.
2. Lavar con agua corriente del grifo hasta que ya no se desprendan
nubes coloreadas.
3. Cubrir los preparados completamente con acido clorhídrico-alcohol y dejar
actuar durante 15 - 30 segundos en función del espesor del material.
4. Enjuagar inmediatamente después con agua corriente del grifo.
5. Contratinción durante 30 segundos con solución de azul de metileno o durante
1 minuto con solución de azul de metileno diluida (dilución 1:10 (1 + 9) con
agua destilada)
6. Enjuagar cuidadosamente con agua corriente del grifo.

27. Colonias de bacilos BAAR. Ziehl-Nielsen 100X.

28. 7. Secar los preparados y si es necesario montar.
Resultado
Micobacterias rojo
Fondo azul claro

29. TUBERCULOSIS PULMONAR
Koch denominó "bacilo tuberculoso" al germen por él descubierto;
calificándolo solo por uno de los productos posibles de la tisis: el granuloma
o tubérculo. Luego, quizás hubiese resultado más conveniente utilizar un
término botánico, en cierto modo desligado de dicho producto posible, ya
que no en todos los casos de la enfermedad se desarrollan granulomas o
tubérculos.
Tuberculosis primaria.
Infección de un individuo sin un contacto previo con el germen.
Patogenesis.
Los bacilos humanos habitualmente son transmitidos por inhalación de
gotas de saliva. Ellas son eliminadas por un paciente con una lesión de tipo
abierta (foco en comunicación con la vía aérea). Así, los bacilos permanecen
viables en partículas de saliva húmeda por meses y en partículas secas por
semanas. Finalmente, la mayoría de las infecciones se adquieren por una
exposición mantenida al germen y no por contactos casuales.

30. Tuberculosis pulmonar secundaria o tuberculosis pulmonar progresiva del
adulto.
La tuberculosis pulmonar del adulto se caracteriza por una destrucción
notable y progresiva del tejido pulmonar.
Desde el punto de vista de la patogénesis de la tuberculosis pulmonar
progresiva del adulto cabe hacerse dos preguntas: origen de los bacilos y
sitio anatómico inicial.
Una alternativa referente al origen de los bacilos es que el proceso se inicie
por la reactivación de un foco preexistente en el pulmón (reinfección u origen
endógeno). La segunda es que el germen provenga del exterior como una
nueva infección, en forma completamente independiente de la lesiones
anteriores (superinfección).
En la mayor parte de los casos de tuberculosis pulmonar progresiva es
posible encontrar la lesión primaria inalterada, con un proceso cicatricial
completo, incluyendo osificación.

31. Evaluación
Un hallazgo positivo significa “presencia de bacilos ácidorresistentes” y un
hallazgo negativo significa “ausencia de bacilos ácidorresistentes”. No se
puede diferenciar si se trata de micobacterias de la tuberculosis o de otras
micobacterias, tampoco resulta posible verificar si se trata de bacterias
activas o muertas.
Preparación de las muestras
Todas las muestras deben tratarse de acuerdo con el estado de la tecnología.
Todas las muestras deben estar rotuladas inequívocamente.
Deben usarse instrumentos adecuados para la toma de muestras y para la
preparación, y deben seguirse las instrucciones precisas sobre bioseguridad.
Almacenamiento
El kit de tinción y las soluciones de tinción deben almacenarse entre +15°C y
+25°C. Después de abrir el frasco por primera vez, el reactivo almacenado
entre +15°C y +25°C es estable hasta la fecha de caducidad indicada.
Estabilidad
Las soluciones deben utilizarse hasta máximo la fecha de caducidad. Los
frascos deben mantenerse siempre bien cerrados.

32. Bacilos BAAR aislados en el tejido necrótico.
Coloración de Ziehl-Nielsen 100X.