Producción proteínas recombinantes bacterias levaduras
1. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA
BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Canchola Carrillo Eileen
Muñoz Herrera David
Nava Pintor Edgar Ezequiel
Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2
Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014
.
5. Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción
de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal
manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales
mejoradas o corregir defectos genéticos
•Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de
trascripción y traducción en posiciones adecuadas.
•Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que
codifica la proteína también presenta las secuencias.
7. • Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería
al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición
actual se refiere también a los productos.
El consumo de la bebida aumentó
al transcurrir los siglos; se tuvieron
que desarrollar métodos que
permitieran obtener grandes
volúmenes.
17. MUTACIÓN
Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.
Puede o no producir un cambio observable en el individuo.
Se presenta súbita y espontáneamente.
10-10 mutaciones por generación por gen
20. MUTAGÉNESIS INDUCIDA
Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis,
seguido de una detección y selección apropiadas de los
sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el
mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.
22. • La tecnología de DNA recombinante ha permitido que
secuencias específicas de ADN sean transferidas de un
organismo a otro.
• Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un
producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las
rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos
específicos en la ruta metabólica.
• Dado que no hay restricción para el origen de los genes que
expresa un microorganismo, la producción de proteínas de
origen animal y vegetal se ha hecho posible
23. • La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA
fuera de la célula.
1. Aislamiento y recuperación del gen de interés.
• Regulación de su expresión.
2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un
vector de fácil manipulación.
4. Reproducción.
25. Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un
vector que se replica autónomamente en el microorganismo
hospedero y actúa como un transportador del segmento de
DNA exógeno insertado.
26. PLÁSMIDOS
• Características
• Origen de replicación
• Gen de resistencia a
antibióticos
• Comúnmente el DNA
exógeno y el plásmido
son cortados con la
misma enzima de
restricción.
• El plásmido recombinante
se introduce por
Transformación
27. La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se
puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a
la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.
30. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
Detección y Selección de clones Recombinantes
PCR y Bases de Datos
Expresión de los Genes clonados
Recuperación y Purificación de Proteínas
37. ALTOS NIVELES DE
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
• Factores genéticos.
Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor
empleado, cepa utilizada
• Factores fisiológicos.
Componentes del medio de cultivo, estrategias de
cultivo, parámetro en el fermentador.
38. RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
• Acumulación de proteína en citoplasma
*Lisis de la célula
*Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión.
• Acumulación de proteínas en el espacio
periplasmático.
*Choque osmótico
39. *Separar por centrifugación
O filtración.
** remoción de ácido nucleicos
mediante agentes policatiónicos
*** precipitación de la proteína
con sale s o resinas de integración
hidrofóbica
**** purificación final por métodos
cromatográficos.
41. PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)
• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en
una mayor proporción en el cuarto estómago de los
rumiantes lactantes.
42. RENNINA
• Se libera como PREPROQUIMOSINA
PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA
PRO 27 aa QUIMOSINA
QUIMOSINA
46. QUIMOSINA
RECOMBINANTE
• Fusión al extremo N-
terminal de LacZ o TrpE
• La secuencia de la
proquimosina se insertó
nmediatamente después
del RBS y el codón ATG
53. CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3
SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL
VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.
57. GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y
ACETILACIÓN DE HBSAG
Humano
• N-Glucosilado
• Exportado hacia la
membrana vía Golgi
• Plegamiento en
partículas de 22 nm
• Acetilado
Levadura
• No glucosilado
• Se acumula en el
citoplasma
• Plegamiento en
partículas de 22 nm
• Una fracción se acetila
60. PROTEÍNAS
RECOMBINANTES: USO
TERAPÉUTICO
•Factor de necrosis tisular-α
Anticuerpos
•Interferones, Interleucinas , TNFCáncer y infecciones
virales
•Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador
de plasminógeno tisular
Enfermedades
cardiovasculares
•Insulina, Hormona del crecimiento
Hormonas
•Endorfinas, NeuropéptidosEnfermedades
Neurológicas
•Hepatitis-B
Vacunas
•Factor de crecimiento epidermico, de
fibroblastos y factor VIII de la coagulación
Cicatrizantes y factores
de coagulación
72. REFERENCIAS
• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient
recombinant protein production and secretion from nuclear
transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of
Biotechnology 167 (2013) 101-110.
• Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva
cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A,
Barcelona, España. pp 227-229.
• Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999,
5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504.
• Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology.
Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición.
Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.
73. REFERENCIAS
• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction.
Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177.
• Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S.
Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M.
Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically
active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae.
GENE 24: 1-14
• J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R.
Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of
Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic
Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485
(1987) doi:10.1038/nbt0587-479